Um sistema integrado para acionar remotamente a transdução do sinal intracelular por Photoactivation Upconversion Nanoparticle-mediada da quinase

Resumo

Neste protocolo, enjaulado proteína quinase A (PKA), um bioeffector de transdução de sinal de celular, foi imobilizada em uma superfície de nanopartículas, injetada no citosol e ativada pelo upconverted UV luz de irradiação de infravermelho próximo (NIR), induzindo desintegração de fibra de stress a jusante no citosol.

Resumo

Nanopartículas de upconversion (UCNP)-mediada photoactivation é uma nova abordagem para remotamente controle bioeffectors com muito menos fototoxicidade e com penetração mais profunda do tecido. No entanto, a instrumentação existente no mercado não é prontamente compatível com aplicação de upconversion. Portanto, modificar o instrumento comercialmente disponível é essencial para esta pesquisa. Neste trabalho, nós primeiro ilustram as modificações de um fluorímetro convencional e o microscópio de fluorescência para torná-los compatíveis para experimentos de upconversion de fóton. Em seguida, descrevemos a síntese de um infravermelho próximo (NIR)-desencadeada enjaulado proteína quinase A catalítica subunidade (PKA) imobilizada em um complexo UCNP. Parâmetros para microinjeção e NIR photoactivation procedimentos também são relatados. Depois que o PKA-UCNP enjaulado é injetada em células de fibroblastos REF52, a irradiação de NIR, que é significativamente superior ao convencional irradiação UV, dispara eficientemente via PKA de transdução de sinal em células vivas. Além disso, experimentos de controle positivos e negativos confirmar que o pathway induzida por PKA levando à desintegração de fibras de estresse especificamente é desencadeado por irradiação de NIR. Assim, o uso de proteínas modificadas UCNP fornece uma abordagem inovadora para controlar remotamente a luz modulada experimentos celulares, no qual deve-se evitar a exposição directa à luz UV.

Introdução

Proteínas quimicamente modificadas que podem ser fotoativados (por exemplo, as proteínas PKA enjaulado) foram desenvolvidas como um campo emergente na biologia química de forma não-invasiva, manipular processos bioquímicos intercelulares^{1,2 ,3}. Usando a luz como um estímulo oferece excelente resolução spatiotemporal quando activar estas enjaulado proteínas. No entanto, a luz UV pode causar alterações morfológicas indesejáveis, apoptose e dano ao DNA de células^4,5. Daí, desenvolvimentos recentes na concepção dos grupos photocaging focar permitindo que photocleavage sobre o mais longo comprimento de onda ou dois fotões excitação para reduzir fototoxicidade, bem como para aumentar a penetração de tecidos profundos^6,7. Enjaulamento grupos que respondem ao comprimento de onda mais longo, permitindo-nos escolher o apropriado uncaging comprimentos de onda (ou seja, canais) seletivamente ativar bioeffectors quando dois ou mais grupos de enjaulamento estão presentes⁷. Tendo em conta estas características úteis, desenvolver novos grupos de photocaging de luz vermelha é muito importante trabalho upstream em fotoquímicas metodologias para estudos biológicos, que vão desde os mecanismos de reações de controle de atividades celulares⁸de sondagem. Apesar de tudo, um grupo de enjaulamento dois fotões é normalmente muito hidrofóbico devido à estrutura de anel aromático fundido, e um grupo de enjaulamento de luz visível é normalmente organometálico, com ligantes aromáticos. Esta propriedade hidrofóbica/aromático não é adequada quando o bioeffector é uma proteína ou enzima, que desnatura o site da ativação da enzima/proteína e provoca a perda de função, mesmo se a conjugação e fotólise continua a funcionar a nível químico^{2 ,9}.

UCNPs são eficazes transdutores que convertem a luz de excitação de NIR aos raios UV. Esta propriedade única e fascinante de UCNPs ofereceu-se resoluções realistas para enfrentar os desafios associados a fotoativação e desencadeada a liberação controlada de moléculas pequenas, incluindo ácido fólico¹⁰, cisplatina derivados¹¹ , DNA/siRNA¹², copolímero vesículas¹³e partículas ocas¹⁴. No entanto, o melhor de nosso conhecimento, o photoactivation assistida por UCNP de enzimas ou proteínas não foi testado até agora. Porque não há nenhum caso de sucesso do uso de luz vermelha ou NIR a fotoativa uma enzima, recebemos indicações para executar a ativação de uma enzima/proteína de construção composta por complexos enzima enjaulado quimicamente modificado com uma sílica-revestido, acionadas por NIR dopado com lantanídeos UCNP¹⁵. Neste estudo, o UCNP foi conjugada com uma quinase de transdução de sinal reagir rapidamente sob a forma de PKA enjaulado. PKA controla a síntese de glicogênio e regulamento do citoesqueleto que responde a estímulos externos, através de regulamento de adenosina cíclico (cAMP) de fosfato no citosol¹⁶. Estudamos a viabilidade de activação enzimática em educação espacial e temporal em um experimento de celular após a irradiação de NIR. Esta plataforma photoactivation assistida por UCNP é uma nova metodologia para Fotoativar uma enzima usando NIR e evita a resposta de transdução de sinal indesejado de células causada por UV convencional irradiação^2,4.

É muito difícil translocar bioeffectors grande (por exemplo, proteínas) através da membrana celular para controlar a atividade celular. Apesar de partícula-imobilizado proteína pode ser mais fácil para translocar através de endocitose no citosol, endocitose pode ser danificado ou degradada através de uma armadilha de CDDP e a consequente degradação lisossomal^2,4. Mesmo se a proteína enjaulada é ainda funcional após translocação da membrana, os montantes translocados podem não ser suficiente para desencadear a resposta celular^2,17. Em contraste, a microinjeção é uma abordagem direta e quantitativa para entregar grandes bioeffectors para o citoplasma da célula. Além disso, bioeffector UCNP-imobilizado requer upconverted luz para ser ativado. Portanto, a instrumentação óptica requer mais modificação para medir, Visualizar e utilizar a luz upconversion. Neste trabalho, a entrega de um complexo de PKA-UCNP enjaulado para uma célula utilizando microinjeção e as seguintes modificações essenciais de espectroscopia e microscopia para NIR photoactivation será descrita em detalhes.

Protocolo

Nota: O protocolo descreve uma modificação de instrumentação detalhada para photoactivation upconversion assistida, um procedimento sintético para gerar enjaulado PKA-UCNP, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) do UCNP de sílica-revestido e enjaulado amostras de PKA-UCNP, UV e NIR instalação de fotólise, preparação da pilha, microinjeção de PKA-UCNP, um estudo de fotoativação e a coloração de fibra de stress das células REF52.

1. fluorímetro instalação para medição do espectro Upconversion

1. instalar um 4 X da lente objetiva ao lado o titular da cubeta do espectrómetro de fluorescência para que o laser está focado no meio da cuvete.
2. Coloque um sintonizável 0,5 - 8 W 980 nm láser 90° contra a lente objetiva.
   Atenção: O operador precisa ter conhecimento de segurança do laser e usar óculos de laser NIR.
3. Instalar um espelho de reflectância total na interseção feixe luminoso da lente objetiva e laser. Coloque uma placa metal anodizada preta para bloquear a janela da excitação da espectroscopia e proteger as partes interiores.
4. Coloque a cubeta de sílica revestidos de solução UCNP (0,2 - 0,6 mg/mL) no suporte de cubeta para que um feixe luminoso upconversion pode ser visualizado e pode ser usado para ajustar o alinhamento de luz melhor para a instalação do espelho.
5. Interruptor a espectroscopia de modo luminescência com PGTO tensão mais baixa (ajustar para um ajuste maior, se o sinal é muito fraco). Ajustar o espelho para o melhor alinhamento, onde o feixe no meio da cubeta e o pgto pega o sinal mais forte.
6. Medir o espectro de upconversion, após o alinhamento, com a potência desejada. Use um medidor de energia térmica de pilha para construir uma curva de calibração da potência do laser contra a leitura de corrente elétrica na fonte de alimentação do laser. Verificar constantemente o desempenho do laser para certificar-se de que o desempenho está dentro da faixa calibrada.

2. Instalação do microscópio

Nota: A seguinte configuração funciona para microscópios equipados com percurso óptico de duas camadas. Se o usuário pretende instalar um interruptor de luz fonte de excitação na porta traseira para fazer o laser NIR e a lâmpada de iodetos compartilham a mesma porta, o colimador na porta traseira significativamente bloqueará o NIR porque ele é projetado para reduzir o aquecimento da amostra. O usuário deve fazer uma escolha difícil: manter o colimador e sofrem de upconversion muito baixa eficiência, ou remover o colimador e sacrificar a intensidade da luz para a epifluorescência excitação.

Nota: um diagrama de fraque, mostrando o esquema do trajeto da luz para um spectrofluorometer modificado, a microscopia para upconversion luminescência e modo de fotólise NIR e epifluorescência e modo de fotólise de UV e a instalação experimental utilizado para este experimento são ilustrados na Figura 2.

Guia

1. Equip o microscópio de fluorescência com um haleto de metal leve, dirigido na parte de trás porto
   Nota: nesse caminho de luz camada superior onde há uma torre de cubo, uma posição de cubo deve estar vazia para permitir NIR vem o caminho da luz. camada inferior
2. Instalar um diodo 0.5 a 8.0 W 980 nm laser ajustável na porta do lado direito, com o colimador de porta lateral aberta.
   Nota: Isto amplia o laser luz pontual para cerca de 500 µm de diâmetro quando é usado um 10 X da lente objetiva. Remover este colimador resulta em um ponto de luz-escala micrométrica e faz a irradiação de célula NIR impraticável. Este colimador é transparente para NIR.
3. Instalar um espelho dicroico (850 nm curto-pass) e um filtro de excitação (950 nm - passe longo) no caminho luz da camada inferior.
4. Usar uma solução UCNP para visualizar o ponto de luz de NIR. Ajuste a posição do laser para o centro do feixe de luz de NIR no campo de visão para terminar o alinhamento.

3. Preparação e caracterização de PKA-UCNP Caged construir

1. recombinante PKA incubar (9 µM) com 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) em enjaulamento buffer (20 mM Tris-HCl, NaCl de 100 mM e 10 mM MgCl ₂; pH 8,5) para 1-2 h a 25 ° C. Quench a NBB em excesso com 10 mM dthiothreitol (TDT) e em seguida Dialize contra 4-(2-hidroxietil) tampão ácido etanesulfónico-1-piperazina (HEPES) (10 mM, pH 7,5) para remover os reagentes em excesso e sais.
   Nota: O pH da solução de enjaulamento é reduzido de 8,5 para 7,5 durante a diálise com pH HEPES 7.5 para a reação de imobilização subsequente.
2. Mix o lantanídeos sais-Y(CH₃CO₂) ₃ de cloral (99,9%, 0,4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ hidrato (99,9%, 0,2533 g, 0,60 mmol) e Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ hidratado (99,9%, 0,0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) e ácido oleico (12 mL), aquecer a mistura até 115 ° C por 30 min e resfriá-los a 50 ° C. Em seguida, dissolva a mistura de reação em solução metanólica (20 mL) com 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pelota e 0,2964 g (8 mmol) de fluoreto de pelo sonication durante 15 min. aumentar a temperatura de reação a 300 ° C para obter o núcleo UCNP (β-NaYF ₄ : 1.0% Tm ^{3 +} / 30% Yb ^{3 +}) nanopartículas.
3. Dissolver as núcleo nanopartículas (25 mg) com CO-520 (0,5 mL) em ciclo-hexano (10 mL). Adicionar amoníaco (wt 30% v/v, 0,08 mL) e tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) e aplique a agitação constante por 12 horas a temperatura ambiente para obter o silicone revestido β-NaYF ₄: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} núcleo nanopartículas.
4. Incubar o PKA (6 nmol) ou enjaulado PKA (6 nmol) com UCNP (1 mg) ¹⁵ em tampão HEPES (10 mM, pH 7,5) a 4 ° C por 3 h imobilizar o PKA em sílica revestidos UCNP através de interações eletrostáticas.
5. Filtrar a mistura usando filtro de PVDF (0,45 µm), centrifugar 17.000 x g por 10 min a 4 ° C e redisperse a pelota em HEPES (50 µ l, 10 mM, pH 7,5) contendo 0,1% proteína do estabilizador para obter o complexo de PKA-UCNP purificado. Centrifugar a 17.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e recolher o sobrenadante para um ensaio de Bradford em um tubo de 1,5 mL.
6. Analisar o PKA ilimitado no sobrenadante salvou da etapa 3.5 com um ensaio de Bradford para trás-calcular o nível de substituição de PKA das partículas de UCNP, que normalmente têm um nível de substituição de ~ 4,5 nmol de PKA por mg de partícula.
   Nota: O ensaio de Bradford revela uma forte cor azul sobre as pelotas, que sugere uma imobilização de alta proteína nivelada e estável sem dessorção, enquanto a fração sobrenadante de presos solução PKA-UCNP mostra uma cor semelhante a HEPES buffer ( Figura 4 c-4e).

4. Caracterização

Nota: O ensaio da quinase é usado para quantificar a atividade específica de piruvato quinase. Em breve, a fosforilação do peptide, que é acoplado ao piruvato quinase e lactato desidrogenase, resulta na oxidação do NADH. Formação destes últimos é monitorizada medindo-se a diminuição de absorbância do NADH a 340 nm.

1. Determinar a atividade de PKA e PKA-UCNP em um volume total de 60 µ l da mistura de ensaio contendo ácido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1mm), trifosfato de adenosina (ATP, 1mm), β - dinucleótido de nicotinamida e adenina, reduzido a forma (NADH, 0.8 mM), cloreto de magnésio (MgCl ₂, 1mm), kemptide (0,4 mM) e uma mistura de desidrogenase do piruvato quinase/lactato (30/40 unidades de PK/LDH).
2. Medir a diminuição de absorbância do NADH ao longo do tempo após a adição da solução PKA (2 µ l) para a mistura de ensaio. Calcular o declive da linha que refletem diretamente a atividade da quinase sendo medida.
3. Medir a atividade do PKA-UCNP ¹⁵ e a atividade global, que deve ser bem combinada com o produto da multiplicação da atividade de PKA específico nativa e o montante calculado de superfície revestida de PKA.

5. Instalação de fotólise

Meas

1. URE, todo o poder da luz fontes usando um sensor térmico de pilha e calcular a densidade de potência (PD = potência (W) / área (cm ²)) ¹⁸ com base na área local luz.
2. Realizar em vitro UV fotólise experiências em um sistema comercial com LED (200 mW/cm ²) 365 nm ¹⁵.
3. Photoactivation para UV no palco microscópio, iluminar a solução PKA-UCNP com a excitação luz filtrada por um cubo comercial ¹⁵.
   Nota: A densidade de potência é ~ 15 mW/cm ² sem foco da lente objetiva.
4. Para em vitro photoactivation NIR no palco microscópio, iluminar a solução de PKA-UCNP usando um 980 nm laser com upconversion personalizado configurações de filtro/espelho instaladas sobre o trajeto da luz de nível inferior, um espelho dicroico (850 nm curto-pass), e um filtro de excitação (950 nm-passe longo).
   Nota: A densidade de potência de saída é de 5 W/cm ² antes 4 X lente objetiva com foco. A densidade de potência é estimada em ~ 68 W/cm ², depois 4 X com foco da lente objetiva.

6. Preparação da amostra e microinjeção de complexos de PKA-UCNP celular

1. pré-filtrar as amostras através de um filtro de 0,45 µm após imobilização PKA (passo 3.5).
2. Incube as celulas em 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo meio de L-15 durante o período de microinjeção para controle de pH estável fora da incubadora.
   Nota: para confirmar a conclusão de microinjeção, co injetar o PKA-UCNP nativo, enjaulado PKA-UCNP ou PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) ¹⁵ 5 6-tetrametilrodamina (TAMRA) (10 µM) em células.
3. Ajustar a concentração de partículas de PKA-UCNP tal que, depois da microinjeção, a concentração citosólica é 1-3 μM PKA - um intervalo de concentração fisiológica para PKA em uma cela, com a suposição de que o volume de injeção é 1/10 do volume celular .
4. Realizar a microinjeção dentro das células (passo 6.2) usar um dispositivo de microinjector juntamente com um micromanipulador hidráulico de um eixo ( Figura 3).
5. Use um medidor digital de pressão para monitorar a pressão aplicada pelo microinjector está na gama de funcionamento (~ 50-200 hPa) e feche a válvula do distribuidor em uma câmara pressionando personalizada para fornecer pressão de compensação para o microinjection. Puxe a agulha usando um extrator.
6. Manter a pressão de injeção entre 50 e 75 hPa, com um tempo de injeção de 200-300 ms e a pressão de compensação a 15 hPa para evitar o refluxo do meio de cultura na agulha por acção capilar.
7. Examinar as aberturas da ponta da agulha para garantir que eles têm um diâmetro externo entre 1,3 e 1,5 µm, que pode ser confirmado por tomar imagens usando uma lente objetiva de 40 x.
8. Lavar as células com 2 mL de meio de L-15, contendo 10% FBS depois da microinjeção. Observar a imagem de fluorescência celular de 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) para confirmar a conclusão de microinjeção.

