In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Resumo

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

Resumo

Os pontos fortes genéticos e técnicos fizeram o vertebrado zebrafish um organismo chave modelo no qual as consequências das manipulações genéticas podem ser rastreadas in vivo durante todo o período de desenvolvimento acelerado. Vários processos podem ser pesquisados, incluindo a proliferação celular, a expressão do gene, a migração celular e morfogénese. Importante, a geração de quimeras através de transplantes pode ser facilmente realizada, permitindo mosaico rotulagem e a identificação de células individuais sob a influência do meio ambiente do hospedeiro. Por exemplo, pela combinação de manipulações funcionais de genes do embrião hospedeiro (por exemplo, através de microinjecção morfolino) e imagens ao vivo, os efeitos da não-autônomos extrínseca, sinais celulares (fornecido pelo ambiente geneticamente modificado) em células do dador transplantado individuais podem ser avaliadas. Aqui demonstramos como essa abordagem é usada para comparar o início da expressão do transgene fluorescente como um proxy para o calendário de determin destino celularção em diferentes ambientes genéticos do hospedeiro.

Neste artigo, nós fornecemos o protocolo para microinjecting embriões de peixe-zebra para marcar células do doador e para causar silenciamento de genes em embriões de acolhimento, uma descrição da técnica de transplante usado para gerar embriões quiméricos, eo protocolo para a preparação e funcionando in vivo confocal de lapso de tempo imagens de vários embriões. Em particular, a realização de imagem multiposition é crucial quando se comparam cronometragem de eventos, tais como o início da expressão do gene. Isto requer a coleta de dados do controle múltiplo e embriões experimentais processados ​​simultaneamente. Tal abordagem pode ser facilmente estendido para estudos de influências extrínsecos em qualquer órgão ou tecido de escolha acessível para imagens ao vivo, desde que o transplante pode ser alvejado facilmente de acordo com os mapas fate embrionárias estabelecidas.

Introdução

A capacidade de visualizar os processos de desenvolvimento importantes em um vertebrado in vivo tem contribuído para tornar o peixe-zebra um modelo fundamental para o estudo de condições normais e de doenças (revisto em ^{1, 2).} Em particular, a retina neural é uma parte acessível do sistema nervoso central. A retina presta-se facilmente realizar estudos de neurogênese, devido à sua, ainda estrutura relativamente simples altamente organizado, e seus tipos de neurônios altamente conservadas entre espécies de vertebrados ^3. A dinâmica de comportamentos celulares tais como a proliferação, a saída do ciclo celular, divisão celular assimétrica, especificação de destino, a diferenciação e a formação de circuitos neurais pode ser seguido ao longo de todo o processo de retinogenesis, que é completado na retina central do peixe-zebra por 3 d pós-fertilização ( DPF) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Além disso, os requisitos funcionais de genes diferentes em cada uma das etapas acima mencionadas podem ser concomitantemente avaliada na retina de peixe-zebra, proporcionando uma vantagem sobre os outros modelos de vertebrado em que os fenótipos resultantes da aplicação de técnicas de knockout de genes só pode ser avaliado mediante o exame post mortem de tecidos fixados. Em particular, o uso de linhagens transgênicas em que podemos visualizar e monitorar a expressão de proteínas fluorescentes como transgenes repórter na retina, nos permite obter a resolução temporal da expressão do gene subjacente à génese de um tipo de célula neuronal particular. Devido ao rápido desenvolvimento do peixe-zebra, estes eventos pode ser visualizado durante todo o período de desenvolvimento, proporcionando assim uma percepção mais profunda sobre a importância temporal da expressão do gene em relação à aquisição identidade da célula neuronal e o comportamento das células.

