Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Resumo

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Resumo

A resposta de ADN de danos (DDR) foi extensivamente caracterizado em estudos de quebras na cadeia dupla (DSB) induzidas por irradiação com feixe de laser de micro em células vivas. A DDR de hélice distorcer modificações covalentes de ADN, incluindo ADN reticulações intercadeias (ICLs), não é bem definido. Estudamos o DDR estimulada por ICLs, localizada por fotoativação de laser de psoralenos immunotagged, nos núcleos de células vivas. A fim de abordar questões fundamentais sobre a distribuição aduto e encontros forquilha de replicação, combinamos localização laser com duas outras tecnologias. fibras de ADN são muitas vezes usadas para exibir o progresso de garfos de replicação por imunofluorescência de análogos de nucleósido incorporadas na pulsos curtos. pontos Immunoquantum têm sido amplamente empregados para uma única imagem molécula. Na nova abordagem, fibras de ADN a partir de células portadoras de laser localizada ICLs são espalhados sobre lâminas de microscópio. Os ICLs marcados são exibidos com pontos immunoquantum e the as distâncias inter-lesão determinada. colisões replicação garfo com ICLs podem ser visualizados e diferentes padrões de encontro identificados e quantificados.

Introdução

ADN está sob constante ataque de agentes exógenos, tais como a radiação, luz ultravioleta, toxinas ambientais, produtos de combustão, etc. Além disso, também é atacado por espécies de radicais endógenos produzidos pelo metabolismo oxidativo. Todos estes têm o potencial de perturbar química ou fisicamente a integridade do DNA ^1. Perturbações no genoma pode ativar a resposta DNA danos (DDR), um recrutamento e modificação cascata pós translacional com centenas, se não milhares, de proteínas e microRNAs envolvidos na reparação da lesão, regulação do ciclo celular, apoptose, senescência e vias inflamatórias ^2.

A maioria do nosso informações sobre o DDR vem de estudos com LAP. Isto é em grande parte devido à disponibilidade de tecnologias para a introdução de intervalos, incluindo a sequência de intervalos específicos, em ADN genómico em células vivas ^3. Além disso, o propensity de quebras para induzir focos de proteínas DDR, que podem ser visualizados por imunofluorescência, tem sido muito útil para identificar a cinética e requisitos de proteínas que respondem. Uma das principais tecnologias para estudar a DDR foi introduzido por Bonner e seus colegas, que usou um feixe de laser para dirigir uma faixa de LAP em uma "região de interesse" (ROI) nos núcleos de células vivas ^4. Com efeito, eles criaram um foco longa em que as proteínas do DDR puderam ser identificados por imunofluorescência. Isto foi ilustrado por sua demonstração de uma forte banda de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) nas células de laser exposta. Desde então, a abordagem de laser tem sido utilizada em vários estudos do DDR induzidas por LAP. Embora poderoso e popular, e da origem das imagens de imunofluorescência dramáticas, deve-se notar que na maioria dos experimentos a intensidade do laser é ajustada de modo a produzir resultados observáveis, sem preocupação com a identidade da lesão,densidade, ou espaçamento. Na verdade, pode ser difícil fazer estas estimativas. Assim, eles são largamente ignorado, apesar da multiplicidade de lesões introduzidas no ADN por lasers ^5. Isso contribui para as muitas contradições na literatura ^6.

Em contraste com o LAP, a maioria das modificações químicas de DNA não estimulam a formação de focos discretos de proteínas DDR. Isto é importante à luz de nossa compreensão atual das frequências de lesão. Estimou-se que as células humanas em cultura incorrer em tantos como 50 LAP por ciclo celular, em grande parte formadas durante a fase S ^{7, 8, 9.} Menos são formadas em células não proliferantes. Isto contrasta com o número de perdas de bases nucleoticas ou eventos de modificação, que são na casa das dezenas de milhares por célula / dia ^{1, 10.} Assim, sabemos mais sobreDDR induzida por eventos que são relativamente raros, e muito menos sobre as induzidas por lesões hélice de distorção, que no seu conjunto são muito mais comuns.