7. Photoactivation de Caged PKA-UCNP usando UV ou luz NIR em células vivas

1. para UV photoactivation depois da microinjeção de PKA-UCNP, crescem as células REF52 em um prato de 3,5 µm, colocá-los no palco microscópio e eles a irradiação com luz UV filtrado por o cubo para 3 min sem foco da lente objetiva.
   Nota: REF52 células foram mantidas em DMEM contendo 10% FBS a 37 ° C em uma incubadora de ₂ CO 5% e as células foram repicagem quando a confluência chegou a 90% a cada 2-3 dias.
2. Para NIR photoactivation depois da microinjeção de PKA-UCNP, iluminar as células em um laser de 980 nm de configurações de filtro/espelho de nível inferior, conforme descrito na etapa 5.4.
   Nota: A saída de densidade de potência é 5 W/cm ² antes 10 X lente objetiva com foco e é estimada em 300 W/cm ² após a focagem da lente objetiva de 10x. Upconversion é um processo que requer uma densidade de fóton alta, especialmente quando é necessária uma maior mudança de anti-Stoke. Concentrando-se, portanto, é necessário durante a fotoativação.
3. Quando é necessário um ponto de luz maior (650 µm x 520 µm), irradiar estas células com NIR focada por uma lente objetiva de 10x com um colimador de 15 min. permitir para um intervalo de 5 min escuro após cada irradiação 5 min para evitar aquecimento.
   Nota: Quando uma alta resolução espacial (ponto de luz subcellular) é necessário, usar o 40 X da lente objetiva com uma pinhole instalado na extremidade de saída da guia de luz para gerar um ponto de luz subcellular-dimensão (5 µm x 4 µm). Neste caso, 1 s de irradiação é suficiente para NIR photoactivation devido ao elevado fluxo de fótons.
4. Depois de UV ou NIR fotólise, permitem que as células para se recuperar em uma 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C por 1 h no meio completo para gerar respostas celulares. Posteriormente, corrigi-los em 1 mL de 4% paraformaldeído/fosfato-salino (PBS) por 20 min antes de manchar mais.
   Cuidado: Paraformaldehyde é altamente tóxico; Evite o contacto com a pele, olhos ou mucosas. Evitar respirar o pó durante a medição e preparação.

8. Visualização de desintegração da fibra Stress causado por NIR Photoactivation

1. após a fixação, utilizar Alexa 594-faloidina (adicionar 5 µ l de solução-mãe 6.6 µM a 200 µ l de PBS para coloração; incubar durante 25 min à temperatura ambiente) a mancha e Visualize as fibras de estresse. Visualizar as imagens de Alexa 594-faloidina (Ex 581 nm/Em 609 nm) usando um conjunto de filtro.
2. Incube as celulas por 5 min em 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à temperatura ambiente. Depois da coloração, lavar as amostras com PBS e separadamente fazer imagens fluorescentes de fibras de stress e núcleos.

Resultados

O projeto de construção de gaiolas enzima-UCNP é ilustrado na Figura 1. A enzima PKA foi primeiro reagiu com brometo de 2-nitrobenzil para gerar um PKA enjaulado inativo, e então estava eletrostaticamente imobilizado na superfície de UCNP. UCNPs emitem a luz de upconverted e consequentemente photolytically cleave os grupos ó-nitrobenzil em 199 Cys e 343 Cys, gerando o PKA registrado. TEM imagens e ensaio de Bradford confirmaram que o PKA e enjaulado PKA...

Discussão

Anteriormente, Hofmann e colegas de trabalho encontraram que dramáticas mudanças morfológicas foram observadas em células REF52 após a microinjeção da enciclopédia PKA¹⁹. Em outro estudo, o grupo de Lawrence demonstrou que PKA enjaulado pode ser registrados na vivo, levando a alterações morfológicas e a desintegração de fibras de estresse quando submetido a UV fotólise²⁰. Anteriores relatórios sobre explorando upconverted UV luz para photoactivation ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen	Sigma	81662	Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reduced from dipotassium	Sigma	N4505
Phosphoenolpyruvate	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase	Promega	V5161	PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmid	CoralHue	AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017	Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescence Microscope	Olympus	IX-71
950 nm longpass filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass	Chroma	NC265609
RT3 color CCD system	SPOT	RT2520
Fluorescence Illumination	PRIOR	Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source	UVATA	UVATA-UPS412	With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller	Narishige	PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge	Lutron	PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002421