Finalmente, estas abordagens podem ser combinadas de forma eficiente no peixe-zebra com a geração de quimera através de transplantes, resultando em percepções em dois aspectos chave da função do gene. Em primeiro lugar, as células transplantadas de um embrião doador, em que um gene particular foi derrubado enquanto elas se desenvolvem em um ambiente sem rótulo tipo selvagem examinando, nos permite obter informação relevante sobre a função do gene de uma forma de células-autônoma. Isto conduz a informações importantes sobre a função de factores destino determinantes da retina dentro das células progenitoras que são normalmente expressas em. Isto é exemplificado pela análise do resultado destino de desenvolvimento de células progenitoras que não podem gerar a proteína funcional a partir destes genes de ^{4, 6, 8, 9.} Utilizando esta abordagem, temos mostrado que fatores determinantes muitos Fate (por exemplo, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agir celular-autonomously para conduzir destinos neuronais específicos da retina; a falta de expressão do gene leva principalmente a um comutador de destino, de tal modo que as células com o gene knockdown permanecem viáveis através da adopção de um destino alternativo célula ^{4, 6, 7, 10.} Em segundo lugar, tais experiências quiméricas podem ser utilizadas para avaliar o tipo selvagem progenitores comportar quando elas se desenvolvem em diferentes ambientes genéticos. Por exemplo, através da comparação do desenvolvimento de células WT que normalmente expressam um gene de interesse (e transgene repórter) numa WT contra ambiente hospedeira manipulada (por exemplo, gene knockout / knockdown), os efeitos resultantes sobre a expressão do gene e o destino da célula pode ser avaliada . A falta de certos tipos de neurónios no ambiente hospedeiro, por exemplo, tem sido mostrado para influenciar o comportamento de células progenitoras de tipo selvagem de uma maneira célula não autónomo, para polarizar os para se diferenciarem em o O sub-representadosr neurônio tipos ^{4, 7, 11, 12} desaparecidos. Dado que os neurônios da retina nascem em uma ordem histológico conservada pela expressão sequencialmente de genes específicos destino determinantes neuronais (destino expressão gênica) (revisto em ^13), utilizou estes métodos para demonstrar como o momento da expressão do gene destino em progenitores tipo selvagem é afetado quando essas células progenitoras desenvolvem em ambientes de host da retina com composições celulares aberrantes induzidos. Aqui, descrevemos essas abordagens como evidência de como a combinação de técnicas relativamente padrão e utilizado permite o exame do sincronismo da expressão do gene destino no desenvolvimento de células progenitoras da retina ^{8, 9.}

Este protocolo descreve uma abordagem experimental combinar imagiologia com lapso de tempo a facilidade de performando transplante na ex vivo desenvolvimento do embrião de peixe-zebra para seguir mosaically indivíduo células marcadas ao longo de todo o período de retinogenesis desenvolvimento. Ao executar manipulações de genes funcionais quer no embrião hospedeiro, embrião dador, ambos ou nenhum, pode-se avaliar a autonomia célula da função do gene. Esta abordagem pode ser adaptada para questões de investigação amplamente semelhantes em qualquer outro sistema para o qual os componentes individuais aqui descritas são adequados.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as disposições do código Australian Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho de prática para o cuidado e uso de animais e foram aprovados pelos comitês de ética institucionais.

1. Preparação de Zebrafish

1. emparelhamento peixes adultos
   1. Configurar peixes adultos como pares (ou dois pares) em tanques de criação dimensionadas adequadamente à noite antes de usar.
   2. Para manter a fêmea separado do masculino, use um divisor para permitir que os peixes para ver, mas não se tocam.
   3. De manhã, depois de ligar a luz, remover as divisórias e permitem que os peixes para acasalar sem perturbações.
   4. Após o acasalamento bem-sucedido colocar peixes adultos de volta em seus tanques originais.
      NOTA: As estirpes hospedeiras e dadoras podem ser o mesmo, por exemplo, qualquer tipo selvagem (WT) estirpes. Para este estudo, os embriões de dadores derivado a partir das linhas transgénicas de Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) ouTg (vsx1: GFP) em que a expressão de factores determinantes destino condução neural precoce ou destino final pode ser visualizada, respectivamente ^{14, 15, 16.} A fim de comparar os efeitos de diferentes ambientes genéticos, embriões hospedeiros podem ser mutantes ou morphants específicas como descrito a seguir.
2. de colheita de embriões
   1. Use um coador de chá para recolher os ovos na caixa de criação. Verifique se há ovos a cada 15 minutos para determinar o tempo de nascimento e assegurar embriões em estágio de célula única são recolhidos para as etapas subsequentes.
   2. Lavar embriões com forma E3 (NaCl a 5 mM, KCl 0,2 mM, CaCl 0,4, _MgCl2 0,9 mM, ₂ e 2% de azul de metileno em água destilada) e colocá-los em placas de Petri contendo ~ 40 mL E3 ¹⁷ a uma densidade máxima de 50 ovos por 90 mm de diâmetro placa de Petri.
   3. Rotular os pratos de Petri com o nome estirpe, data e hora denascimento. Usar uma pipeta de transferência de Pasteur para remover quaisquer detritos enquanto visualiza os embriões sob o microscópio de dissecação.
   4. Manter os embriões em 28,5 ° C até ~ 3 h pós-fertilização (hpf) para o transplante, ou continuar com microinjeções.
      NOTA: Para transplantes, objectivo para embriões de dadores e de acolhimento em idades semelhantes. Por conseguinte, utilizam diferentes temperaturas de criação entre 25 - 32 ° C de acordo com Kimmel et ai. ¹⁸ para abrandar ou acelerar uma embraiagem de embriões para coincidir com o outro.
   5. Mantenha ~ 20 dos embriões doadores transgênicos não injectado a 32 ° C a partir do momento da coleta até a imagem de lapso de tempo (24 - 28 h mais tarde).
      NOTA: Estes irão desenvolver mais rapidamente do que o grupo experimental e irão expressar marcadores fluorescentes anteriormente. Eles podem assim ser utilizados para definir os parâmetros do laser (potência, ganho) para a imagiologia. Neste exemplo particular, a imagem latente da coorte experimental começa antes da expressão do transgene (para avaliaro momento exato do evento).

2. Preparação para microinjeção

1. preparação agulha microinjeção
   1. Use um extrator de agulhas para retirar agulhas de cada tubo capilar de vidro de borosilicato (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm de comprimento capilares de vidro) no centro obter duas agulhas de igual comprimento. Apontar para agulhas que afunilam com eixos longos.
      NOTA: As configurações de exemplo para o extrator de agulhas usadas aqui são fornecidos no Lista de Materiais.
   2. Armazenar as agulhas puxadas em uma placa de Petri e segura, pressionando-os em uma tira de massa moldável ou fita adesiva.
   3. Antes da injecção trazer a ponta da agulha no foco sob um microscópio de dissecação e utilizar uma pinça para quebrar a agulha na ponta. Apontar para uma ponta cônica afiada com uma pequena abertura (Figura 1C).
2. preparação Morpholino para os embriões de acolhimento
   1. oligonucleotídeos fim morfolino projetado especificamente para o gene de interesse, bem como um morfolino controle padrão ou um apropriado incompatibilidade 5 pares de bases para controlar os efeitos processuais e manuseio.
      NOTA: Aqui, uma tradução de bloqueio Ptf1a morfolino com a sequência 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 ', que inibe o desenvolvimento das células horizontais e amácrinas nascidos intermédios, e um controlo de peixe-zebra morfolino padrão de segmentação mutação intrão da beta-globina humana (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^{7, 19} foram utilizadas.
   2. Preparar uma solução 1 mM estoque morfolino (~ 8-8,5 ng / nl) e armazenar a temperatura ambiente.
   3. No dia da injecção, aquecer-se uma alíquota (10 pL) de morfolino a 65 ° C durante 10 min, girar rapidamente e colocar em gelo para arrefecer a partir de 65 ° C (após o que pode ser mantida à temperatura ambiente durante a utilização). ºé potencialmente irá inverter qualquer agregação na solução de morfolino, que pode diminuir a eficácia do knockdown.
      1. Para Ptf1a morfolino e morfolino controle padrão equivalente, prepare uma solução de trabalho de 6 ng / NL por diluição da solução estoque morfolino com água destilada. Manter em temperatura ambiente.
         NOTA: Use 2 nL da morfolino por embrião como o Ptf1a morfolino exige uma concentração relativamente elevada de trabalho de 12 ng por embrião conforme determinado anteriormente ^7. Para a maioria dos morpholinos, 2-5 ng por embrião é eficaz, então diluir o estoque de 2-5 ng / NL e injetar 1 nL em cada embrião.
3. Preparando repórter de fusão histona fluorescente constrói para os embriões rotulagem doadores
   NOTA: A fim de distinguir / visualizar as células de doadores dentro dos embriões de acolhimento, existem diferentes abordagens para rotular o embrião doador, incluindo a microinjecção de H2A-GFP (se estiver usando doadores transgênicos comrepórteres fluorescentes vermelhas) ou H2B-RFP (se estiver usando doadores transgênicos com repórteres fluorescentes verdes) mRNA na gema do de uma única célula do embrião estágio doador.
   1. Linearizar, pelo menos, 1 ug do plasmídeo contendo o DNA repórter.
      NOTA: Aqui pCS2 + plasmídeo (gerada e gentilmente cedido pelo Prof. David Turner, da Universidade de Michigan e Prof. Ralph Rupp do Centro Biomédico de Munique) contendo H2A-GFP ou H2B-RFP (gerado pelo Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, Universidade de Londres) foi linearizado com a digestão com enzimas de restrição Notl.
   2. Purifica-se DNA usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Transcrever o ARNm utilizando kits disponíveis comercialmente com polimerase apropriada, conforme as instruções do fabricante. Para o plasmídeo pCS2 +, utilizar um kit de polimerase SP6.
   4. Purifica-se o ARNm utilizando kits comerciais ou extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com isopropanol como por instrução do fabricantes. Dilui-se o ARNm em água ultrapura (20 - 30 mL), medir a concentração com um espectrofotómetro e armazenar a -80 ° C.
   5. No dia da injecção, preparar uma solução de trabalho de ARNm em água esterilizada com uma concentração final de 100 ng / mL e manter em gelo. Voltar estoque mRNA não utilizado novamente até -80 ° C.

3. microinjeção de Morpholinos e / ou mRNA em células de estágio único Embriões

NOTA: Microinjeções são usados para marcar todas as células do doador e preparar os diferentes ambientes de host (controle e silenciamento de genes) e envolvem injeções de mRNA ou morfolino oligonucleotídeos antisense ^{20, 21.}

1. Carregamento e calibragem a agulha de injeção
   1. Protelar a agulha de injeção com 3 ul da morfolino e / ou solução de mRNA de fusão histona fluorescente usando dicas microloader pipeta.
   2. Agite o solutíon para a ponta da agulha de injeção até que não haja bolhas restantes. Use agulhas de injecção com um vidro interno inserir tal que a solução será desenhado principalmente para a ponta por acção capilar.
   3. Coloque a agulha de injeção para um suporte montado em um micromanipulador (micromanipulador manual do 3D) e assegurar uma boa vedação no interior do alojamento tubo.
   4. Ligue o fornecimento de energia e gás para o microinjetor pressão regulada.
   5. Mergulhe a ponta da agulha em uma gota de óleo mineral em um prato (se estiver usando uma ocular de retícula) ou passar a ponta da agulha diretamente sobre uma lâmina de micrômetro para calibrar o volume da gota. Medir o volume de injecção, pressionando o pedal e ajustar a pressão do gás e / ou o tempo de duração até que o volume de injecção é equivalente a 1 nL (125 um de diâmetro).
      NOTA: A vantagem da corrediça micrómetro é que as medições são independentes da ampliação usado no microscópio, no entanto, utilizando o ins ocular retículatead, a queda de injeção e escala pode estar em foco simultaneamente.
2. microinjeção de embriões
   1. Coloque uma lâmina de microscópio em uma placa de Petri e usar uma pipeta de transferência de fase para depositar embriões de célula única ao longo do bordo de slides. Alinhar em uma única coluna usando uma ponta microloader pipeta com metade da ponta fina cortado. Remover o máximo de líquido possível com uma pipeta fina para evitar movimentos durante injeções (Figura 1A).
   2. Abaixe a agulha no sentido de cada embrião, e penetrar no córion e gema em um curso liso (Figura 1B).
   3. Uma vez que a ponta da agulha está centrada na gema, microinject pressionando o pedal de pé. Injectar 1 nL de H2A-GFP ou mRNA H2B-RFP na gema de uma única célula de embrião em fase de doadores (transgênicos). Injectar 2 nL de MO padrão ou Ptf1a MO na gema de um estágio de uma única célula tipo selvagem embrião hospedeiro, pressionando o pedal duas vezes. injecções de sucesso pode ser visualizado por o smal l deformação espacial na gema.
   4. Remover a agulha de injecção, mover o prato contendo os embriões para trazer o próximo embrião em posição e continuar a injecção até que toda a coluna de embriões são injectadas (50 - 60 embriões).
   5. Após a injecção de todos os embriões, levante o prato-se em um 30 - ângulo ° 45 e usar um fluxo suave de E3 médio (frasco de compressão) para transferir os embriões injetados em uma nova caixa de Petri limpa.
   6. Colocar a cápsula de embriões em uma incubadora (quer a 28,5 ° C ou outra temperatura para assegurar que os embriões doadoras e hospedeiras são em idades equivalentes).
   7. Repita os passos 3.2.1 - 3.2.6 conforme necessário para obter ~ 100 embriões de dadores ou ~ 200 - 250 embriões de acolhimento.
   8. No 1-2 hpf, verifique os embriões sob um microscópio de dissecação e remover quaisquer ovos não fertilizados que não tenham avançado para o 2 ou 4 células de estágios com uma pipeta Pasteur.

4. Preparação para os transplantes

ONTEÚDO "> Nota: Os transplantes são usados para gerar embriões quiméricos permitindo os efeitos de diferentes ambientes de host genético a ser avaliado dentro equivalentes WT progenitores doadores ^{9, 22, 23.}

1. seleção de embriões de doadores
   1. Aos 3 hpf, verifique os embriões de dadores a 2 - 5X para o sinal de rotulagem sob um microscópio de fluorescência. Escolha bem desenvolvida (massa celular simétrica com células uniformemente porte) embriões com um forte sinal fluorescente usando o GFP além de filtro (460-500 nm de excitação, 510 nm de emissão passe) ou filtro Texas Red (540-580 nm de excitação, 610 nm emissão de passe) (Figura 1D). Os repórteres transgénicos ainda não são expressas.
2. placa de injecção de agarose e preparação placa de Petri
   1. Despeje fundido agarose 2% diluído em meio E3 em um diâmetro de Petri 90 mm e deixe esfriar até que o prato é segurotocar. agarose quente pode de outro modo deformar o molde.
   2. Flutuador um molde de plástico com saliências em forma de cunha (6 x 25 / de molde) sobre a agarose (Figura 2D, E). Evitar bolhas de ar, colocando um lado do molde para a agarose e lentamente inferior para baixo do outro lado. Certifique-se de que o molde é centrado no prato ou na direcção do lado do ponto mais profundo das saliências em forma de cunha para permitir espaço livre suficiente para o transplante de agulha.
   3. Permitir que a agarose solidificar completamente à TA.
   4. Colocar a cápsula de agarose a 4 ° C durante 30 min e remover os moldes suavemente por levantamento de um canto (por exemplo, com uma pinça). Prepare placas de injeção de agarose dia antes da experiência e armazenar a 4 ° C com um pequeno volume de E3 selo médio e parafina filme para evitar que sequem.
   5. Antes do transplante, encher a placa de injecção de agarose com forma E3 e colocar numa incubadora C 28,5 ° C durante pelo menos 30 min.
   6. Uma vez que os embriões dechorionated ficar com plástico, use pratos de vidro ou revestir o interior das placas de Petri (90 mm de diâmetro) com uma fina camada de 2% de agarose na E3. Prepare um prato de embriões de acolhimento dechorionated, um prato para os embriões de dadores dechorionated e um prato para cada 40 embriões transplantados. Armazenar como descrito para a placa de injecção (4.2.4).
3. preparação de transferência de pipeta
   1. Cortar a ponta de uma forma longa finamente puxado vidro pipeta de ponta Pasteur (volume de 2 ml, 230 mm de comprimento, 100 mm com ponta longa) para um comprimento que permite um manuseamento confortável (opcional) riscando com uma faca de diamante, enquanto em rotação até que as quedas de ponta off (Figura 1F).
   2. Certifique-se de que o corte é reto. Fogo polonês a pipeta de transferência de vidro girando a superfície de corte em um bico de Bunsen para gerar extremidades lisas de modo a não danificar os embriões dechorionated (Figura 1F).
      NOTA: Manter a ponta da pipeta na chama por muito tempo wmal resultado na abertura de serem seladas para cima ou para tornar-se demasiado pequena para os embriões.
4. Dechorionating blástula doadores e de acolhimento embriões em estágio
   1. Embriões Dechorionate quer manualmente com duas pinças finas por cada rasgo aberto córion, sem tocar no embrião, ou enzimaticamente utilizando protease para permitir dechorionation rápida simultânea de um grande número de embriões ^9.
      1. Prepara-se uma solução estoque de 50 mg 100x mistura de protease / ml, fazer alíquotas de 100 ul e armazená-las a -20 ° C.
      2. Adicionar 100 ul de estoque a protease a 10 mL de meio E3 (concentração final de 0,5 mg / mL de protease).
      3. Coloque embriões de acolhimento e dos doadores bem desenvolvido em duas provetas pequena Erlenmeyer de vidro separados (10 ml) e remover o máximo de líquido possível.
      4. Adicionar 5 mL da solução de protease de 0,5 mg / mL a cada copo e rode suavemente os embriões enquanto olhando-los sob um microscópio de dissecação. Preste atenção para quaisquer sinais de deformação do córion.
      5. Mantenha roda. Assim que o primeiro embrião está fora do córion (Figura 1D, asteriscos), executar três lavagens rápidas com meio E3 para remover a solução de protease vertendo a maior parte do líquido e reenchimento do balão vertendo cuidadosamente em E3 ao longo do lado. Não permitir embriões dechorionated a entrar em contacto com o ar, em qualquer dos passos subsequentes até ao fim do transplante (secção 5), à medida que vai rebentar. Deixar solução adequada no balão entre lavagens.
      6. Com a pipeta de transferência de vidro fogo polido, transferir os embriões do copo Erlenmeyer em placas de Petri de vidro ou agarose (2% em meio E3) revestido pratos de plástico. Pipeta suavemente durante a transferência para remover qualquer córion enfraquecido restante.
5. preparação agulha transplante
   1. Use um extrator de agulhas para retirar duas agulhas de cada tubo fino parede de vidro de borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo/ 0,78 mm de diâmetro / comprimento de 100 mm) com as mesmas configurações como as pipetas de microinjeção.
      NOTA: As configurações de exemplo para o extrator de agulhas usadas aqui são fornecidos na Lista de Materiais. agulhas transplantes não tem uma inserção de vidro, como isso danifica as células sugado para dentro da agulha.
   2. Puxar agulhas de antecedência, armazenar em uma placa de Petri e segura, pressionando em uma tira de massa moldável ou fita adesiva.
   3. Antes do transplante de trazer a ponta da agulha no foco sob um microscópio de dissecação e utilizar uma pinça para quebrar a agulha na ponta. Use uma pinça fina para ajustar a forma da agulha a apontar para uma flauta-forma (Figura 2G), ou use métodos alternativos descritos para gerar a forma da ponta ^23.

5. Chimera Geração via Blástula Transplantation

1. configuração transplante
   NOTA: Aqui, foi utilizado um aparelho de transplante auto-montada (Figura 2A ).
   1. Montar a agulha transplante no mesmo suporte de agulha usado para microinjecção acima (montado em micromanipulador, passo 3.1.3) (Figura 2A).
   2. Desconecte a tubulação injetar que liga o fim do suporte da micropipeta ao microinjetor pressão regulada usado para microinjeções. Conectar o tubo de injecção, que está ligada a uma seringa de 1 ml (Figura 2A, B), que representa o equipamento de transplante.
      1. Certifique-se de que todas as ligações são hermeticamente fechado usando filme de parafina ou massa moldável. Prevenir embriões de entrar em contacto com o ar, assegurando que há sempre algum meio E3 na própria agulha transplante. Operar manualmente a seringa para sugar células / líquido para dentro e para fora da agulha transplante.
2. alinhamento embrião
   1. Transferir os embriões de dadores com a pipeta de vidro para a primeira coluna do molde de agarose. Transferir os embriões de acolhimento em colunas 2a 6 do molde de agarose (Figura 2F). Posicionar os embriões com a pipeta de modo que o lado da blastomere voltado para cima.
3. Transplantação
   1. Delicadamente descansar a agulha transplante em uma célula blastomere de um embrião doador e lentamente sugar até cerca de 20 - 50 células dentro da agulha transplante (Figura 2H). Evite sugando a gema.
   2. Levante a agulha transplante a partir do embrião doador usando o micromanipulador. Mover o prato do molde de agarose para a esquerda e inserir a ponta da agulha transplante através do lado da massa de células no polo animal do primeiro embrião hospedeiro. Depósito de 5 - 10 células perto da superfície de acordo com o destino de mapeamento que mostra que esta área dá origem ao campo prosencéfalo / olho ²⁴ (Figura 2I). Manter a ponta da agulha está imerso no meio E3 ao longo de todo o procedimento.
4. Cuidados de embriões transplantados
   1. Remover o dador uma embriõesnd deixar os embriões de acolhimento no molde agarose por 1-2 h em 28.5 ° C. Encha vidro ou de plástico (revestido com 2% de agarose) placas de Petri com meio de E3 contendo 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para evitar a formação de pigmentos pois isso irá interferir com a imagiologia. Transferir os embriões de acolhimento para estes pratos com a pipeta de vidro polido fogo e incubar a 28,5 ° CO / N.
      CUIDADO: Use luvas ao manusear PTU.