A fim de abordar questões sobre a resposta celular ao covalentes modificações do DNA genômico, queríamos trabalhar com uma hélice distorcendo aduto de DNA que tinham actividade de indução DDR inerente. Além disso, para facilitar a concepção experimental e interpretação estávamos interessados ​​em uma estrutura cuja introdução pode ser controlada em relação ao tempo e era passível de visualização. Nesse sentido, desenvolvemos uma estratégia baseada em psoraleno. Os psoralenos são bem caracterizado intercaladores de ADN fotoactivos que favorecem 5' TA: AT locais. Ao contrário de outros agentes de reticulação, tais como mostardas de azoto e a mitomicina C (MMC) eles não são de DNA reactivo a menos expostos ao longo de onda de UV (UVA) luz. As moléculas intercalares reagir com bases de timina em cadeias opostas para produzir hélice distorcer reticulações intercadeias (ICLs) ^11. Com o psoraleno trimetil usadas nas nossas experiências maior parte dos produtos são relativamente poucas, ICLs monoaductos são gerados (menos do que 10%) ^{de 12,} e ligações cruzadas entre as bases intracadeia adjacentes numa cadeia não são formados. Porque eles são blocos poderosos para a replicação e transcrição, psoraleno e outros agentes de reticulação, como cis-platina e MMC, são comumente utilizados na quimioterapia. Assim activado psoraleno estudos que se seguiram à activação da RDA por uma estrutura de distorção hélice, e também uma percepção sobre a resposta celular a um composto com importância clínica.

Nós sintetizado um reagente em que psoraleno trimetil foi ligada à digoxigenina (Dig), um esterol vegetal não encontrado em células de mamíferos e frequentemente utilizado como um immunotag. O requisito para fotoactivação permite a localização por luz laser (365 nm) de ICLs psoraleno em ROI definida em núcleos em células vivas. Estes podem ser exibidos por immunofluorescence contra a tag Dig. Reparação do ADN e proteínas de DDR apareceu nas listras do laser de localizadas ICLs ^{13, 14.}

A DDR activado pelas intensidades elevadas laser usado para produzir LAP pode ser devido a danos isolado ou agrupado ^{15, 16.} Por consequência, a relevância dos resultados destas experiências a lesões que ocorrem naturalmente, presentes em concentração muito mais baixa, é incerto. Para abordar questões semelhantes sobre a frequência aduto psoraleno e espaçamento no DNA, aproveitamos a tecnologia de fibra DNA ¹⁷ e pontos immunoquantum. Pontos quânticos são muito mais brilhantes do que corantes fluorescentes e não são branqueados pela exposição à luz. Assim, eles são frequentemente utilizadas para uma única molécula de imagem ^18, um pedido para que os corantes fluorescentes não são suficientemente brilhante. ADN fibras individuais pode ser esticada em glass lâminas e pode ser apresentado por imunofluorescência contra análogos de nucleósido incorporadas durante incubações anteriores para a célula de colheita. Nós células tratadas com Dig-psoraleno e exposto a irradiação para ROI micro laser. As fibras foram preparados a partir das células e aductos de DIG-psoraleno individuais poderia ser visualizado com os pontos immunoquantum. A exposição das células a análogos de nucleósidos para períodos de tempo relativamente curto (20-60 minutos) permite a visualização de tractos de replicação na vizinhança dos ICLs a laser localizada.

Protocolo

1. Preparação de Dig-TMP

1. Misturar 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-clorometil-4,5' , 8-trimetilpsoraleno e 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina em uma seco 25 mL redondo -bottom frasco sob azoto. Adiciona-se 10 mL de tolueno e refluxo por 12 h. Remover o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida.
   1. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna intermitente através de gel de sílica. Elui-se a coluna com clorofórmio, metanol e solução de amoníaco a 28% (9: 1: 0,5). Evapora-se o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida, e recuperar o puro 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', 8-trimetilpsoraleno como um amarelo pálido viscoso líquido.
   2. Misture 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', 8-trimetilpsoraleno com 5 mg (0,008 mmoles) de éster de NHS em digoxigenina um balão de fundo redondo seco, sob azoto. Adicionar 0,5 mL de dimetil formamida anidra (DMF) umad 3,4 mL de t rime ti lamina e agita-se a 50 ° C durante 18 h.
   3. Remover o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida.
   4. Dissolve-se o resíduo numa quantidade mínima de diclorometano. Aplicar a solução em 2 pontos uL horizontalmente através da parte inferior de uma placa de camada fina preparativa com gel de sílica como uma fase estacionária. Executar a TLC preparativa em clorofórmio: metanol: hidróxido de amónio a 28% (8: 1: 0,1).
   5. Mascarar a placa, excepto para as bordas verticais e identificar a banda de produto com o curto comprimento de onda UV a 254 nm da lâmpada. Raspe o produto a partir da placa com uma espátula e isolar o produto puro utilizando clorofórmio: metanol: hidróxido de amónio 28% (8: 1: 0,1) mistura.
   6. Remover os solventes num evaporador rotativo sob pressão reduzida. Dissolve-se os peletes residuais em 1 mL de 50% de EtOH: _H2O, dispensam em 50 aluotas em tubos de 1,5 mL (~ 20 Alíquotas) e seco num evaporador centrífugo até que todo o solvente é evaporado (~ 3 h).
   7. Redissolve-se cada aliquota de 200 uL de 50% de EtOH: H ₂ O e seco de novo em um evaporador centrífugo. Dissolve-se cada aliquota de novo em 200 ul de 50% de EtOH: _H2O, seco em um evaporador e armazenar centrífugos peletes a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
2. Para utilização, dissolve-se o sedimento em 50 mL de 50% de EtOH: _H2O Prepara-se uma diluição 1: 100 da dissolvido Dig-TMP em H ₂ O e medir a OD a 250 nm. O coeficiente de extinção de Dig-TMP é 25.000. A solução é estável durante cerca de um mês quando armazenada a -20 ° C. Verificar a concentração medindo a OD a 250 nm antes de cada utilização.
   1. Calcular a concentração de estoque: Abs x 100 x10 ^6/25000 = concentração (em uM). Tipicamente, a solução de reserva é cerca de 3 mm. É importante estar neste intervalo, a fim de minimizar o volume de EtOH adicionado ao meio.

2. Laser localizadas DIG-TMP ICLs

1. PElocalização do laser rform com um microscópio confocal com um laser de azoto SRS (337 nm) bombeada através de uma célula de corante emissor de uma linha de 365 nm e disparando 3 ns pulsos a 10 Hz, com uma potência de 0,7 nW.
2. Adicione uma marca vertical no lado de um vidro de 35 milímetros de fundo prato de cultura de células com uma caneta de marcação. Arranhar uma cruz no centro do vidro sobre a superfície de cultura com uma caneta de diamante de tal modo que a tira preta no lado do prato está na parte superior de um braço da cruz. A cruz é marcada sobre a superfície de crescimento do vidro de modo que as células e vai estar no mesmo plano focal.
3. Esterilizar a placa após a marcação com uma lavagem de 70% de EtOH. A seco antes de células de galvanização.
4. células da placa (estirpes de laboratório padrão, tais como HeLa ou U2OS), em cruz marcada placas de cultura de um ou dois dias antes. Celular deve ser dividindo ativamente e 50-70% confluentes no dia do experimento. Incubar 24 h com 1? M de 5-cloro-2-desoxiuridina (CldU) ao ADN rótulo uniformemente.
5. AdicionarDig-TMP em 50% de EtOH: _H2O a meio de cultura celular a uma concentração final de 20 uM. Traga o meio para 37 ° C. Mudar o meio sobre as células e colocar na incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 30 min para permitir a Dig-TMP-se equilibrar.
6. Enquanto as células são incubação, estabelecer x / y coordenadas do campo de visão, em que o laser é activo. Siga o procedimento de calibração do fabricante em que o laser é dirigido pelo software para gravar uma lâmina de vidro espelhado ao longo de uma linha horizontal e diagonal. As duas linhas definem os limites do campo em que o laser pode atingir um alvo.
7. Colocar a placa na câmara ambiental, a 37 ° C com CO ₂ e controlado de humidade, sobre a platina do microscópio e concentrar-se com o objectivo de óleo 60X na intersecção da cruz.
8. Dirigir o feixe de laser de 365 nm a uma ROI, estabelecido pelo investigador com a ferramenta de forma no software, para formar uma faixa de 3 &# 181; mx 0,6 m. O contorno da ROI é colocado pelo cursor em núcleos de células localizadas na proximidade imediata da intersecção da cruz. Ajustar o plano focal z para alvejar a meio caminho do laser através do núcleo. Use um laser na faixa de 350-370 nm. 405 nm lasers não pode induzir ligações cruzadas ^19.
   NOTA: Nós localizar a ROI em áreas fora da nucleoplasmic nucléolos, que pode ser distinguido do nucleoplasma em contraste de interferência diferencial de imagem (DIC).
9. Verificar o foco ea atividade do laser, aumentando a potência para um nível suficiente para eliminar uma célula (a célula vai escurecer e depois desaparecem). Esta é uma importante de diagnóstico para um percurso de luz desimpedida para o laser através do microscópio e em seguida, através da lamela e para dentro das células.
   1. Reduza a potência para apenas o suficiente para ativar o psoraleno eo DDR induzida ICL (este deve ser determinado empiricamente para cada laser / microscope combinação). Use uma configuração intensidade do laser (1,7% aqui) que não ativar o DDR na ausência de psoraleno (monitorado pela formação de γ-H2AX).
      NOTA: Esta é uma determinação importante e as configurações podem necessitar de ajuste, se a fonte de laser ou um componente no caminho da luz é alterada. Seguir a acumulação de GFP proteínas marcadas de reparação, tais como XPC ou FAN1, ambos os quais são rapidamente recrutados (em segundos) para as tiras de psoraleno de laser, mas não ao ROI exposto a isoladamente o laser. Algumas proteínas da DDR aparecer dentro de segundos, enquanto vários minutos podem ser necessários para os outros. É necessário realizar determinações curso de tempo para cada proteína de interesse. Observamos também que em células que não foram expostas ao laser não há faixas de proteínas que respondem.
10. Depois de todas as células em um campo ter sido alvo mover a placa para um novo campo, permanecendo perto da intersecção da cruz.
11. Em experimentos concebidos para determine a distribuição de distâncias inter-lesão expor as células ao laser em 20-25 campos 4-5 (células / campo) em torno da intersecção. A fim de analisar os padrões de replicação na vizinhança dos ICLs localizadas incubar as células com 10? M de 5-iodo-2-desoxiuridina (IdU), após o disparo do laser.
    NOTA: O tempo de incubação com IdU é um tanto arbitrária. Nós temos utilizado tão curto quanto 20 min e desde que 60 minutos (ver abaixo). pulsos mais longos (algumas horas) muitas vezes resultam em várias extensões de replicação coalescentes, perdendo assim a oportunidade de imagem o progresso de garfos individuais. Em algumas experiências ces são rotulados com CldU durante 24 h para maneira uniforme ADN etiqueta antes da exposição a Dig-TMP seguido por marcação por pulsos de tractos de replicação.

3. Colheita de Células e Alongamento de Fibras de DNA

1. Remova a placa do palco, remover o meio, e lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover a solução de PBS. Colocar uma gota de 10 ul de uma tripsina comercial/ Solução de EDTA na intersecção da cruz no meio da superfície de vidro.
2. Incuba-se durante 3-4 minutos à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, extrair a solução de tripsina com as células destacadas para a ponta da pipeta. Não há necessidade de neutralizar a tripsina.
3. Coloque a gota de tripsina / EDTA com as células a uma extremidade de uma lâmina de microscópio de vidro silanizado. Lisar as células e libertar o ADN por adição de 10 uL de solução de SDS a 0,5% e incuba-se durante 3-4 minutos à temperatura ambiente misturando suavemente com a ponta da pipeta, permitindo que a periferia da piscina para secar.
4. Inclinar a corrediça 20º e permitir que o líquido escorra para a extremidade. As fibras de ADN são estendidos / esticadas pelas forças hidrodinâmicas do líquido que se escoa. Deixe a seco lâminas de ar (~ 10 min) e fixar em 3: 1 metanol / ácido acético durante 10 min. Remova os slides da solução de correção e ar seco novamente. Neste ponto, eles podem ser armazenados indefinidamente em EtOH a 70% a -20 ° C. Na remoção do EtOH 70% deixar secar ao ar antes de a nepasso xt.
5. Lavagem das lâminas em PBS, e em seguida, desnaturar em HCl 2,5 M durante 1 h à TA. Este tratamento depurinates ADN tornando as nucleobases halogenados incorporadas facilmente acessíveis aos anticorpos.
6. Neutraliza-se as lâminas em Tris-HCl a 0,4, pH 7,4. Lavar duas vezes em PBS / 0,5% de Tween-20 (PBST), durante 5 minutos cada.
7. Bloco de lâminas com albumina 5% de soro de bovino (BSA) e soro de cabra a 10% em PBS. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme para espalhar uniformemente a solução de bloqueamento sobre a lâmina e incubar durante 1 h à TA.
8. Pipeta de 100 uL de diluição 1: 200 em solução de rato anti-bromodesoxiuridina bloqueio (especificamente detecta CldU) anticorpo primário para cada lâmina. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme para espalhar a diluição de forma uniforme sobre a lâmina e incubar numa câmara húmida durante 1 h à TA. Remover o parafilme e lavar as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada.
9. Pipetar 100 L de diluído (1: 100) de cabra anti-rato Alexa Fluor 647 em solução de cada lâmina de bloqueio. Cubra odesliza suavemente com um parafilme e incubar durante 45 min à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada.
10. Pipetar 100 L de diluída (1:40) de ratinho anti-bromodesoxiuridina (detecta LDU e CldU Esta especificidade dual requer o bloqueio de CldU pelo rato anti BrdU na incubação prévia.) Anticorpo primário e anticorpo de coelho anti-DIG (1: 200 ) em solução a cada lâmina de bloqueio. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme e incubar numa câmara húmida durante 1 h à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada.
11. Pipetar 100 L de diluído (1: 100) de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 ANDC (1: 5000) sonda anti-coelho de cabra (por exemplo, Qdot 655) em solução de bloqueio a cada lâmina. Cobrir as lâminas cuidadosamente com parafilm e incuba-se durante 45 min à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada.
12. Drenar o excesso de PBST para uma toalha de papel. Adicionar 50 uL de antifade meio de montagem para cada lâmina e cobertura com uma lamela. Imagem ou loja paranão mais do que 48 h a -20 ° C.

4. imagem Fibra por microscopia de fluorescência

1. Realizar a aquisição de imagens por meio de uma objectiva 63X de um microscópio invertido com uma roda de filtros totalmente motorizado ligado com FITC, Cy5 e Q do ponto 655 de detecção. O filtro de excitação é de 425 nm, e o filtro de emissão é de 655 nm com 20 nm centrada no pico de emissão ^20.

Resultados

ICLs laser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) pode ser exibido através de imunofluorescência contra o Dig-tag ligada ao psoraleno. Embora o laser pode ser dirigido para atacar em qualquer uma área de contorno, listras não são formas "naturais" em células, e os sinais legítimos pode ser facilmente distinguido de artifícios devidos a ligação não específica por anticorpos primários ou secundários. Este recurso é útil quando se utiliza anticorpos infer...

Discussão

A tecnologia de localização de laser requer o uso de células aderentes com núcleos que são visíveis em microscopia de campo claro. Tentámos para fixar as células não aderentes, tais como linfócitos primários, ou células cultivadas fracamente aderentes, tais como AD293, para a superfície de vidro com as preparações adesivas de células, tais como polilisina ou colagénio, ou misturas mais complexas. Embora esses tratamentos podem ligar-se as células à superfície, nós achamos que eles geralmente ficam a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107