Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Resumo

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Resumo

A resposta ao dano do DNA orquestrou o reparo de lesões de DNA que ocorrem espontaneamente, são causadas por estresse genotóxico ou aparecem no contexto de quebras de DNA programadas em linfócitos. A Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM e Rad3-kinase (ATR) e a subunidade catalítica de DNA-dependente Protein Kinase (DNA-PKcs) estão entre os primeiros que são ativados após a indução do dano do DNA, e são Reguladores centrais de uma rede que controla o reparo do DNA, a apoptose e a sobrevivência celular. Como parte de uma via supressora de tumor, ATM e ATR ativam p53 através da fosforilação, regulando assim a atividade transcricional de p53. O dano do DNA também resulta na formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) que representam complexos de sensor de dano de DNA e proteínas de reparo que se acumulam nos locais de dano do DNA, que são visualizados por microscopia de fluorescência. A co-localização de proteínas em IRIFs, no entanto, não implica necessariamente dInterações proteína-proteína diretas, uma vez que a resolução da microscopia de fluorescência é limitada.

In-situ Proximity Ligation Assay (PLA) é uma técnica inovadora que permite a visualização direta de interações proteína-proteína em células e tecidos com especificidade e sensibilidade sem precedentes. Esta técnica é baseada na proximidade espacial de anticorpos específicos que se ligam às proteínas de interesse. Quando as proteínas interrogadas estão dentro de ~ 40 nm, uma reacção de amplificação é desencadeada por oligonucleótidos que são conjugados com os anticorpos e o produto de amplificação é visualizado por marcação fluorescente, produzindo um sinal que corresponde à localização subcelular das proteínas que interagem. Usando a interação funcional estabelecida entre ATM e p53 como exemplo, é demonstrado aqui como o PLA pode ser usado em culturas de células suspensas para estudar as interações diretas entre proteínas que são partes integrantes da resposta de danos ao DNA.

Introdução

O dano do DNA desencadeia uma série altamente regulada de eventos envolvendo interações proteína-proteína e modificações pós-tradução que garantem o reparo eficiente e rápido do DNA, salvaguardando assim a integridade genômica ¹ . Tipicamente, o reparo do DNA é estudado em células expostas à radiação ionizante, monitorando a formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) por microscopia de fluorescência (confocal). Muitas proteínas de detecção e detecção de dano do DNA formam IRIFs, que representam complexos de proteínas que nucleam em locais de cromatina sustentando dano de DNA ^{2 , 3} . A localização e a resolução dos IRIF ao longo do tempo fornecem uma visão importante da organização espaciotemporal do reparo do DNA e podem indicar o envolvimento de diferentes caminhos de reparo do DNA. A natureza do dano do DNA eo estágio do ciclo celular em que o dano é atingido determinam qual caminho de reparo do DNA é ativado. Fo Por exemplo, em células ativamente envolvidas na replicação de DNA (fase S), a recombinação homóloga (HR) é a via de reparo do DNA dominante, enquanto que nas células na fase G1 ou G2 / M do ciclo celular, a célula não- É predominante a via de reparo homóloga de junção final (NHEJ). Um dos primeiros eventos após o dano do DNA é a ativação das cinases sensíveis ao dano do DNA Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que é principalmente ativa nas fases G1 e G2 / M do ciclo celular e regula o NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR), que atua em fase S ativando a FC. Ambos ATM e ATR são quinases muito pleiotrópicas que fosforilam muitas proteínas envolvidas no reparo do DNA, morte celular e sobrevida ⁴ . Ambas as quinases demonstraram fosforilar e ativar a proteína supressora de tumores p53 após a exposição ao estresse genotóxico, indicando que essas cinases são mediadores a montante de um eixo de sinalização de supressão de tumor fundamental"Xref"> 5 ^{, 6} .