6. Setup Imagens ao vivo

NOTA: O tamanho pequeno e transparência óptica de peixe-zebra combinada com o rápido desenvolvimento têm permitido que ele se torne um modelo vertebrado chave para imagem in vivo de diferentes células e órgãos. A imagiologia pode ser realizado em uma variedade de microscópios, que diferem na configuração e parâmetros. O seguinte descreve uma configuração de imagem confocal adequada para a imagem latente do desenvolvimento da retina ^{5, 8.}

1. embrião quiméricoseleção
   1. Às 24 - 26 hpf, a tela de embriões transplantados sob um escopo de dissecação fluorescente para selecionar saudáveis ​​embriões bem desenvolvidos que mostram as células transplantadas doador (H2A-GFP ou H2B-RFP marcados) no primórdio do olho em desenvolvimento.
   2. Separe até 40 embriões para a montagem por pipetagem em um novo prato e adicionar 0,4 mg / mL tricaina metanossulfonato (MS222) para anestesiar os embriões.
      CUIDADO: Use luvas ao manusear MS222.
2. embriões de montagem
   NOTA: Utilizar o prato de montagem apropriada, dependendo se imagiologia será executada em um microscópio invertido ⁸ ou na posição vertical (descrito aqui).
   1. Prepara-se uma poucos tubos de plástico de 1,5 ml contendo 1 ml de 1% de agarose de baixa fusão em 0,4 mg / mL em meio MS222 E3 e manter fundido num banho de água a 40 ° C.
   2. Sugar até 5 embriões em uma transferência pipeta de plástico e deixar os embriões se acumulam na ponta pela gravidade. Toque a pipeta de transferênciasobre a superfície de um dos tubos de plástico preparadas contendo 1% de agarose de baixo ponto de fusão e 0,4 mg / mL MS222 permitindo que os embriões a afundar para dentro do tubo, limitando simultaneamente a quantidade de transferência E3.
   3. embriões de montagem em um diâmetro de Petri 90 mm para imagens no microscópio vertical e com fundo de vidro placa de Petri (qualquer tamanho) para geração de imagens no microscópio invertido. Use um marcador permanente para dividir visualmente quer prato em duas metades para os doadores imagem nos hospedeiros WT (de um lado) ou hosts morphant (outro lado) no mesmo experimento.
   4. Transferir os cinco embriões a partir do tubo de plástico agarose a qualquer placa de Petri com 0,5-1 mL de agarose. Remover o excesso de agarose com uma pipeta de transferência de modo que apenas uma pequena gota (~ 200-300 uL) permanece. Se de imagem com microscopia de pé, evite colocar os embriões dentro de 1 cm de circunferência placa de Petri. A lente de imersão em água de imersão usado para imagiologia pode não ser capaz de ser centrado na área que, devido à parede do prato de Petri (Figura 3A </ Strong>).
   5. Usar uma pipeta microloading (com a ponta quebrada) para alinhar os embriões lateralmente até que os solidifica de agarose. Para ambos os tipos de pratos, os embriões são correctamente angulada lateralmente, se os dois olhos em ambos os lados da cabeça são completamente sobrepostas (alinhado na dimensão XY) (Figura 3B). Para o uso de microscopia invertida, o olho perto da lamela deve ser empurrado tão perto da lamela quanto possível, para permitir a imagem através do z-dimensão dentro das limitações dos possíveis níveis de foco.
   6. Continue a montagem cinco embriões em um momento em gotas de agarose individuais. Use mais 1% de agarose de baixa fusão para se juntar a agarose cai para o outro e o lado do recipiente para evitar qualquer desalojamento e movimento lateral durante a imagiologia (Figura 3A).
   7. Uma vez totalmente solidificada, cobrir o prato com meio E3 (contendo 0,003% PTU, 0,4 mg / mL MS222) pré-aquecido a 28,5 ° C.
   8. Usando a mesma abordagem descrita em 6.2.2 passos- 6.2.8, montar ~ 20 embriões transgênicos levantadas a 32 ° C (passo 1.2.5) em um prato separado.
3. parâmetros de imagem
   NOTA: Imaging para analisar o aparecimento de transgenes fluorescentes não requer alta resolução espacial intracelular. Ela pode ser realizada com um objectivo W Plano-Apochromat 20X / DIC 1,0 M27 70-mm a 1.5 de zoom.
   1. Configure o tempo de potência do laser e a exposição com base na intensidade transgene para os ~ 20 embriões transgênicos com desenvolvimento acelerado (ou seja, levantados em 32 ° C; passo 6.2.8).
      NOTA: Para estudos de aparecimento da expressão do transgene, os embriões experimentais mostram nenhuma fluorescência, no momento do lapso de tempo é criado e, assim, estes embriões acelerados são cruciais para determinar os parâmetros de imagiologia.
   2. Para o prato experimental, visualizar cada embrião e guardar a posição e concentrar níveis de embriões.
      1. Escolha embriões que têm o ângulo de montagem correta (ou seja, com a s lateraiside do olho o mais horizontal possível) e uma pulsação forte (um indicador de saúde). Escolha embriões com algumas células do dador transplantado (identificados por H2A-GFP ou rotulagem H2B-RFP) principalmente no quadrante ventral anterior da retina em desenvolvimento (onde a expressão do gene de onda começa) (Figura 3C).
         NOTA: Em embriões de peixe-zebra, a frequência cardíaca média é de 120 - 180 batimentos / minuto ^25. Nos embriões anestesiados, um batimento cardíaco saudável pode estar na gama de 60 - 120 batimentos / minuto. batimento cardíaco mais lento pode ser indicativo de viabilidade reduzida e os embriões devem ser excluídos do estudo.
   3. Defina-z pilhas de secções ópticas em intervalos de 2 um a retina através de até 15 embriões.
      NOTA: O número total de embriões que podem ser visualizados em qualquer dada experiência, irá depender de parâmetros individuais (tempo de exposição e de tamanho Z-stack). O tempo necessário para a imagem um ponto de tempo para todos os embriões escolhidos devem ser SHorter do que o intervalo entre os pontos de tempo. Ao sacrificar alguma resolução de profundidade, mais embriões podem ser visualizados dentro dos intervalos de tempo. Os limites do Z-pilha são escolhidos como extremos lateral e medial do olho embriões montado e 30 uM é adicionado ao lado lateral na configuração microscopia na posição vertical, enquanto os olhos dos embriões em desenvolvimento nesta mudança de configuração na direcção z como os embriões crescem durante a noite. Isso resulta em pilhas de 100 - 170 mm de espessura (50 - 85 images / olho).
   4. Aqui imagens cada 24 min a 32 ° C (equivalente a intervalos de 0,5 HPF) usando o apropriado de laser / canal para o transgene.
      NOTA: Os embriões permanecem no estágio durante todo o lapso de tempo todo dentro de uma câmara aquecida que abrange todo o microscópio. Enquanto o experimento pode ser realizado a 28 ° C, temperaturas mais quentes são utilizados para acelerar o desenvolvimento e garantir que os pontos temporais relevantes no experimento são gravadas dentro do 16 - período de lapso de tempo 24 h.
   5. Imagemcanais que representam o rótulo de doadores (H2A-GFP ou H2B-RFP - opcional) e transgene (Atoh7: RFP ou Vsx1: GFP) usando varredura sequencial. Para a análise, utilizam o rótulo dador apenas para escolher embriões adequadas como descrito (ter um z-pilha no início da criação de imagens) e, em seguida, executar lapso de tempo somente no canal para capturar a expressão do transgene.
      NOTA: Como alternativa, use o rótulo doador só para seleccionar embriões adequadas (ou seja, aqueles com células confirmados transplantados em anterior quadrante ventral) e imagem apenas o canal transgene, mais ou menos, reduzindo para metade o tempo de imagem e quase o dobro do número de embriões que podem ser visualizados e analisados por experiência (Figura 4).

Resultados

Este trabalho apresenta um protocolo experimental para avaliar mudanças na expressão gênica cronometragem quando tipo selvagem progenitores da retina desenvolver dentro de um embrião hospedeiro morphant. Os embriões hospedeiras experimentais são morphants Ptf1a, que não possuem os interneurônios horizontais e amácrinas nascidos intermediários da retina ^{7, 26.} Estes foram comparados para controlar embriões de acolhiment...

Discussão

Compreender a medida em que as células vizinhas influenciar timing da expressão de factores que determinam o destino celular crucial é essencial quando se aponta para instruir de forma eficiente as células estaminais multipotentes embrionárias ou induzidas a se diferenciar em um tipo de célula pós-mitótico específica ou mesmo tecidos estampados. Além disso, examinar estes eventos moleculares nas células em desenvolvimento do animal vivo, adicionalmente, fornece dinâmica relevante informação (temporal e esp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6