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Resumo

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Resumo

Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.

Introdução

Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo1 e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença2 e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa3 e trombose arterial4 .

VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais e armazenado em plaquetas α-grânulos e WPBs, respectivamente. Desafio hemostático, VWF pode ser liberado da endoteliais WPBs para amarrar as plaquetas circulantes de células endoteliais ativadas5 ou colágeno exposto no vaso parede6. Ancoragem de VWF para células endoteliais foi mostrado para ser mediado pelo P-selectina7 e integrinas αvβ38. A subsequente liberação de plaquetas α-grânulo lojas pode aumentar ainda mais as concentrações de VWF localizadas para estabilizar as interações de plaquetas-plaquetas para a formação de plaquetas plug, o andaime necessário para a propagação da cascata de coagulação e fibrina deposição. A atividade de plaquetas-ligação do VWF é regulada pela sua estrutura multiméricas, com oriundas de alto peso molecular, possuindo maior atividade hemostática9,10. Em circulação, VWF também atua como um portador para o factor VIII de coagulação.

Tensão de cisalhamento de fluido é um regulador essencial da fisiologia do VWF. Na ausência de tensão de cisalhamento, VWF existe sob uma forma globular, ocultando os domínios de ligação para a glicoproteína plaquetária Ib adesão11. Quando a tensão de cisalhamento está presente, o local de clivagem para uma metalloprotease, uma Desintegrina e metalloprotease com motivo thrombospondin (ADAMTS13), é exposto. ADAMTS13 cliva nuas e plaquetas-decorado VWF sequências de caracteres para regular o tamanho do multimer, reduzindo sua atividade hemostática12.

VWF é uma proteína de fase aguda, e inúmeros estímulos, incluindo hipoxia13, infecção14e cytokines proinflammatory, foram mostrados para mediar a liberação VWF de células endoteliais. Semelhante a outros agentes inflamatórios, histonas extracelulares também foram mostrados para induzir liberação sistêmica de VWF ratos15,16 e a ativação de plaquetas em vitro17,18, 19. isto foi mostrado para ser dependente de subtipo de histona, como diferenças de lisina e conteúdo de arginina pode influenciar a função15. Nossa estudo visa estabelecer uma câmara de fluxo modelo para investigar a influência do rico em lisina (HK) e ricos em arginina subtipos de histona (HR) e secretagogues na liberação VWF endotelial e plaquetária em tempo real de captura, potenciais eventos precoce em trombose induzida por inflamação.

Esta metodologia de câmara de fluxo recapitula em vivo de interações entre as plaquetas, células endoteliais, VWF e colágeno subendotelial em um sistema em vitro que é visual, reprodutível e quantificáveis. Permite a avaliação em tempo real de todos os aspectos do percurso que regula as interações VWF-plaquetas, incluindo secreção WPB, Ativação plaquetária e proteólise VWF. Estudos de VWF sob condições controladas de tensão de cisalhamento têm sido utilizados para avaliar as mutações do VWD que prejudicam a liberação do VWF e plaqueta-ligação função20, WPB fisiologia21e clivagem VWF por ADAMTS135. Nós usamos esta metodologia para quantificar a formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas como consequência de um estímulo inflamatório: histonas extracelulares.

Protocolo

Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha.

1. endothelial da pilha estimulação

  1. Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco.
    1. 24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial).
    2. Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está equilibrado sal solução (HBSS).
      Nota: As placas podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas em um saco de plástico hermético a 4 ° C.
  2. Sementes em uma densidade de 1 x 106 células por poço em 2 mL de crescimento médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), as células endoteliais. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C (5% CO2).
    Nota: Aqui, sangue consequência células endoteliais (BOECs) entre 5 e 15 passagens foram usadas. BOECs foram isoladas de voluntários saudáveis com uma sequência VWF sua usando um método referenciado em Starke et al 22 , de uma forma semelhante a um descrito anteriormente por JoVE23.
  3. Retire o meio após 24 h e lave as células com HBSS.
  4. Adicionar 1 mL de meio livre de soro (meio de crescimento essencial mínimo sem FBS) contendo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA; 100 nM), fluida histona (UH) e HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) para as células por 2 h a 37 ° C (5% CO2).
    Nota: Esta concentração de histona foi baseada em vitro citotoxidade relatórios anteriores de Xu et al . 24 e Abrams et al. 25 que usado 50 µ g/mL.
  5. Recolher o meio após 2h e armazená-lo a-20 ° C até análise.

2. VWF quantificação por ensaio enzima-lig da imunoabsorção (ELISA)

  1. Revestir uma microplaca com 100 µ l de revestimento anticorpo tampão (10mm dibásico fosfato de sódio e 145 mM de cloreto de sódio, pH 7,2) contendo policlonal anti-VWF 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.
  2. Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem (10 mM de fosfato de sódio dibásico, cloreto de sódio 500 mM e 0,1% Tween 20, pH 7,2).
  3. Diluir as amostras médias 1:2 e 1:4 com tampão de lavagem e usar plasma de referência normal para uma curva padrão, começando em um 01:10 diluição.
  4. Placa de 100 µ l de amostras diluídas e normas durante a noite a 4 ° C.
  5. Lave a placa 3 vezes com 250 µ l de tampão de lavagem.
  6. Adicione 100 µ l de anti-VWF diluído, anticorpo conjugado HRP deteção (1.1 µ g / µ l de tampão de lavagem) para a placa e incubar por 1h à temperatura ambiente.
  7. Lave a placa e incubar durante 10 minutos com O-fenilenodiamina dicloridrato (OPD) reagente, conforme as instruções do fabricante.
  8. Parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4 e leia a placa em 492 nm.

3. fase sólida histona-VWF ensaio

  1. Revestir uma microplaca com histonas diluídas em 0,5% de sódio deoxycholate 50mm carbonato de buffer (pH 9.6) 10 µ g/mL durante a noite a 4 ° C.
  2. Lavar a placa 3 vezes com 250 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20, incubando durante 10 min entre lavagens.
  3. Bloquear a placa com 200 µ l de PBS suplementado com 0,1% Tween 20 e 1% albumina de soro bovino (BSA) por 1h à temperatura ambiente.
  4. Repita a etapa 3.2.
  5. Diluir em série derivada de plasma humano VWF/fator VIII complexo de 200 mU/mL a 25 mU/mL no tampão salino (cloreto de sódio de 500 mM de fosfato de sódio dibásico, de 10mm e 0.1% Tween 20, pH 7,2). Adicione 100 µ l para a placa para 2 h à temperatura ambiente.
  6. Repita a etapa 3.2.
  7. Detecta a ligação do VWF a histona imobilizada usando 100 µ l de uma solução contendo PBS-0.1% Tween 20 e 1:1,000 coelho policlonal anti-VWF anticorpo conjugado com HRP por 1h à temperatura ambiente.
  8. Repita a etapa 3.2.
  9. Incubar a placa por 30 min com 100 µ l de reagente OPD e parar a reação com 100 µ l de 1 M H2então4. Medir a densidade óptica em 492 nm.

4. semeadura de células endoteliais em câmaras de fluxo

  1. Carrega a 0,5 mL de tampão de colágeno-revestimento (descrito no passo 2.1) em uma seringa de 1 mL Luer-lock.
  2. Torça a extremidade do conector Luer-lock da seringa para o reservatório de um slide de câmara de fluxo.
  3. Pressione o êmbolo lentamente até a pista inteira é revestida e cada reservatório estiver cheio. Repita para cada raia e incubar a câmara a 37 ° C por 24 h.
  4. Aspire o buffer de colágeno-revestimento com uma pipeta de 200 μL. Carregar outra seringa com 1 mL HBSS e pressione o êmbolo lentamente para lavar cada raia da câmara de fluxo. Aspire a lavagem com uma pipeta μL 200 na extremidade oposta da câmara de fluxo. Repita duas vezes.
  5. Pipetar cerca de 100 µ l de uma solução de células endoteliais (BOEC) 3 x 106 células/mL em meio de cultura com 10% FBS para a pista de uma câmara de fluxo.
    Nota: A densidade de semeadura de células endoteliais excede a capacidade da câmara. Isso é para garantir a cobertura máxima do canal; as células não-aderentes são removidas na etapa de lavagem posterior.
  6. Incube a câmara a 37 ° C por 24 h. mudança de meio de cada 8-12 h usando seringas Luer-lock (como na etapa 4.4). Certifique-se de que não há nenhuma bolha visível nas pistas.

5. isolar as plaquetas de sangue total humano

  1. Em uma câmara de segurança biológica com uma agulha 30G, adicione 300 µ l de tampão ácido-citrato dextrose (citrato trissódico 85mm, 111 mM D-glicose e ácido cítrico de 71 mM, pH 4.5) para um vacutainer de coleta de sangue sem aditivos 3 mL.
  2. Colete sangue total de voluntários saudáveis (livres de anti-plaquetários e não-esteroides anti-inflamatórios não esteroides por sete dias) por punção venosa (três tubos de 3ml cada), seguindo um protocolo semelhante ao publicado por Bernardo et al.26.
  3. Descarte o primeiro tubo, pois o dano no tecido inicial associado com a punção venosa pode causar Ativação plaquetária espontânea.
  4. Inverta suavemente o Vacu três vezes para misturar o sangue com anticoagulante.
  5. Centrifugue o Vacu a 150 x g, durante 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
  6. Remova lentamente o plasma rico em plaquetas (sobrenadante) com uma pipeta em uma câmara de segurança biológica e cuidadosamente, transferi-lo para um tubo cônico de 15 mL. Transferi o volume rico em plaquetas de cada vacutainer para um único tubo cônico para evitar potencial Cruz-ativação.
    Nota: O isolamento de plaquetas deve ser realizado em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação bacteriana e potencial plaquetas artificiais e/ou ativação endotelial.
  7. Centrifuga os tubos cónicos a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente) para as plaquetas de Pelotas.
  8. Pipetar e descartar o sobrenadante pobre em plaquetas.
  9. Lave o pellet cuidadosamente com 1 mL de tampão de citrato-glicose-sódio (CGS) (citrato de sódio de 13 mM, 30 mM D-glicose e cloreto de sódio 120 mM, pH 7,0).
    Nota: As plaquetas aparecerá em formações de wisp quando o buffer CGS é adicionado e o sedimento é resuspended suavemente. Amostras contaminadas por Ativação plaquetária, as plaquetas não serão facilmente Resuspenda em surgem agrupadas.
  10. Uma vez totalmente resuspended, Centrifugar as amostras a 900 x g durante 10 minutos a 24 ° C (temperatura ambiente).
  11. Retire o tampão de lavagem CGS e resuspenda o pellet em 3 mL de tampão de Tyrode (cloreto de sódio 138 mM, 5.5 mM D-glicose, 12mm de bicarbonato de sódio, cloreto de potássio de 2,9 mM e 0,36 mM de fosfato de sódio dibásico, pH 7,4). Certifique-se de ressuspensão completa das plaquetas e, se forem observadas as agregações, descartar a amostra.
  12. Adicione 1,5 µ l de uma solução-mãe DiOC6 (dissolver 57,25 mg em 5 mL de metanol) de 20mm a cada tubo cónico de 3 mL de plaquetas lavadas para uma concentração final de 1 µM.
    Nota: DIOC6 é um corante de mitocondrial verde fluorescente usado neste experimento para as plaquetas de rótulo.
  13. Alíquota 1 mL da solução de plaquetas lavadas para três tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
    Nota: O volume de plaquetas exigido para este experimento é calculado com base no tamanho da câmara de fluxo, a tensão de cisalhamento desejado e o comprimento do experimento (passo 6.5). Este protocolo pode ser ajustado conforme as condições mudam para garantir que não há volume suficiente para o fluxo de fluido.
  14. Use as plaquetas lavadas até 2 horas de isolamento.