A formação e a composição dos IRIFs são tipicamente avaliadas pela determinação da co-localização de diferentes proteínas usando coloração e microscopia de imunofluorescência de duas cores, no entanto, nem todas as proteínas que fazem parte dos complexos de proteínas de reparo formam IRIFs, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Além disso, a microscopia de imunofluorescência (confocal) é limitada pelas propriedades de difracção da luz, resultando em uma resolução espacial bastante fraca de cerca de 200-300 nm, excedendo o tamanho da maioria das estruturas subcelulares, o que essencialmente proíbe a interrogação direta das interações proteína-proteína ao O nível molecular. Como tal, a co-localização de padrões de coloração de imunofluorescência como detectada por microscopia de fluorescência (confocal) não é necessariamente indicativa de interações diretas proteína-proteína. Recentemente, novas tecnologias de super-resolução foram desenvolvidas, como a estrutura tridimensionalMicroscopia de iluminação tingida (3D-SIM) ⁷ , que foi utilizada com sucesso para estudar a formação de IRF de 53BP1 e BRCA1 em detalhes de nano-escala, revelando as características de distribuição espacial dessas proteínas que não foram detectadas por microscopia confocal de varredura a laser ⁸ .

Vários outros métodos podem ser usados ​​para detectar interações proteína-proteína in vivo , tais como métodos de co-imunoprecipitação, pull-down e abordagens de rastreio de dois híbridos de fermento. No entanto, essas técnicas são bastante pesadas, exigem grandes quantidades de células ou proteínas ou envolvem a superexpressão de proteínas, que introduzem artefatos experimentais. Mais recentemente, desenvolveu-se uma nova técnica que permite a visualização e quantificação de interações proteína-proteína in situ ( isto é, nas células e nos tecidos), denominada Ensaio de Ligação Proxima (PLA) ^{9 , 10} . PrOs anticorpos imateriais que reconhecem duas proteínas de interesse são detectados por anticorpos secundários que são conjugados com oligonucleótidos (as chamadas sondas PLA). Se os dois anticorpos secundários diferentes forem suficientemente próximos devido às interacções entre as proteínas reconhecidas pelos anticorpos primários, os oligonucleótidos conjugados hibridam e podem ser ligados para formar um substrato de ADN circular fechado. Este substrato circular é subsequentemente amplificado por amplificação do círculo circulante e visualizado com oligonucleótidos complementares conjugados com fluorochrome. Usando PLA, a localização subcelular da interação proteína-proteína é preservada à medida que o produto de amplificação do círculo de rolamento com marcação fluorescente permanece ligado às sondas PLA. A resolução deste ensaio é <50 nm, com base no achado de que o diâmetro de um anticorpo é de aproximadamente 7-10 nm ¹¹ . A amplificação do círculo circulante só pode ocorrer no caso de dois pares de anticorpos (primário + segundo planoDary) interagem fisicamente dentro do perímetro que é definido pelo seu tamanho (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). O passo de amplificação do sinal aumenta a sensibilidade do ensaio de PLA e permite a detecção de interações de proteínas raramente expressas. O PLA gera padrões de sinais pontuais e focos que podem ser quantificados por célula, pelo qual a variação intra e intercelular nas interações proteína-proteína pode ser avaliada.

A formação e composição de complexos de reparo de DNA e IRIFs são principalmente estudadas em linhas celulares aderentes, como a linha celular epitelial de osteossarcoma de osso humano U2OS, a linha de células de rim embrionárias humanas HEK293 e a linha de células epiteliais de pigmento retiniano RPE-1, Crescente e fácil de transfectar. As culturas de células de suspensão, tais como linhagens linfóides e mieloides, são usadas com menos frequência, uma vez que estas são menos favoráveis ​​à transfecção e, em geral, não aderem aos lamínulas, exigindo, assim, uma alternativa adicionalEps para imagens. A resolução do dano do DNA é, no entanto, muito relevante no contexto de malignidades linfóides e mielóides, uma vez que a resposta ao dano do DNA é freqüentemente afetada por aberrações genômicas (excitadores) nesses tumores, desempenhando um papel fundamental na transformação maligna de linfóides e mieloides normais ( Células progenitoras ^{12 , 13 , 14} .

Este protocolo descreve como o PLA pode ser usado para avaliar e quantificar as interações proteína-proteína após a indução do dano do DNA em culturas de células em suspensão. Aqui, o PLA é realizado para determinar e visualizar as interações entre ATM e p53 após o dano do DNA em células de leucemia de células B humanas que são induzidas a sofrer uma parada do ciclo celular em fase G1. De notar que o protocolo aqui apresentado não se restringe ao estudo de interações ATM e p53 em células de leucemia detidas por G1, mas também pode ser usado para visualizar outras proteínas-proteína interativaEm vários tipos de células e culturas de células suspensas.

Protocolo

1. Tratamento de indução de células e dano de DNA

1. Cultive as linhas celulares linfoblásticas agudas BCR-ABL + B celulares BV173 ou SUP-B15 em IMDM suplementado com FCS a 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL em 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ . Conte células e placa a 2 x 10 ⁶ células / mL em placas de 6 poços, a 5 mL / poço.
   NOTA: Opcionalmente, as linhas celulares de suspensão de várias origens podem ser usadas.
2. Para prender as células BCR-ABL + B-ALL na fase G1 do ciclo celular, adicione 5 μM de metanossulfonato de imatinib (STI571) e incube durante a noite.
   1. Opcionalmente, omita esse passo ao estudar as interações proteína-proteína ao longo do ciclo celular ou em tipos de células BCR-ABL-negativas.
3. Induzir o dano do DNA adicionando 50 ng / mL de neocarzinostatina (NCS) à cultura e incubar durante 2 h.
   1. Alternativamente,Induz o dano do DNA irradiando as células usando uma fonte radioativa [ ¹³⁷ Cs] a 0,5 Gy / min, a uma dose de 5 Gy. Após a irradiação, deixe a célula se recuperar durante 2 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ .
4. Opcionalmente, para avaliar o envolvimento da atividade de cinase ATM em resposta ao dano do DNA, adicione 5 μM do inibidor de quinase ATM KU55933 antes da adição de NCS ou o tratamento de irradiação.
5. Prepare 1x PBS + 10% de BSA colocando 5 g de fração-V BSA em cima de 50 mL de 1x PBS em uma taça ou balão Erlenmeyer, e deixe-se sentar à TA até BSA dissolver. Não agite ou mexa, pois isso irá causar espuma extensiva. Filme lentamente através de um filtro de 0,22 μm e continue com gelo.
6. Coloque células e lave duas vezes com 1x PBS gelado. Contar as células e ressuspender a 2 x 10 ⁶ / mL em 1x PBS + BSA a 10%. Mantenha as células no gelo.

2. Cytocentrifugação, Fixação e Permeabilização

1. Prepare o4% de solução de paraformaldeído em 1x PBS recém-adicionada. Adicione 2 g de PFA a 50 mL de 1x PBS e incube em um banho de água com agitação a 55 ° C até a solução ficar limpa. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm e armazene na RT até o uso.
   NOTA: Opcionalmente, o fixador de 4% de PFA pode ser armazenado congelado a -20 ° C. Após o congelamento, descongelar apenas uma vez para uso. Caso contrário, a solução 4% PFA no PBS pode ser comprada diretamente.
2. Pulverize cuidadosamente lâminas de microscopia de 76 mm x 26 mm com tecido sem fiapos e desengordem-nas colocando em etanol a 96% em um frasco de Coplin por 5 min. Deixe a microscopia deslizar para secar ao ar por 10 min.
3. Monte as lâminas de microscopia nos funis de citostas / citologia com uma área de 6 mm. Pré-revestir os slides por pipetagem de 50 μL de 1x PBS + BSA a 10% em cada funil e centrifugar durante 1 min a 500 rpm.
4. Adicionar 100 μL da suspensão celular (igual a 0,2 x 10 ⁶ células) a cada funil e centrifugar durante 5 minutos a 500 rpm. Para cada combinação de anticorpos, aoSão necessárias 4 preparações (experiência com dois anticorpos, dois controles de anticorpos simples, sem controle de anticorpos).
5. Desmonte cuidadosamente os funis e certifique-se de não tocar nos pontos. Proceda imediatamente à fixação da amostra.
   1. Opcionalmente, deixe as lâminas secar ao ar durante pelo menos 30 min. Após a secagem ao ar, envolva os lâminas individualmente em papel alumínio e guarde-a a -20 ° C até o uso. Ao usar preparações congeladas, assegure-se de descongelar as lâminas enroladas em uma toalha de papel para evitar condensação aberta sobre as lâminas.
6. Desenhe um círculo (diâmetro aproximado de 15-20 mm) ao redor do local usando um bloqueador de líquido de caneta PAP (dica de 5 mm).
7. Adicione 50 μL de solução de fixação de 4% de PFA a cada mancha e incube durante 30 min à TA.
8. Lave as células 3 vezes durante 5 min com 1x PBS em um frasco de Coplin à RT com agitação suave.
9. Seca as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos e remova o máximo de líquido do local com um piPet sem tocar no local, ou inclinando o slide. Adicionar 50 μL de Triton-X a 0,25% em 1x PBS a cada ponto e incubar durante 10 min à TA sem agitação.
10. Lave os slides 3 vezes durante 5 minutos em ~ 50-60 mL de Tween-20 a 0,05% em TBS (TBS-T) em um frasco de Coplin à RT com agitação suave. 10 slides podem ser processados ​​simultaneamente desta forma.

3. Bloqueio e Incubação primária de anticorpos

1. Toque fora o TBS-T e retire as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos. Remova o máximo possível de líquido do local usando uma pipeta sem tocar no local ou inclinando o slide. Em breve vórtice a solução de bloqueio e adicione uma gota (~ 40 μL) a cada ponto. Incubar durante 1 h a 37 ° C numa câmara humidificada pré aquecida.
2. Prepare o coquetel de anticorpos misturando o cabra anti-ATM a 1: 1000 e o coelho-anti-fosfo-Ser15-p53 a 1: 100 em diluente de anticorpo comercial, diluente de anticorpo vortex antes da utilização. Para o experimento de controleTs, preparar diluições de anticorpos contendo apenas a cabra anti-ATM e apenas o anticorpo anti-fígado-Ser15-p53 do coelho (controles de anticorpos únicos).
3. Toque a solução de bloqueio, mas tome cuidado para não deixar as células secar antes de adicionar as diluições de anticorpos. Adicionar 30 μL de cada diluição de coquetel de anticorpos e incubar numa câmara humidificada durante a noite a 4 ° C.
4. Prepare in situ Wash Buffer A e Wash Buffer B dissolvendo o conteúdo de uma bolsa de tampão A e Buffer B em um volume final de 1.000 mL de água cada.
   1. Alternativamente, prepare o tampão de lavagem A dissolvendo 8,8 g de NaCl, 1,2 g de Tris-base e 0,5 mL de Tween-20 em 800 mL de água. Ajuste o pH para 7.4 usando HCl e adicione-se a um volume final de 1.000 mL.
   2. Alternativamente, prepare o tampão de lavagem B dissolvendo 5,84 g de NaCl, 4,24 de Tris-base e 26,0 g de Tris-HCl em 500 mL de água. Ajuste o pH para 7,5 usando HCl. Adicione água a um volume final de 1.000 mL.
   3. FiltroAmbas soluções através de um filtro de 0,22 μm.
5. Lave as lâminas 2 vezes durante 5 minutos com 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à temperatura ambiente com agitação suave.

4. Sondas PLA, ligadura e amplificação

1. Prepare as sondas de PLA diluindo o anti-cabra PLUS e o anti-coelho MINUS tanto 1: 5 no diluente de anticorpo comercial. Toque no 1x tampão de lavagem in situ A das lâminas e adicione 30 μL da mistura da sonda PLA a cada ponto. Incube 1 h a 37 ° C numa câmara humidificada pré-aquecida.
   NOTA: Qualquer combinação de sondas de anticorpos secundários PLUS e MINUS PLA pode ser usada (anti-mouse, anti-coelho, anti-cabra), desde que os anticorpos primários aplicados sejam criados em diferentes espécies e a combinação de sondas de PLA deve sempre Contém uma sonda PLUS e uma sonda MINUS.
2. Lave as lâminas 2 vezes durante 5 min com ~ 50-60 mL 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à RT com agitação suave.
3. Prepare a solução de Ligação-Ligase em gelo adicionando 1 μL de Ligase a 39 μL de solução de Ligação e adicione 40 μL de solução Ligação-Ligase a cada ponto. Incubar 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada pré aquecida.
4. Lave os slides 2 vezes por 5 min com ~ 50-60 mL 1x tampão de lavagem in situ A em um frasco de Coplin à TA com agitação suave.
5. Prepare a mistura Amplification-Polymerase em gelo diluindo a solução de estoque de amplificação 1: 5 em água. Em seguida, adicione 0,5 μL de polimerase a 39,5 μL de 1x solução de amplificação para cada ponto.
   NOTA: Os reagentes de amplificação são sensíveis à luz e devem ser protegidos contra exposição direta à luz. O reagente de amplificação vem em quatro cores diferentes (RED: excitação 594 nm, emissão 624 nm; FarRED: excitação 644 nm, emissão 669 nm; LARANJA: excitação 554 nm, emissão 576 nm; GREEN: excitação 501 nm, emissão 523 nm), Certifique-se de que a configuração de microscopia disponível tenha sPossíveis propriedades de excitação e filtros para criar imagens dessas cores.
6. Toque fora 1x tampão de lavagem in situ A e adicione 40 μL de mistura de Amplificação-Polimerase por local. Incubar durante 100 minutos a 37 ° C numa câmara humidificada pré-aquecida.

5. Montagem e Imaging

1. Prepare 0,01 x tampão de lavagem in situ B adicionando 1 mL de 1x tampão de lavagem B a 99 mL de água.
2. Toque fora a mistura Amplificação-Polimerase e lave as lâminas 2 vezes durante 10 min com 1x tampão de lavagem in situ B em um frasco de Coplin à RT com agitação suave.
3. Lave as lâminas 1 min em tampão de lavagem 0,01x B.
4. Toque o excesso de 0,01 x tampão de lavagem B e seque as lâminas em torno das manchas com um tecido sem fiapos. Remova o máximo possível de líquido do local usando uma pipeta sem tocar no local ou inclinando o slide.
5. Diluir o meio de montagem contendo DAPI 1: 5 em meio de montagem sem DAPI para evitar o excesso de núcleos.
6. Adicione 25-30 μL de meio de montagem contendo DAPI 1: 5 para uma lamínula de 24 mm x 24 mm e pegue a tampa com a corrediça, aplique uma ligeira pressão para garantir que não haja bolhas de ar presas. Selar a lamínula com esmalte de unhas e aguarde pelo menos 15 minutos antes da imagem.
7. Analise as lâminas usando um microscópio de fluorescência (confocal).
   1. Contar o número de sinais PLA pontuais por célula em pelo menos 4 campos de imagem adquiridos (objetivo 20x, contando pelo menos 20 células por condição ou combinação de anticorpos, com base em um cálculo de potência usando uma média antecipada de sinais de 7 ± 5 nas células tratadas, E 2 ± 2 sinais nas células não tratadas, com uma probabilidade de um erro de tipo I de 0,05, e uma potência de 80%, conforme relatado anteriormente ¹⁵ ).
      NOTA: A melhor resolução é conseguida através da aquisição de uma pilha Z e uma deconvolução usando pacotes de software ( por exemplo , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). O signaDeve ser prontamente discernível dentro do perímetro nuclear, conforme definido pela coloração DAPI.
   2. Não conte sinais que aparecem claramente fora dos núcleos. Tipicamente, o tratamento NCS ou a irradiação γ resulta em aproximadamente 5-10 sinais PLA de phosho-p53 / ATM por célula. Os controles de "anticorpo único" podem dar algum sinal de fundo, mas isso não deve exceder 1-2 sinais PLA por 1 em cada 20 células.
   3. Para fins de publicação e apresentação, capture imagens usando um objetivo de óleo de imersão 40X ou 63X. As lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C e devem ser protegidas da exposição à luz.

Resultados

A fosforilação de p53 no resíduo Ser15 mostrou-se dependente da actividade de quinase ATM ¹⁶ . Para demonstrar e confirmar a especificidade da técnica de PLA em preparações de citospina de culturas de células em suspensão, mostra-se que a indução de dano do DNA por 2 h de tratamento NCS de células BCR-ABL + B-ALL presas na fase G1 do ciclo celular Resultou na interação específica entre ATM e phospho-Ser15-p53, como esperado. Os sinais PLA punctivos f...

Discussão

Neste relatório, é demonstrado que PLA pode ser usado para determinar e visualizar a interação específica entre proteínas em culturas de células em suspensão. De notar que o protocolo aqui descrito não se restringe ao estudo de complexos de reparo de DNA, mas também se aplica para visualizar e quantificar outras interações proteína-proteína em culturas de células em suspensão. Mostra-se que a quinasa ATM interage com p53 fosforilada em células BCR-ABL + B-ALL presas em G1 quando expostas a um agente ind...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors