Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

Resumo

Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.

Resumo

Os neurónios de grãos cerebelosos cultivados primários (CGNs) têm sido amplamente utilizados como um modelo in vitro em neurociência e investigação neurofarmacologia. No entanto, a coexistência de células gliais e neurônios na cultura CGN pode levar a viés na avaliação precisa da viabilidade neuronal. O diacetato de fluoresceína (FDA) e a coloração dupla de iodeto de propídio (PI) foram utilizados para medir a viabilidade celular ao avaliar simultaneamente as células viáveis ​​e mortas. Utilizou-se coloração dupla FDA-PI para melhorar a sensibilidade dos ensaios colorimétricos e avaliar a viabilidade neuronal em CGNs. Além disso, adicionamos manchas azuis fluorescentes de DNA ( por exemplo, Hoechst) para melhorar a precisão. Este protocolo descreve como melhorar a precisão da avaliação da viabilidade neuronal utilizando estes métodos na cultura CGN. Utilizando este protocolo, o número de células gliais pode ser excluído utilizando microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para distinguir os gli indesejadosAl de neurónios em várias culturas de células misturadas, tais como cultura cortical primária e cultura de hipocampo.

Introdução

Os ensaios de citotoxicidade colorimétrica, tais como o ensaio de brometo de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), são comummente utilizados para medir a viabilidade celular in vitro . Os neurónios de grânulos cerebelosos (CGNs) cultivados primários de ratos são sensíveis a várias neurotoxinas, incluindo ião 1-metil-4-fenilpiridinio, peróxido de hidrogénio e glutamato ^{1 , 2} . Portanto, as culturas CGN podem ser usadas como um modelo in vitro no campo da neurociência. As culturas CGN podem conter uma variedade de células, incluindo neurónios e células gliais, que podem representar cerca de 1% das células totais na cultura CGN. No entanto, as células gliais respondem de forma diferente às neurotoxinas em comparação com os neurónios, levando a um viés na viabilidade neuronal medida por ensaios colorimétricos ³ .

Em células viáveis, o diacetato de fluoresceína (FDA) pode ser convertido em fluoresceína por esterase.O iodeto de propídio (PI) pode interagir com o DNA após a penetração de células mortas e pode ser usado para indicar apoptose dentro da cultura. Por conseguinte, a coloração dupla FDA-PI pode simultaneamente avaliar células viáveis ​​e células mortas, sugerindo que a viabilidade celular pode ser medida com maior precisão pela combinação de ambos os métodos colorimétricos. Além disso, adicionando Hoechst, uma mancha fluorescente azul para núcleos, a precisão da viabilidade celular poderia ser melhorada. O protocolo aqui apresentado descreve a coloração dupla de FDA-PI e a coloração tripla FDA-PI-Hoechst, que pode ser utilizada para analisar com precisão a viabilidade neuronal em CGNs de cultura primária.

Este protocolo aproveita-se de visualizar e distinguir CGNs e células gliais por seus diferentes tamanhos e formas. Após a coloração, o número de neurônios viáveis ​​e neurônios mortos são contados a partir de imagens representativas tomadas por microscopia fluorescente. As células gliais de tamanho grande são excluídas pela comparação de CGNs típicos tEm modo fluorescente com as tomadas em modo de contraste de fase. Uma estratégia semelhante pode ser realizada para medir a viabilidade neuronal em culturas de células misturadas contendo neurónios e células gliais, tais como culturas corticais primárias e culturas de hipocampo.

Protocolo

Todos os procedimentos seguiram o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicações NIH No. 80-23, revisado em 1996) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. Preparação de soluções e meios de cultura

Nota: Reagentes e estoques precisam ser preparados em condições estéreis. Esterilizar por filtração utilizando um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm.

1. Preparar solução-mãe de poli-L-lisina (PLL) adicionando 5 mg de PLL a 10 mL de água duplamente destilada (ddH ₂ O). Esterilizar por filtragem. Alicuotar e armazenar a solução stock PLL a -20 ° C durante vários meses.
2. Preparar o tampão Krebs adicionando 7,25 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,14 g de NaH2PO4, 2,6 g de D-glicose e 5,94 g de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico a 100 mL de DdH _{2 <}/ Sub> O. Esterilizar por filtragem. Armazenar a solução tampão Krebs a 4 ° C por até um mês.
3. Preparar solução de Mg2SO4 a 3,82% por adição de 3,82 g de Mg2SO4 a 100 mL de ddH2O. Esterilizar por filtração. Armazenar a solução de Mg ₂ SO ₄ a 4 ° C durante vários meses.
4. Preparar solução de CaCl2 a 1,2% por adição de 1,2 g de CaCl2 a 100 mL de ddH ₂ O. Esterilizar por filtração. Armazenar a solução de CaCl ₂ a 4 ° C durante vários meses.
5. Preparar solução de KCl 2M adicionando 15 g de KCl a 100 mL de ddH ₂ O. Esterilizar por filtração. Armazenar a solução de KCl a 4 ° C durante vários meses.
6. Preparar a solução stock de D-glucose adicionando 1,8 g de D-glucose a 100 mL de ddH2O. Esterilizar por filtração. Alicuotar e armazenar a solução de D-glucose a 4 ° C por até um mês.
7. Preparar a dissolução do estoque de citosina β-D-Arabinofuranoside (Ara-C)Ion por adição de 0,24 g de Ara-C a 10 mL de ddH ₂ O. Esterilizar por filtração. Alíquota e armazenar a solução stock Ara-C a 4 ° C por vários meses.
8. Preparar 250 mL de meio de cultura (para 25-30 filhotes) utilizando 25 mL de soro bovino fetal (FBS), 2,5 mL de glutamina 100x, 2,78 mL de solução de KCl 2M e 2,5 mL de antibióticos 100x em Basal Medium Eagle (BME) . Ajuste o volume para 250 mL e esterilize por filtragem.
9. Preparar meio 25K usando 2,5 mL de glutamina 100x, 2,78 mL de solução de KCl 2M e 2,5 mL de antibióticos 100x em BME. Ajuste o volume para 250 mL e esterilize por filtragem.
10. Preparar meio 5K usando 2,5 mL de glutamina 100x e 2,5 mL de antibióticos 100X em BME. Ajuste o volume para 250 mL e esterilize por filtragem.
    NOTA: O meio de cultura, meio 25K e meio 5K necessitam de ser preparados de fresco
11. Preparar solução-mãe FDA por adição de 5 mg de FDA para 1 mL de acetona. Armazenar a solução-mãe FDA a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
12. Preparar a solução-mãe de PI adicionando 1 mg de PI a 1 mL de ddH2O _. Armazenar a solução stock PI a 4 ° C durante vários meses.
13. Preparar Hoechst solução-mãe, adicionando 5 mg de Hoechst 33342 a 1 mL de ddH ₂ O. Armazenar a solução de reserva Hoechst a 4 ° C por vários meses.

2. Preparação de Soluções de Dissecção

NOTA: Faça isto 1 d antes da dissecção.

1. Preparar a solução de dissecção adicionando 15 mL de tampão Krebs, 1,2 mL de solução de Mg2SO4 a 3,82% e 0,45 g de albumina de soro bovino (BSA) a 150 mL de ddH2O. Ajustar o pH para 7,4 usando NaOH.
2. Rotule os tubos de 5 x 50 mL da seguinte forma: 1, 2, 3, 4 e 5.
3. Coloque 40 mL de solução de dissecção em uma seringa de 50 mL com um filtro. Filtrar 30 mL de solução de dissecção no tubo 1 e 2 mL cada para várias placas de cultura celular de 35 mm, que serão utilizadas para processar tecidos.
4. ParaUbe 2, adicionar 12,5 mg de tripsina em 50 mL de solução de dissecção. Misture completamente por vórtex. Esterilizar por filtragem.
5. Ao tubo 3, adicionar 1,2 mg de DNAse I, 7,8 mg de inibidor de tripsina de soja e 150 μL de solução de Mg ₂ SO _{4 a} 3,82% em 15 mL de solução de dissecção. Misture completamente por vórtex. Esterilizar por filtragem.
6. Ao tubo 4, adicionar 5 mL da solução do tubo 3. Adicionar 10,5 mL de solução de dissecção. Esterilizar por filtragem.
7. Ao tubo 5, adicionar 100 μL de solução de Mg ₂ SO _{4 a} 3,82% e 15 μL de solução de CaCl _{2 a} 1,2% em 12,5 mL de solução de dissecção. Misture completamente por vórtex. Esterilizar por filtragem.
8. Armazene todos os tubos a 4 ° C antes de usar.

3. Revestimento das placas de cultura celular

NOTA: Faça isto 1 d antes da dissecção.

1. Adicionar 1 mL de solução stock PLL a 100 mL de ddH ₂ O (concentração final: 5 μg / mL). Revestimento de plásticoPlacas de cultura de células de 6 ou 12 poços (2 mL por poço para placas de cultura de células de 6 poços ou 1 mL por poço para placas de cultura de células de 12 poços) por adição de 5 ug / mL de solução de poli-L-lisina.
2. Incubar à temperatura ambiente durante 1 dia (ou a 37 ° C durante 2 h). 1-2 h antes da dissecção, remover a solução com uma pipeta. Lavar uma vez com ddH ₂ O e secar no capuz de cultura de células.

4. Processamento de tecidos para ratinhos Sprague-Dawley de 8 dias de idade.

1. Coloque um prato de 100 mm em gelo. Decapitar os filhotes de ratos no prato usando um par de tesouras esterilizadas.
2. Insira a tesoura no forame magnum e corte os dois lados do crânio, das orelhas para os olhos. Levante o crânio usando um par de fórceps. Certifique-se de que todo o cérebro está no crânio. Isolar o cerebelo e colocá-lo no prato de 35 mm acima mencionado usando um par de fórceps.
3. Trabalho sob um microscópio de dissecação. Remova as meninges e os vasos sanguíneos com dois pares de fórceps.
4. Pique os tecidos com uma lâmina. Colocar os tecidos no tubo 1. Centrifugar durante 5 min à RT e 1,500 x g.
5. Aspirar o sobrenadante. Salve o pellet.
6. Adicionar a solução no tubo 2 ao grânulo. Ressuspender agitando suavemente.
7. Colocar o tubo num banho de água a 37 ° C durante 15 min. Agite suavemente a cada 3 min.
8. Adicionar a solução no tubo 4 a esta solução. Agitar e centrifugar durante 5 min à RT e 1,500 x g.
9. Aspirar o sobrenadante. Salve o pellet.
10. Adicionar a solução no tubo 3 para ressuspender a pastilha.
11. Prepare dois tubos de 15 mL. Coloque metade das células em cada tubo. Pipetar para cima e para baixo 60-70x usando uma pipeta Pasteur algodão-plugged para homogeneizar as células.
12. Adicionar 3 mL da solução no tubo 5 a cada tubo de 15 mL. Deixá-los sentar à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur algodão-plugged. Colocar o sobrenadante em novos tubos de 15 mL e centrifugar durante 5 min à RT e 1,500 x g.
13. UMASpirate o sobrenadante. Salve o pellet.
14. Adicionar meio de cultura ao sedimento para obter uma densidade celular de cerca de 1,5 x 10 ⁶ células / mL (cerca de 100 mL para 10 filhotes).
15. Colocar as células em placas de cultura e cultivá-las na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.

5. Adição de Ara-C e D-glucose durante a cultura

1. Após 24 h, adicionar solução-mãe Ara-C (10 μL / poço para placas de cultura celular de 12 poços ou 20 μL / poço para placas de cultura de células de 6 poços, concentração final: 1 mM) para inibir o crescimento das células gliais.
2. No dia 7, adicionar 50 μL de solução-mãe de D-glicose por poço para placas de cultura de células de 12 poços ou 100 μL por poço para placas de cultura de células de 6 poços de modo que a concentração final seja 1 mM.

6. FDA-PI dupla coloração e FDA-PI-Hoechst triplo coloração na cultura CGN

1. Preparar a solução de trabalho FDA-PI adicionando 20 μL de solução-mãe FDA (Concentração final: 10 μg / mL) e 50 μL de solução-mãe de PI (concentração final: 50 μg / mL) em 10 mL de PBS. Misture por vórtex e coloque isso no gelo.
   1. Para a solução de trabalho FDA-PI-Hoechst, adicione 20 μL de solução-mãe FDA (concentração final: 10 μg / mL), 50 μL de solução-mãe PI (concentração final: 50 μg / mL) e 10 μL de solução-mãe Hoechst (Concentração final: 5 μg / mL) em 10 mL de PBS. Misture por vórtex e coloque isso no gelo.
      NOTA: Prepare a solução de trabalho FDA-PI e a solução de trabalho FDA-PI-Hoechst imediatamente antes do uso.
2. Retire a placa de cultura de células da incubadora. Ponha no gelo.
3. Aspirar o meio de cultura e substituí-lo com PBS frio.
   NOTA: A mudança de solução deve ser feita de forma lenta e cuidadosa. Evite tocar nas células com pontas de pipeta.
4. Aspirar o PBS frio e substituí-lo com frio FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst solução de trabalho (500 μL / weLl para placas de cultura celular de 12 poços ou 1 mL / poço para placas de cultura celular de 6 poços). Deixe em gelo por 5 min.
5. Aspirar a solução de trabalho FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst e adicionar PBS frio (100 μL / poço para placas de cultura celular de 12 poços ou 50 μL / poço para placas de cultura celular de 6 poços).
   NOTA: As células não devem ser deixadas secar quando tirar imagens.
6. Tire fotos usando microscopia fluorescente. Use um filtro de excitação com uma banda de passagem de 450-490 nm. Detectar as emissões de fluorescência para FDA, PI e Hoechst a 520, 620 e 460 nm, respectivamente. Sob as mesmas condições, tome uma imagem sob luz normal usando o modo de contraste de fase da microscopia de fluorescência.
   NOTA: Tire as imagens dentro de 15 minutos após a coloração FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst. O tempo de exposição é 100-300 ms eo ganho analógico é 2.8x.

7. Avaliação da Viabilidade Neuronal

1. Para a coloração dupla FDA-PI, sobreponha as imagens das células detectadas após a filtragemPor diferentes filtros de fluorescência arrastando a camada FDA-positiva na camada PI-positiva em um editor gráfico software.
   1. Ajuste a opacidade da camada FDA-positiva inserindo "50%" no campo "Opacidade" do painel "Camadas". Mesclar duas camadas, clicando no botão "Merge Visible" no menu "Camada". Defina o contraste das imagens de sobreposição introduzindo "50" no campo "Contraste" em "Imagem" | "Ajustes" | "Brilho contraste." Certifique-se de que não haja células FDA e PI dupla positivas nas imagens de sobreposição.
2. Para a tripla coloração FDA-PI-Hoechst, sobreponha as imagens das células detectadas após a filtragem de diferentes filtros de fluorescência, arrastando a camada FDA-positiva na camada PI-positivo em um editor gráfico software. Ajuste a opacidade da camada FDA-positiva inserindo "50%" no campo "Opacity" do campo "Layers & #34; painel.
   1. Mesclar duas camadas, clicando no botão "Merge Visible" no menu "Camada". Arraste a camada positiva Hoechst na camada mesclada. Ajuste a opacidade da camada positiva de Hoechst digitando "50%" no campo "Opacidade" do painel "Camadas". Mesclar as duas camadas, clicando no botão "Merge Visible" no menu "Camada".
3. Distinguir visualmente células gliales grandes e irregulares de CGNs, comparando as imagens tomadas sob o modo fluorescente com as tomadas sob o modo de contraste de fase - células com diâmetros três vezes maiores do que CGNs são consideradas células gliais e devem ser excluídas.
4. Contar o número de neurônios viáveis ​​e neurônios mortos, respectivamente, usando um plugin de contador de células em um programa de processamento de imagem ( por exemplo, ImageJ) ⁴ .
   1. Para a marcação dupla com FDA-PI, marque manualmente pequenas células FDA-positivas comoNeurônios viáveis. Marque manualmente as células PI-positivas como neurônios mortos. Para a coloração tripla FDA-PI-Hoechst, marque manualmente pequenas células positivas a FDA e Hoechst como neurônios viáveis. Marque manualmente células PI-e Hoechst-positivas como neurônios mortos.
5. Calcula-se a percentagem de viabilidade neuronal utilizando a seguinte equação:% de viabilidade neuronal = [número de neurónios viáveis ​​/ (número de neurónios mortos + número de neurónios viáveis) x 100%. Para cada poço, escolher cinco campos aleatórios e média a percentagem de viabilidade neuronal.

Resultados

A imunocoloração dupla de GAP43 (vermelho) e GFAP (verde) foi utilizada para analisar a forma dos neurônios e células gliais, respectivamente ^{2 , 5} . Tanto os neurónios como as células gliais estão presentes na cultura CGN. As células gliais GFAP-positivas são grandes e de forma irregular, como indicado pelas setas nas imagens ( Figura 1 ). Os ensaios tradicionais para a vitalidade celular não podem dis...

Discussão

Este protocolo foi modificado a partir de procedimentos que foram descritos anteriormente ^{6 , 7} . Os pesquisadores passaram tempo tentando reduzir o crescimento de células não-neuronais melhorando as condições quando cultivando neurônios primários in vitro ⁸ . Contudo, mesmo com condições de cultura melhoradas, permanecem algumas células gliais. Além disso, células não-neuronais são necessárias em culturas neuronais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100x glutamine	Gibco	25030081
100x antibiotics	Gibco	15240062
Basal Medium Eagle (BME)	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate (FDA)	Sigma	F7378
Propidium Iodide (PI)	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 mL	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 mL	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image processing software	NIH	ImageJ