6. fluxo de montagem de aparelhos

  1. Prenda um pedaço de 70 cm de estéril silicone tubo (diâmetro interior de 1,6 mm) para um conector Luer de cotovelo macho em uma extremidade e um adaptador de bloqueio Luer fêmea na outra.
  2. Conecte o adaptador de bloqueio Luer fêmea anexado para o tubo a uma seringa de 20 mL.
  3. Repita as etapas de 6.1 e 6.2 duas vezes para gerar três conexões de seringa-tubo idênticas.
  4. Use uma bomba de seringa para gerar fluxo de fluido. As seguintes configurações para a bomba de seringa de entrada: diâmetro interior da taxa de fluxo e seringa.
    Nota: Uma seringa de 20 mL tem um diâmetro interior de 19,55 mm. A taxa de fluxo é calculada com base na tensão de taxa/cisalhamento cisalhamento desejado e as dimensões da câmara de fluxo. Câmara de fluxo usado no estudo atual, para alcançar 1 dyn/cm2 (observados em baixo cisalhamento venoso), é necessário um caudal de 9.37 µ l/min. Por causa da evidência ligando histonas para trombose venosa, é selecionado um cisalhamento moderado venoso de 4,45 dyn/cm2 . Isto também é baseado no pressuposto de que a reserva tem uma viscosidade semelhante à água. A taxa de fluxo é então igual a 41,7 equações µ l/min., usadas para calcular que a taxa de fluxo para várias dimensões de câmara de fluxo pode ser encontrada em:
    1. Conjunto da bomba para retirar o líquido, usando a opção do botão da bomba de seringa.
  5. Carga três seringas anexado à tubulação da bomba de seringa e fixe firmemente colchetes em torno das seringas e êmbolos.
  6. Anexe um cotovelo macho Luer para ambas as extremidades de um segundo pedaço de 20 cm de tubo estéril do silicone.
  7. Conecte um cotovelo Luer uma agulha de calibre 18 embotada.
  8. Repita duas vezes, criando três sistemas de admissão idêntica para as três faixas da câmara de fluxo.
    Nota: Os tubos de silicone e Luers pode ser lavado com água sanitária 10%, seguida por água destilada antes reusar. Não é aconselhável reutilizar as câmaras de fluxo.

7. microscópio configurações

  1. Use um microscópio de disco girando equipado com um palco totalmente automatizado. Realize a iluminação com um lançamento do laser que fornece 405, 458, 491, 543 e linhas de laser 633 nm. Capture todas as imagens com um objetivo X 20. Ajuste todos os parâmetros com o software de análise (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Selecione as configurações de canal (filtro de emissão: 520/35), com a excitação em 491 nm, para aquisição. Defina o elétron multiplicando o dispositivo de carga acoplada a um ganho de elétron-multiplicação de 150, com um tempo de exposição de 200 ms, para obter o intervalo de dados dinâmica plena.
    Nota: As plaquetas são marcadas com um corante fluorescente verde, DiOC6, com maxima de comprimento de onda (excitação, 482 nm; emissão, 504 nm).
  3. Ajuste a potência de laser 491 nm a 20%.
  4. Marque o centro de todas as três faixas e selecione 1 μm para faixa z e 0,5 μm de tamanho de passo. Selecione o número de pontos de tempo (ou seja, duração) e o tempo entre as imagens (ou seja, intervalo) para capturar uma imagem a cada 10 s; Selecione "60 pontos de tempo" por slide. Defina o microscópio para capturar imagens de três pistas e salvá-los para uma pasta designada experimento.
    Nota: Porque a câmara de fluxo tem três faixas, o microscópio será necessário alternar entre três posições para capturar as imagens.

8. VWF-plaquetas String formação

  1. Remover o meio de cultura da câmara de fluxo (da etapa 4) usando a mesma técnica como na etapa 4.4.
  2. Adicione 100 µ l de qualquer histamina (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK ou HR (todos em 25 µ g/mL) diluído em meio livre de soro (como na etapa 1.4) para estimular a monocamada BOEC por 15 min a temperatura e O ambiente2/CO2.
    Nota: Embora não seja necessário para a liberação do VWF, realizar esta estimulação a 37 ° C irá melhorar VWF exocitose27.
  3. Certifique-se de que um dos três corredores separados da câmara de fluxo permanecem não tratados como um controle experimental.
  4. Remover o meio utilizando uma seringa de 1 mL e substituí-lo com 100-200 µ l de PBS para lavar os secretagogues fora a monocamada endotelial.
  5. Montagem da câmara de fluxo em um stand de slide usando grampos vasculares para fixar a câmara no lugar.
  6. Conecte o conector Luer macho disponível na extremidade do tubo de 70 cm (conectada à seringa) para o reservatório da câmara de fluxo. Repita para as duas outras fluxo câmara pistas.
  7. Ligue a bomba de seringa para remover a lavagem PBS. Pipeta PBS adicionais para o reservatório de câmara de fluxo opostos para garantir que as vias não secar.
  8. Observar o sistema de fluxo para o fluxo equivalente em todas as três faixas e então pausar a bomba de seringa.
  9. Selecione uma área para capturar as imagens em meados de cada raia, aproximadamente a mesma área entre experiências.
    Nota: A pessoa que opera o microscópio pode ser cega às condições experimentais. Esta etapa garante que o microscópio é focado antes fluxo de plaquetas (consulte a etapa 7).
  10. Anexar um acoplador fêmea luer a uma seringa de 5 mL e depois para o conector luer macho livre (etapa 6,8) e mergulhe a agulha cega no tubo microcentrifuga de 1,5 mL contendo a solução de plaquetas lavadas (etapa 5.13). Tirar lentamente a solução de plaquetas através do tubo para não garantir nenhuma bolha de ar dentro do sistema.
  11. Remova a seringa de 5 mL e anexar o conector Luer macho ao reservatório aberta da câmara de fluxo. Repita para as três faixas.
  12. Reiniciar a bomba de seringa e capturar imagens durante o fluxo de plaquetas usando as configurações de microscópio e protocolo da etapa 7 para 10 min no escuro.
  13. Depois de 10 min, desconecte o tubo de entrada no reservatório de câmara do fluxo o Luer e encher o reservatório com PBS para manter o fluxo sobre a monocamada endotelial.

9. VWF-plaquetas String quantificação

Nota: O fluxo contínuo de PBS é necessária para manter o alongamento de cadeia de caracteres de VWF-plaquetas para análise de imagem. Cessação do fluxo resultará no VWF tornando-se globular e prejudicará a quantificação de sequência de caracteres de VWF-plaquetas. É essencial para completar cada reservatório com PBS durante a captura de imagem. HBSS pode substituir PBS se encolhendo de célula ou destacamento é observado durante esta etapa.

  1. Começando com a primeira pista, capture 10 imagens por slide sem sobreposição usando uma lente de objetiva X 20 em torno do meio do slide. Repita isto para cada raia.
    Nota: As áreas em torno dos reservatórios devem ser evitadas devido à tensão de cisalhamento turbulenta.
  2. Usando o software de processamento de imagem, ajustar o brilho, clicando em "Imagem", "Ajustar" e "Brilho/contraste." Arraste a barra de rolagem até que as plaquetas aderidas podem ser visualizadas bem o suficiente para quantificação.
  3. Grave uma sequência de caracteres de VWF-plaquetas quando três ou mais alinhadas plaquetas são observadas na imagem. Conte todas as cordas de VWF-plaquetas em uma imagem. Repita para todas as 10 imagens e média para o experimento.
    Nota: A pessoa que realizar a quantificação pode ser cego para as condições experimentais. Não é necessário ficar manchado co para VWF, como isto foi confirmado por estudos independentes de28,8,29.
  4. Repeti o experimento um mínimo de três vezes para avaliar cada secretagogue.

Resultados

Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não t...

Discussão

Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona5. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) - ou no microambiente inflama...

Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Alison Michels é um destinatário de um Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação bolsa de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Laura L. Swystun é o destinatário de uma comunhão CIHR. David Lillicrap é o destinatário de uma cadeira de pesquisa do Canadá na hemostase Molecular. Este estudo foi financiado em parte por um CIHR grant (MOP-97849) de funcionamento.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Calf-thymus unfractionated histones (UH)Worthington BiochemicalHLYReconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK)Sigma-AldrichH5505Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR)Sigma-AldrichH4830Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139Reconstituted in DMSO (20 mM)
HistamineSigma-AldrichH7125-1GReconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)InvitrogenD273Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating AntibodyDAKOA0082For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugatedDAKOP0026For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplateseBioscience44-2404-21For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well PlatesThermo Scientific3855For VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/APlasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference PlasmaPrecision BioLogicCCNRP-05For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagentSigma-AldrichP8287Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
Rat-tail Collagen Type 1Corning354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum MediaThermoFisher Scientific31985070For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis SoftwareMolecular DevicesN/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No AdditiveBD Biosciences366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers)IbidiThis product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilizedIbidi10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilizedIbidi10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilizedIbidi10802
Blunted 18G NeedleBD Biosciences305180
20 mL syringesBD Biosciences302830
Syringe PumpNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscopeQuorum TechnologiesN/A
Image Processing SoftwareImageJN/A

Referências

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

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