Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Resumo

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Resumo

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introdução

A via de sinalização Notch de mamífero é homóloga da mesma via em Drosophila melanogaster e consiste de quatro receptores transmembrana entalhe (Notch1-4) e cinco ligandos ligados à membrana do entalhado (JAG1 & JAG2) e semelhante a delta (DLL1, 3, & 4) famílias ^1. Sinalização Notch é iniciado quando o receptor Notch em uma célula receptora é obrigado pelo ligando em uma célula de transmissão ^2. Durante este trans-activação, o ligando ligado à membrana Notch produz uma força de estiramento sobre o receptor de Notch ligada a membrana ^{3, 4.} A força de estiramento do ligando de ligação induz alterações conformacionais no receptor de Notch que facilitam a clivagem extracelular do receptor por TNFalfa enzima de conversão (TACE), seguido por um evento de clivagem intracelular mediada por um complexo de gama-secretase (γ-secretase) contendo presenilina. γ-secretase libera o int Notchdomínio racellular (NICD), que transloca para o núcleo, onde forma um complexo de activação da transcrição com CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), idealizador-like (MAML), e fatores específicos do tipo de célula para conduzir a expressão de alvejar genes ^5.

Os elementos mecânicos de resultado de activação de sinalização Notch na necessidade de métodos exclusivos da activação da via de Notch in vitro. Notch ligandos solúveis podem ligar-se a receptores de Notch, mas não conseguem produzir forças de estiramento necessárias para a libertação de NICD enquanto ao mesmo tempo inibir competitivamente a ligação de ligandos de entalhe associada a células. Assim, a adição de ligantes Notch solúvel para o meio de cultura pode atenuar Notch normal de sinalização ^{6, 7.} Felizmente, os ligandos de Notch pode induzir a libertação de NICD se eles são fixados a um substrato apropriadamente rígida ^{5, 8, 9,10.} Sementeira em células de cultura de substratos revestidos com ligando ou a aplicação de contas revestidas com ligando às células pode tanto activar a sinalização de Notch, e a escolha entre elas depende primeiramente do tempo desejado de estimulação de Notch. Para a activação de sinalização de Notch imediato e temporário, tal como seria desejado durante o ponto médio de um ensaio funcional ou diferenciação, ligando de Notch pode ser ligado a esferas de agarose, aplicados a células de cultura, e lavou-se a qualquer momento. Para mais sinalização Notch sustentada a partir do início de um período de cultura, placas de cultura de tecidos podem ser revestidos com ligando antes da sementeira celular.

Para os efeitos do presente protocolo, os métodos são realizados utilizando precursores de osteoclastos de rato, mas os métodos e variações sobre os métodos aqui descritos são aplicáveis a uma ampla variedade de tipos de células ^{6, 11, 12, 13, 14.} Os osteoclastos são células terminalmente diferenciadas que linage hematopoiéticos são responsáveis pela reabsorção de tecido ósseo, e eles estão implicados em vários distúrbios de perda de osso ^15. Assim, no estudo in vitro da diferenciação de osteoclastos a partir dos seus precursores de monócitos / macrófagos de linhagem e os mecanismos moleculares que controlam a sua função é essencial para uma melhor compreensão dos osteoclastos e desenvolvimento de novas terapias de regeneração de osso. Enquanto ele é agora geralmente aceite que a sinalização Notch desempenha um papel positivo na diferenciação e função dos osteoclastos, as variações tanto da estimulação sinalização Notch e osteoclastos cultura precursor e diferenciação conduziu a resultados contraditórios inicialmente ^{16, 17, 18, 19.} Um exame mais detalhado das diferenças de métodos e utilização de genéticamodelos têm muito esclarecido o papel da sinalização Notch na osteoclastogênese, mas a aplicação de métodos de estimulação Notch e cultura padronizados poderia evitar tais controvérsias em estudos futuros de sinalização Notch em outros tipos de células ^{20, 21, 22, 23.}

Existem vários métodos para a cultura de precursores e de diferenciação de osteoclastos de rato, e, como com os métodos diferentes para estimular a sinalização de Notch, o melhor método irá depender da questão experimental. Aqui, será apresentado o nosso método preferido de cultura frações aderentes e não aderentes de células de medula liberadas a partir de ossos longos de rato. Este método tem a vantagem de exigir essencialmente nenhum equipamento especializado e a produção de células que são aplicáveis ​​a uma variedade de métodos de diferenciação.

Protocolo

Toda a investigação que envolva animais vertebrados foi realizada de acordo com protocolos aprovados pela Universidade da Pensilvânia Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Meios de Cultura Preparação

1. Prepare α-MEM por dissolução médio (MEM) em pó essencial mínimo e 1,9 g de bicarbonato de sódio em 900 ml de H ₂ O e completar com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 mL de calor de soro bovino fetal inactivado. Esterilizar usando um filtro de 0,22? M de polietersulfona (PES).
2. Prepare meio de macrófagos, completando α-MEM com 35 ng / ml recombinante rato macrófagos fator estimulante de colônias (M-CSF)
3. Prepare meio de osteoclastos, completando meio de macrófagos com 100 RANKL ng / ml

2. isolamento de células de medula óssea

1. Encha uma seringa de 10 ml com uma agulha de calibre 25⅝ per rato com 10 ml α-MEM.
2. Eutanásia ratos através de 10 minutos de exposição ao CO ₂ a um caudal de 1,3 L / min. Certifique-se de morte do animal, seguindo CO ₂ exposição com deslocamento cervical antes de prosseguir com dissecção.
3. Utilizando uma técnica limpa, dissecar e separar o tíbias e fêmures. Desinfectar pele de ratinho com 70% de etanol antes de fazer uma incisão ao longo da superfície anterior de cada membro posterior para expor a tíbia e o fémur.
   1. Corte através da articulação do joelho para libertar a extremidade distal do fêmur, e cortou o fêmur o mais próximo possível da pélvis quanto possível. Remover o fêmur e limpar o máximo de tecido mole quanto possível. Para remover a tíbia, cortar através do tornozelo e remover a maior quantidade de tecido macio como possível.
4. Segure o osso com uma pinça e medulas nivelada em um tubo de 15 ml com 2,5 ml de temperatura ambiente α-MEM combinando ondas de medula a partir de um único rato em um único tubo.
   NOTA: Um rubor medula sucesso vai mudar a coloração de tele óssea do vermelho ao bege.
5. Deixar detritos se depositam no fundo do tubo e transferir o sobrenadante para um limpas tubo de 15 ml cuidando para evitar a transferência de quaisquer detritos.
   NOTA: Algumas células também podem se contentar com os restos da medula. Se for necessário um maior número de células, ondas de medula pode ser filtrada através de um filtro de células de 70 ^ M para um tubo limpo de 15 ml.
6. tubo de centrífuga (s) a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar as células.
7. Aspirador de aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 0,5 mL de amónio-cloro e potássio (ACK) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 3 minutos para lisar as células vermelhas do sangue.
8. Adicionar 10 ml de PBS directamente para ACK-célula de solução, e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
   Nota: Os sedimentos de células previamente vermelha agora deve ser bege.
9. Aspirador de aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml α-MEM, e a placa numa placa tratada de cultura de tecido de 100 milímetros. Incubar as células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera humidificadaincubador de cultura de tecido.
   NOTA: contagem de células não é necessário para este passo. Durante este tempo, as células aderentes da medula óssea irá aderir à superfície da cultura; populações de células de medula óssea não aderentes irá permanecer em suspensão. MCSF não está presente no meio de cultura durante esta incubação inicial.

3. O enriquecimento de osteoclastos Precursores

1. Após incubação durante a noite das ondas de medula, sobrenadante da cultura contendo a transferência de células não-aderentes para um tubo de 50 ml.
   NOTA: As placas de cultura com as células aderentes, as quais incluem as células progenitoras mesenquimais da medula óssea, podem ser descartados ou alimentados com fresco α-MEM, se desejado para outras experiências.
   NOTA: Os osteoclastos podem ser diferenciadas directamente a partir destas células de medula óssea não aderentes por plaqueamento em tecidos tratados com pratos de cultura a uma densidade de 4 x 10 ⁵ células / ^cm2 em meio de osteoclastos e meio refrescante em dias alternados durante 5 dias.
2. Adicionar α-MEM para uma solução de células não-aderentes para um volume final de 18 ml e adicionar M-CSF a uma concentração final de 35 ng / ml.
3. Adicionar 3 ml de cada suspensão de células a placas de cultura de 6 suspensão de 60 mm.
4. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada. Durante este tempo, o FEC-M irá estimular a diferenciação de macrófagos, que podem aderir ao mesmo superfícies tratadas com cultura de células não-tecido.
5. Após incubação durante a noite, re-alimentação de precursores de osteoclastos, com 3 ml de meio de macrófagos fresco. Isto irá remover as células não-aderentes que não foram diferenciadas em macrófagos.
6. Continuar a precursores de osteoclastos de cultura a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 dias ou até as culturas atingem cerca de 70% de confluência.

Diferenciação 4. Osteoclasto

1. Lavar precursores de osteoclastos com 5 ml de PBS e o tratamento de células com 1 ml marinho-origem proteolítica / enzima colagenolítica à temperatura ambiente até o cells pode ser desalojado pelo toque suave da placa.
   NOTA: Osteoclasto precursores só pode ser levantada se eles são cultivadas em pratos de suspensão; precursores prender demasiado firmemente a superfícies tratadas com cultura de tecido a ser levantada. A tripsina pode activar precursores de osteoclastos e deve ser evitado.
2. Adicione 4 ml α-MEM para cada prato e transferência de células para um tubo de 50 ml. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e diluídas células a uma densidade de 5 x 10 ⁴ células / ml e adicionar M-CSF a uma concentração final de 35 ng / ml e RANKL a uma concentração final de 100 ng / ml.
3. Semear as células a uma densidade de 2,6 x 10 ⁴ células / ^cm2 em placas de cultura de tecidos tratados com e incubar a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada durante 2 dias. A diferenciação é tipicamente levada a cabo em placas de 24 poços, em que 5 x 10 ⁴ as células são semeadas em cada poço.
4. 2 dias após o início da diferenciação das células, a re-alimentação de através da substituição de meio com 1 ml de osteoc frescoúltima médio.
   NOTA: a diferenciação de osteoclastos será geralmente completa dentro de 3 dias. osteoclastos resultante pode ser para facilitar a quantificação e análise morfológica manchado de TRAP.

5. estimulação contínua de sinalização Notch com superfície revestida Jagged1

1. Suspender anticorpo de cabra anti-Fc de IgG humana em PBS a uma concentração de 10 ug / ml (1: 1000 de diluição de 10 mg de estoque / ml). Adicionar solução de anticorpo à superfície de cultura a uma densidade de 1,3? G / cm ² e incuba-se à temperatura ambiente durante 1 h. No caso das placas de 24 poços, adicionar 250 ul (2,5 ug) por poço.
2. Vácuo poços aspirado e encher com 1 ml de PBS. Repita este passo 2 vezes.
3. Suspender a proteína recombinante de fusão Fc-Jagged1 em PBS a uma concentração de 10 ug / ml. Adicionar solução Jagged1-FC a superfície de cultura revestida com anticorpo a uma densidade de 1,3? G / cm ² e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 h. Culturas superfícies revestidas com anticorpo onlY podem ser utilizadas como controlos.
4. Vácuo poços aspirado e encher com 1 ml de PBS. Repita este passo 2 vezes. Manter PBS em poços até imediatamente antes da sementeira celular para impedi-los de secagem.
5. De sementeira de 2,6 x 10 ⁴ precursores de osteoclastos / cm ² sobre superfícies revestidas. sinalização Notch será continuamente estimulado durante pelo menos 3 dias.

6. Promoção temporária de sinalização Notch com grânulos Jagged1 revestidas

1. Combinar o seguinte num tubo de tamanho adequado: 0,5? G / cm ² Jagged1-Fc, 21 ul / cm de grânulos de ² a proteína G de agarose, e PBS a um volume final de 1,5 ml. Para preparar um número adequado de grânulos Jagged1 para um poço de uma placa de 24 poços, 1 ug Jagged1 combinar-Fc, 40 uL de proteína G esferas de agarose, e PBS a 1,5 ml.
2. Incubar tubo com rotação a 4 ° C durante 2 h.
3. tubo de centrifugação a 300 xg durante 1 min para os grânulos de peletes. grânulos ressuspender em 1,5 ml PBS. Repita esta lavagemmais 2 vezes.
4. Ressuspender grânulos Jagged1 em meio de cultura 130 ul / cm ² e aplicam-se a células cultivadas.
5. Incubar as células com grânulos a 37 ° C e 5% de CO ₂ por período desejado. Remover esferas com várias lavagens de PBS ou meio de cultura.
6. Verifique a activação de sinalização Notch através da medição de transcritos do gene alvo Notch ^10.

Resultados

O objectivo deste método é a cultura e estimular a sinalização de Notch em precursores de osteoclastos. Quando adequadamente cultivadas, precursores de osteoclastos exibem uma morfologia fusiforme alongada essencialmente liso com citoplasma (Figura 1A). Cuidados devem ser tomados para evitar a activação imunológica dos precursores de osteoclastos. Após a activação, os precursores de espalhar e tornar-se achatado com espumoso citoplasma (Figura 1B).

Discussão

As etapas críticas no âmbito do protocolo

Cultura e na diferenciação in vitro de precursores de osteoclastos fornece uma plataforma útil para a investigação dos mecanismos moleculares de osteoclastogénese e identificação de alvos terapêuticos para regeneração óssea e preservação da massa óssea. Quando a cultura de precursores de osteoclastos de rato, o elemento mais crítico é a manutenção dos precursores em um estado ingênuo. Como as células de macrófag...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts