Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Resumo

Este protocolo descreve um método detalhado para a longo prazo ex vivo cultura e imagens ao vivo de um disco imaginal Drosophila. Ele demonstra a diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial dentro do período de 10 h de imagens ao vivo do disco olho. O protocolo é simples e não requer instalação caros.

Resumo

imagens ao vivo fornece a capacidade de monitorar continuamente os processos celulares e de desenvolvimento dinâmicos em tempo real. Drosophila discos imaginais das larvas foram usadas para estudar muitos processos biológicos, tais como a proliferação celular, a diferenciação, o crescimento, a migração, a apoptose, a competição, a sinalização célula-célula, e formação limite compartimental. No entanto, métodos para a ex vivo da cultura a longo prazo e imagens ao vivo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios, apesar de muitos esforços. Recentemente, desenvolvemos um método para o longo prazo ex vivo da cultura e imagem ao vivo de discos imaginais para até 18 h. Além da utilização de uma elevada concentração de insulina no meio de cultura, uma agarose de baixo ponto de fusão também foi utilizado para incorporar o disco para impedir que deriva durante o período de imagem. Este relatório usa os discos olho-antenal como um exemplo. expressão mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 foi seguido para demonstrar que fotorreceptores differenA rotação ommatidial pode ser observada durante um período de 10 h de imagem ao vivo. Este é um protocolo detalhado que descreve este método simples.

Introdução

Os discos imaginais de Drosophila larvais ter sido um sistema experimental favorecida para o estudo de uma grande variedade de mecanismos biológicos. Estes discos invaginar a partir do epitélio embrionário e tornar-se estruturas de saco construídas por duas camadas epiteliais, Peripodial Epitélio (PE) e Disco adequada (DP) ^{1, 2.} As células de discos imaginais proliferam e diferenciam-se progressivamente, durante as fases de larvas e de pupas e, eventualmente, tornar-se as estruturas do corpo adulto. Devido à estrutura de duas camadas plana e simples dos discos imaginais, elas são fáceis de observar quando dissecados a partir de larvas. No entanto, apesar de vários esforços por muitos grupos, os métodos atuais para a cultura de longo prazo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura que pode sustentar o desenvolvimento normal de vários discos imaginais por até 18 h e que permite que imagens ao vivo ³ . O método de cultura pode suportar a diferenciação das células e a migração, mas ele pode suportar a proliferação celular por apenas 7-12 h e não pode suportar o crescimento do disco. A principal diferença no meio de cultura é a elevada concentração de insulina ^3. O método é simples, e não é necessária nenhuma aeração especial ou a circulação média.

Um dos discos imaginais mais estudado é o disco olho-antenal. O olho de Drosophila é construída de aproximadamente 800 ommatidia. Cada omatídeo é composta por oito células fotorreceptoras (R1-R8). No disco olho das larvas, as células fotorreceptoras diferenciam na sequência da passagem da Morfogenética Sulco (MF), que varre o disco olho de posterior para anterior ^{4, 5.} Os fotorreceptores em um omatídeo diferenciar em sequência, começando com R 8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R 1 / R6, e R7 ^6. O ommatidia no dorsal e vemetades ntral do disco olho submetido a uma rotação de 90 ° em sentidos opostos, o que resulta em quiralidade oposta ^{7, 8.} O processo de rotação ocorre em duas etapas: em primeiro lugar, uma rotação de 45 ° começa no e é completada a sexta linha ommatidia atrás do MF; a segunda rotação de 45 ° está concluída em cerca de linha 16 ^{9, 10.} Este estudo utilizou rotação ommatidial, marcado pela R3 / 4-específico mδ0.5-GA4 ^11, para demonstrar a diferenciação celular normal e dinâmica que pode ser observada através deste método para a cultura e vive-imagem do disco olho.

Protocolo

Configuração 1. Pré-experimental

1. Recolhe um ovo de mosca que expressa nuclear proteína fluorescente verde (GFP) sob mδ0.5-Gal4 e cultura a 25 ° C durante 5 dias.
2. Microondas 0,7 g de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) até a agarose estar completamente dissolvida. Manter o gel de baixo ponto de fusão a 0,7% numa incubadora a 37 ° C até à sua utilização.
3. Esterilizar todo o equipamento, incluindo as pinças, tesouras, 42 mm x 0,17 mm lamelas, uma placa de ponto vidro 9 poços, e uma câmara de cultura magnética, com 70% de etanol por mais de 12 h.
4. Prepara-se o meio de cultura ^3: meio de Drosophila de Schneider suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 1,25 mg / mL de insulina. Para evitar a contaminação, preparar a forma de um capuz de cultura de células. Armazenar o meio de cultura preparado, a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês.
5. Limpe a plataforma de dissecção e o experimentador's mãos com etanol a 70% antes de iniciar a dissecção.

Dissecção 2. Disco

1. Air secar todo o equipamento a partir de 70% de etanol.
2. Selecione uma larva de terceiro instar de um frasco mosca. Para evitar a contaminação a partir do frasco de mosca, lavar a larva em 1x PBS, 3x para remover os resíduos.
3. Dissecar a larva limpas em 1 ml de meio de cultura (em RT) na 9-poço da placa de ponto de vidro sob um microscópio de dissecção.
4. Agarrar a larva com um par de pinças em cerca de um terço do caminho a partir da extremidade posterior e mais uma pinça no gancho boca. Puxar as duas pinças em sentidos opostos para libertar os tecidos internos.
   1. Retirar as glândulas salivares, gordura corporal, e a cutícula do complexo olho-cérebro ligado ao gancho boca. Se o cordão nervoso ventral está ainda ligado, cortá-lo afastado com uma tesoura.
5. Utilizar um par de fórceps para agarrar o gancho boca e um par de fórceps para remover uma peça de tecido que connects os cérebros e discos de olho na parte dorsal.
   NOTA: Se esse tecido não é removido, os dois discos olho-antenal será próximos uns dos outros e do cérebro. Os discos oculares, em seguida, não vai ficar na posição horizontal sobre a lamela porque este tecido, o cérebro, e o disco de olho-de antenas irá formar um triângulo.
6. Gire todo o complexo para uma posição ventral-para cima. Remover o filamento que liga o gancho ou disco para o cérebro.
   NOTA: Se o filamento não é removido, o disco olho-antenal será dividida em duas peças, quando o gancho for removido da boca.
   1. Retirar o gancho boca. Tome cuidado para não danificar o disco olho durante o processo.
      NOTA: O disco olho é agora livre no meio e apenas ligado ao cérebro pela haste óptico.

3. montagem

1. Ar seco e montar os componentes da câmara com um x 0,17 milímetros lamela de 42 mm. Anexar uma dupla camada de O-rings para o centro da lâmina de cobertura para segurar thE agarose.
2. Monte a câmara com lamínula. Coloque a lamela de 42 mm x 0,17 mm no receptor de palco. Coloque o O-ring de silício sobre a tampa deslizante. Coloque a base. Bloqueie o cacifo de vedação e coloque a tampa ( Figura 1 ).
3. Transferir cuidadosamente o complexo olho-cérebro dissecado para o centro do O-ring usando uma micropipeta de 20 μL com uma ponta de 10-200 μL.
4. Remover a maior parte do meio e adicionar 12 μL de 0,7% de agarose de baixo ponto de fusão (a 37 ° C) à amostra.
   NOTA: A posição do disco ocular pode ser alterada com fórceps antes da solidificação da agarose. A agarose irá solidificar dentro de 5 min.
   1. Adicionar 1 mL de meio de cultura à temperatura ambiente ao centro do O-ring; Cada O-ring pode carregar até 4 amostras. Certifique-se de que a agarose é colada ao O-ring para evitar a derivação da amostra.
      NOTA: Não é necessária ventilação ou circulação do meio.

4. microscopia confocal

1. Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido confocal durante 30 minutos para equilibrar a temperatura. Isto pode impedir a dispersão do eixo Z durante a imagiologia.
2. Antes de imagens ao vivo de longo prazo, verificar se o tecido está intacta por microscopia de contraste de interferência diferencial.
3. Para evitar a fototoxicidade, utilize uma fonte de laser abaixo de 2 mW. Use uma objetiva de 40X para a imagem latente.
4. 62? M adquirir imagens Z-stack em 12 min a um intervalo óptico de 1? M. Adquirir 40 ciclos de varrimentos ao longo de um total de 10 h. Assegure-se que cada ciclo contém 12 min de imagiologia e 3 minutos de descanso.

Resultados

Neste exemplo, os fotorreceptores R3 / R4 foram marcadas com mδ0.5-GA4 para monitorar a diferenciação de fotorreceptores. mδ0.5-GA4 dirige uma forte express em R4 e expressão mais fraca em R3 ^11, tornando-a um excelente marcador para R3 e R4, bem como para o processo de rotação ommatidial. Em Filme 1, R3 e R4 foram marcadas com GFP. No início da sessão de imagens ao vivo de 10 h, havia 8 linhas de aglomerados ommatidial (Figura 2A e um filme) e 14 linhas de aglomerados ommatidial no final (Figura 2B). A taxa de diferenciação ommatidial foi de 1,67 h por fila, que é próximo da taxa de 1,5-2 h / linha em in vivo discos ^{7, 8, 9, 10, 11,}s = "xref"> ^{12, 13, 14.} Com base nas posições relativas dos R3 e R4, rotação ommatidial ocorrido no disco ex vivo em cultura durante a imagem ao vivo (Figura 2A 'A '', B' e B ''). Um conjunto R3 / R4 único foi marcado com uma esfera em branco do primeiro quadro de filme 2. No início, o eixo R3 / R4 parece ser perpendicular ao equador (Figura 2C e Filme 2). Em seguida, ele parece rodar 15 °, 30 °, 45 ° e no 3 (Figura 2C '), 6 (Figura 2C ''), e 9 (Figura 2C ''') h, respectivamente. Estes dados sugerem que este método pode sustentar a diferenciação de fotorreceptores durante as imagens ao vivo 10 h.

Figure 1: Diagrama esquemático de montagem de câmara. Diagrama esquemático da montagem de câmara de: (1) Coloque a lamela de camada dupla do anel-O-ligado no receptor de fase. (2) Colocar o silício anel de vedação sobre a lamela de cobertura. (3) Colocar a base. (4) Bloquear o armário de vedação. (5) carregar a amostra no centro do anel de vedação e colocar a tampa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: imagem ao vivo de R3 / R4 Diferenciação e rotação. R3 / R4 marcado com mδ0.5-Gal4-expressando GFP forma nuclear durante 10 h de imagens ao vivo. Todos os valores foram capturados a partir de filme 1. (A) A imagem obtida no início. ( > A'-A") imagem ampliada da área de box à esquerda (A') e direito (A"). (B) A imagem obtida no final do período de 10 h. (B'-B") imagem ampliada da área de box na esquerda (B') e direito (B"). (CC '' ') Um par R3 / R4 único (assinalado por uma seta em A') é seguida ao longo do tempo para demonstrar a rotação do par de R3 / R4. Barras de escala = 15? m, 10? m, e 5? M em A, B, e C, respectivamente. Todas as figuras são z projecções de intensidade máxima. A escala de tempo é mostrado em h: min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "target =" _ blank "> Clique aqui para fazer o download deste filme.

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Discussão

Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado para um experimento de imagens ao vivo de longo prazo sobre discos imaginais de Drosophila. Passamos muito tempo praticando a dissecção cuidadosa para evitar danos ao disco e para permitir a fixação do disco perto as lamelas. Tentámos poli-L-lisina (PLL) e baixo ponto de fusão de agarose para segurar o tecido; no final, o de agarose de baixo ponto de fusão, demonstrou maior capacidade para manter o tecido. Embora apenas o disco olho foi usado no presente documento para demonstrar a ocorrência normal de diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial durante o período de imagens ao vivo 10 h, este método também pode ser aplicado a, pelo menos, um outro disco, o disco da asa, como demonstrado em um estudo anterior ^3. Além disso, a preparação de meio de cultura e configuração imagens ao vivo são simples e não exigem aeração ou circulação média.

imagens ao vivo contínuo pode fornecer uma seqüência temporal clara de véspera biológicants. No nosso relatório anterior de diferenciação glia e migração no disco olho, nós fornecemos prova direta de que glia envolvendo diferenciar da glia existente após a migração para o anterior do disco olho ^3. Longo prazo ex vivo cultura permite a rotulagem ativado por laser específico de células, como a foto-conversão da proteína fluorescente KAEDE, para seguir seus comportamentos ^3. Ele também pode acomodar o teste de produtos químicos que são adicionados directamente ao meio de cultura; Assim, ele pode ser usado como uma plataforma de rastreio de drogas. Desde ocorrer algum processo dinâmico dentro de minutos ou segundos, alta resolução temporal é necessária. Para aumentar a resolução temporal, microscopia folha de luz ^{15, 16} ou microscopia de disco giratório ¹⁷ pode ser uma boa opção.

A condição cultura atual não é perfeito. Ele não suporta o crescimento disco. celular proliferation só é suportada por até 12 h ^3. Após 12 h em cultura ex vivo, a taxa de diferenciação de fotorreceptores começa a diminuir ^3. Isto pode ser devido à falta de determinados nutrientes ou hormônios. Uma vez que a principal diferença neste meio de cultura, é a elevada concentração de insulina, a insulina de mamero pode ser parcialmente imitar a função de péptidos endógenos do tipo insulina. A adição de extracto de mosca, a trealose de açúcar no sangue de insectos, e várias concentrações da hormona de muda de 20-hidroxiecdisona, não eram benéficas ^3. No entanto, o período de cultura de 12-18 horas é suficiente para estudar muitos processos de desenvolvimento. Métodos de cultivo alternativos para cultivar discos imaginais larvas foram comparados ^3, e nossa condição de cultura e imagem fornece a janela de tempo mais longo e mais clareza para imagens ao vivo. Embora os discos dentro de larvas vivas e pupas podem ser visualizados diretamente^{18, 19, 20, 21, 22,} a janela de tempo para resolução e observações são limitados. Larvar tardio e discos de pupa podem ser cultivadas durante um longo período de tempo ^{23, 24,} mas os discos passam por morfogénese significativa. Para aproveitar os, discos larvais 2D planas, nosso método de cultivo e de imagem é a melhor solução até agora.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low-melting agarose	AMRESCO	0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	AMRESCO	0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips	PST	G401-42
Schneider’s Drosophila medium	Thermo	21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665
Penicillin-streptomycin	GIBCO	759
Insulin	Sigma	I9278
Culture chamber	PECON		POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective			C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective
Fly strain:nls.GFP	Bloominggton	4775