Veia Interposição Modelo: Um modelo adequado para estudar Bypass Graft Perviedade

Resumo

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Resumo

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introdução

doenças das artérias coronárias e suas complicações estão entre as principais causas de morte em todo o mundo. estratégias terapêuticas atuais concentrar em restabelecer o fluxo de sangue, seja através da dilatação do vaso estreitados ou através da criação de um bypass. Revascularização do miocárdio (RM) utilizando enxertos venosos foi descrita pela primeira vez em 1968 e tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos. Para além da revascularização da artéria descendente anterior coronária, condutas de veia safena são mais comumente usados ^1. No entanto, enxerto permeabilidade continua a ser o calcanhar de Aquiles da veia safena (SVG). Um ano após a cirurgia, enxerto de permeabilidade é de 85%, caindo para 61% após dez anos ^2,3. Revelando os mecanismos fisiopatológicos e as causas da perda de permeabilidade SVG é, portanto, uma tarefa importante.

Este vídeo demonstra um modelo de interposição da veia de ratos para investigar a perda de enxerto de veia. Os objetivos gerais deste método são para explorar a pathobiological subjacentee processos -physiological durante a progressão da doença e desenvolver um modelo adequado para drogas ou testes opção terapêutica. Transplantando a veia epigástrica superficial no sistema arterial, este modelo imita de perto a situação clínica de revascularização do miocárdio. O trauma cirúrgico, isquemia e estresse da parede são gatilhos importantes de alterações vasculares patológicos e são imitadas no modelo descrito.

Diferentes modelos e espécies estão disponíveis para investigar a perda de permeabilidade do enxerto venoso. Grandes modelos animais, como porcos, ovelhas ^{4 5 6,} cães e macacos ^7, assemelham-se vaso humano e estruturas anatômicas e, assim, permitir estratégias terapêuticas complexas, como implante de stent de bypass ou novas técnicas cirúrgicas, a serem testadas ^8. No entanto, especial habitação, equipamento e pessoal são necessários. Além disso, custos elevados e à necessidade de um anestesista adicional durante a cirurgia impedem a sua aplicação mais ampla. Smtodos os animais, incluindo ratos, são fáceis de manusear, não necessitam de alojamento especial, e têm custos controláveis. Em comparação com os modelos de rato ^9,10, modelos de ratos têm a vantagem de uma melhor operacionalidade e, portanto, menor variabilidade no resultado. Os ratos são fisiológica e geneticamente mais semelhantes aos seres humanos do que os ratos ^11,12. Além disso, a maioria dos camundongos selvagens só desenvolver myointima limitada ^13, que fazem modelos de ratos propensos a erros do tipo II. A histologia das veias principais do rato, tal como a veia cava inferior, consiste apenas de algumas camadas de células e torna difícil a avaliação precoce ^13. Uma outra desvantagem é a pequena quantidade de tecido disponível para análises subsequentes após a recuperação do enxerto.

O modelo descrito neste vídeo é reprodutível, de baixo custo, e fácil de realizar, e pode ser estabelecida rapidamente e de forma fiável. É especialmente apropriado para a avaliação de agentes terapêuticos experimentais caros, tais como vectores viraispara terapia génica, de uma forma económica.

Protocolo

Os animais receberam cuidado humano de acordo com o Guia para os Princípios de Animais de Laboratório, preparados pelo Instituto de Recursos Animais de laboratório e publicado pelo National Institutes of Health. Todos os protocolos com animais foram aprovados pela autoridade local responsável ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Departamento da Saúde e Defesa do Consumidor) Hamburg").

1. Animal Care

1. Obter ratos ratos Lewis (LEW / CRL) e Rosa / ratos transgênicos luciferase-LEW pesando 300-350 g do Instituto de Animais de Laboratório.
2. Manter os ratos sob condições convencionais em armários ventilados e alimentá-los ração e água ad libitum autoclavado.
3. Executar um transplante de enxerto utilizando os / luciferase-LEW ratos transgênicos ROSA como os doadores e os singênicos ratos LEW / CRL como os destinatários.

2. Preparação do animal doador

1. Use um indutocâmara de ionização para anestesiar um rato com isoflurano (2,5-3%).
2. Colocar o rato na sua parte de trás e manter a anestesia com uma máscara que cobre o nariz e a boca. Verifique se há profundidade suficiente de anestesia por beliscar as patas traseiras e verificar a ausência de reflexos. Aplique um pouco de pomada veterinário para os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
3. Espalhe as pernas traseiras e fixar sua posição usando fita.
4. Raspar o cabelo inguinal com um aparador de pêlos e desinfectar a área inteira usando iodopovidona seguido por 80% de etanol. Repita o passo desinfecção duas vezes.
   NOTA: A área cirúrgica, gazes e instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados. Manter um campo esterilizado durante todo o procedimento e desgaste de uso único, luvas cirúrgicas estéreis, máscaras e bonés.
5. Sob um microscópio, realizar uma incisão vertical ao longo das inguinalis linea. Use duas pinças para separar delicadamente os tecidos subcutâneos e expor a veia epigástrica superficial de sua origin na veia femoral. Cuidadosamente isolar a veia epigástrica superficial dos tecidos circundantes.
6. Parar o fluxo de sangue na veia epigástrica superficial usando dois micro grampos.
7. Colheita um segmento de cerca de 0,5 a 1 cm da veia levantando cuidadosamente da veia isolado com uma pinça e o corte através do vaso com microtesouras. Deixar as micro grampos sobre o coto recipiente para evitar a perda de sangue. Coloque o pedaço removido da veia em gaze estéril. Cuidadosamente colocar uma agulha 30 G de uma extremidade interior da veia colhida e lavar o reactor com heparina (50 unidades / ml).
   NOTA: Pega a veia com cuidado e evitar danos durante a elevação, corte e descarga. Certifique-se de lavar o enxerto com a quantidade adequada de heparina.
8. Manter o segmento do vaso de lidocaína a 1% em gelo até que o transplante para o receptor de rato para prevenir um espasmo navio.
9. Eutanásia do rato doador, aumentando a anestesia com isoflurano a 5%. Depois de 2-3 min, open abdômen ao longo da linha alba, cortar através do diafragma, e remover o coração parar circulação.

3. Preparação do Rato Destinatário

1. Anestesiar ratos e fixar o recipiente da mesma maneira como o rato dador.
2. Raspar o lado medial das pernas com um aparador de pêlos e desinfectar três vezes usando iodopovidona e 80% de etanol.
3. Monitorar a profundidade da anestesia e garantir que ele é suficiente, verificando a ausência de reflexos quando beliscar as patas traseiras.
4. Realizar uma incisão femoral médio do joelho até a dobra inguinal. Sob um microscópio, utilizar 2 pinça para separar a artéria femoral a partir dos seus arredores.
5. Use micro grampos para parar o fluxo de sangue. Coloque a braçadeira proximal em primeiro lugar, seguido pela pinça distal.
6. Corte um pequeno segmento da artéria femoral apertada com microtesoura e descartá-lo. Encurtar o coto arterial restante com microtesoura, criando uma lacuna que é1-2 mm maior do que o enxerto de veia. Lave o coto arterial com heparina usando uma agulha 30 G.
   NOTA: Se a adventícia sai ligeiramente para além do coto embarcação, utilize uma pinça para puxá-lo um pouco sobre a extremidade do navio e retirar um pedaço.
7. Coloque a veia colhida a partir do passo 2.8 entre os cotos arteriais e ajustar o comprimento de modo que ele se encaixa adequadamente na abertura. Note-se a direcção da veia.
8. Realização da anastomose proximal primeiro usando uma sutura 10-0 prolene. Realizar pontos individuais na ordem mostrada (Figura 1D). Comece com uma sutura em cada lado lateral antes de adicionar mais três suturas no lado ventral. Em seguida, colocam três pontos no lado dorsal do vaso para completar a anastomose.
9. Ligar os vasos distais, com o enxerto utilizando a mesma técnica para a anastomose proximal descrito no passo 3.8. Mais uma vez, comece com uma sutura em cada lado lateral, e em seguida, coloque três suturas na sid ventralE e o lado dorsal.
10. Carregar duas seringas de 1 ml com componente de cola de fibrina 1 e 2. Levante cuidadosamente o enxerto com uma pinça e soltar cerca de 100 mL de componente cola de fibrina 1 sob o enxerto, seguida pela componente 2.
    NOTA: Certifique-se de que os componentes 1 e 2 são aplicados na proporção de 1: 1.
11. Coloque o enxerto na sua posição para trás e soltar um adicional de 100 ul de componentes 1 e 2 em cima do enxerto. Certifique-se de que a cola abrange tanto o enxerto e anastomose, a fim de evitar a insuficiência da anastomose e sobre-distensão do enxerto de veia.
12. abrir a pinça distai cuidadosamente, seguido pela proximal.
13. Confirmar uma cirurgia bem-sucedida verificando o pulso visível na veia transplantada e artéria distal do enxerto.
14. Remover a colagem excessiva, o que impede o fechamento da pele. Utilize uma pinça para levantar a cola curada e remover o excesso com microtesouras. Feche as camadas da pele com 5-0 prolene.
15. Injetar 4-5 mg / kg carprofeno via subcutânea antes de permitir que o rato para acordar. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Manter o animal em uma única gaiola até que esteja totalmente recuperado.
16. Adicionar Metamizolo à água de beber (50 mg Metamizolo por 100 ml) na forma de medicação para a dor para os 3 dias seguintes e monitorar o animal diariamente.

4. Duplex ultra-sonografia

NOTA: Use sonografia duxplex para visualizar o fluxo sanguíneo não invasivo em ratos ^14.

1. Anestesiar uma ratazana numa câmara de indução (isoflurano a 2%). Coloque o rato sobre as suas costas e manter a anestesia com uma máscara cobrindo o nariz.
2. Use cortadores de cabelo e creme de depilação para remover os pêlos ao redor da área da coxa.
3. Aplique o gel de ultra-som na coxa. Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Adquirir imagens ultra-sonografia duplex usando um MS 400 transdutor (frequência central: 30 MHz) com uma taxa de quadros de 230-400 frames / seg.

5. O exame histopatológico

NOTA: Colheita e manchar o navio com coloração de Masson para análises morfométricas ^15.

1. Corrigir o vaso colhida em 4% de paraformaldeído durante a noite e desidratar em concentrações crescentes de etanol. Incorporar a amostra em parafina e corte-o em 5 mm fatias grossas usando um micrótomo.
   NOTA: O paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseada com cuidado especial.
2. Desparafinar os slides antes da coloração-los com tricromo solução de coloração. Desidratar as lâminas coradas, limpá-las com xileno, e montá-los no meio de montagem. Depois de secar os slides, ver as amostras com um microscópio.

6. A bioluminescência Imagem (BLI)

NOTA: O enxerto pós-operatória foi monitorado ao longo do tempo in vivo através da medição do sinal bioluminescente ¹6.

1. Dissolve-se 1 g de sal de potássio de D-luciferina em 22 ml de PBS e injectada por via intraperitoneal em ratos (375 mg / kg de peso corporal). Esperar 15 min para a luciferina a circular no animal.
2. Colocar o rato dentro de um sistema bioluminescente quantificação em tempo real e aceder ao sinal de bioluminescência.

Resultados

O modelo de interposição da veia rato é adequada para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointima e fracasso do enxerto venoso. Animais recuperar bem da cirurgia e mostrar excelente condição física pós-operação. A Figura 1 mostra os passos chave cirúrgicos. Após a incisão na pele ao longo das inguinalis linea, a veia superficial epigástrica e artéria femoral são identificados (Figura 1A). Colheita do enxerto deve ser realizada com cuidado, sem danificar o enxerto <...

Discussão

Este vídeo demonstra um modelo de interposição da veia de ratos para investigar a perda de enxerto de veia e para permitir a exploração dos processos patológicos subjacentes e teste de novas drogas ou opções terapêuticas.

A anestesia é um aspecto crucial de procedimentos cirúrgicos. Um sistema de anestesia por inalação contínua é recomendado, pois este é um método seguro e fácil, especialmente durante operações prolongadas. Isto pode ser de grande importância durante a f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment