Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Resumo

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Resumo

As proteínas de superfície celular medem uma ampla gama de funções. Em muitos casos, sua atividade é regulada por processos endocíticos que modulam seus níveis na membrana plasmática. Aqui, apresentamos protocolos detalhados para 2 métodos que facilitam o estudo de tais processos, ambos baseados no princípio da biotinilação de proteínas de superfície celular. O primeiro é projetado para permitir a determinação semi-quantitativa dos níveis relativos de uma proteína particular na superfície celular. Nele, os resíduos de lisina das proteínas da membrana plasmática das células são primeiro marcados com uma porção de biotina. Uma vez que as células são lisadas, estas proteínas podem então ser precipitadas especificamente através da utilização de estreptavidina imobilizada em agarose, explorando a afinidade natural destes últimos com a biotina. As proteínas isoladas de tal maneira podem então ser analisadas através de uma abordagem padrão de Western Blot. O segundo método fornece um meio de determinar a taxa endocítica de umaAr alvo da superfície celular durante um período de tempo. As proteínas de superfície celular são primeiro modificadas com um derivado de biotina contendo uma ligação dissulfureto clivável. As células são então deslocadas de volta para condições de cultura normais, o que provoca a absorção endocítica de uma proporção de proteínas biotiniladas. Em seguida, as ligações dissulfureto de grupos de biotina não internalizados são reduzidas usando o agente redutor impermeável à membrana glutationa. Através desta abordagem, as proteínas endocitadas podem assim ser isoladas e quantificadas com um alto grau de especificidade.

Introdução

As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram internalizadas novamente. Através destes métodos, a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de qualquer proteína de interesse podem ser quantificadas, permitindo assim uma avaliação mais clara da sua regulação.

Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular por biotinilação

A biotina ou vitamina B7, anteriormente conhecida como vitamina H ⁶ , é uma pequena molécula solúvel em água que pode ser usada para modificar quimicamente grupos amino, sulfidrilo e carboxilo reativos de moléculas biológicas. A cultura atual de reagentes de biotinilação de superfície celular consiste principalmente de ésteres de N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados com membrana e nanotoxinas (sulfo-NHS), de biotina ou seus derivados, projetados para reagir com as aminas presentes nas cadeias laterais de resíduos de lisina de proteínas expressas em A superfície celular quando estes se tornam desprotonados em condições básicas, resultando em este último formando uma ligação amida com a unidade de biotina ⁷ . Assim, modificadas, as proteínas da superfície celular podem então ser isoladas através do uso de avidina, uma proteína tetramerica de 66 - 69 kDa que possui grande afinidade pela biotina, que se liga ao último com uma constante de dissociação de aproximadamente 10 a ¹⁵ , marcando-a como uma das Interações não covalentes mais fortes conhecidas ^{8 , 9} .

Uma série de métodos alternativos de quantificação da expressão protéica na superfície celular foram utilizados em estudos prévios. A rotulagem de células não permeabilizadas usando anticorpos marcados de forma fluorescente especificamente para a proteína de interesse, seguida pela visualização por microscopia de fluorescência, por exemplo, é uma abordagem comumente empregada, mas depende fortemente da disponibilidade de anticorpos que podem se ligar a epítopos extracelulares. Mais recentemente, os métodos que envolvem a utilização de proteínas quiméricas com fluoróforos sensíveis ao pH que reagem a exposição a meios ácidos também foram empregados com sucesso ¹⁰ . No entanto, tais ensaios geralmente envolvem a expressão exógena dessas construções em linhas celulares em que a proteína de interesse não é encontrada nativamente. Essas abordagens são, no entanto, capazes de fornecer informações valiosas sobre a localização subcelular e o itinerário exocítico daProteína alvo e, portanto, deve ser usado em conjunto com as abordagens baseadas em biotinilação aqui descritas se as ferramentas estiverem disponíveis.

Num ensaio de biotinilação típico, as células são primeiro lavadas completamente em PBS a 4 ° C. Isso remove qualquer vestígio de proteínas séricas introduzidas pelo meio de cultura, garantindo assim que estas não consumam quantidades excessivas de biotina no próximo passo. Mais importante ainda, a redução da temperatura faz com que a endocitose desacelere significativamente. O reagente de biotinilação é então adicionado. Em seguida, as células são lavadas novamente e depois incubadas com um tampão de extinção contendo glicina ou NH4C1, cujo objectivo é inactivar todos os vestígios restantes da biotina não reagida. As células são então lisadas, após o que é adicionada streptavidina imobilizada em agarose para precipitar as proteínas biotiniladas. A análise é comumente realizada via western blot, permitindo a expressão relativa da superfície celular de vários prOteins a serem quantificados.

Devido à base deste ensaio, é adequado para uso apenas com proteínas que possuem porções expostas ao ambiente extracelular. As proteínas transmembranares multipass, que provavelmente possuem uma série de lisinas reativas dentro de suas regiões de loop, são as mais favoráveis ​​a esse método, enquanto as proteínas de passagem única tendem a ser menos suscetíveis a serem biotiniladas. Mesmo nesses casos, existe a possibilidade de que mudanças conformacionais ou interações intermoleculares ocultem certos locais reativos, resultando em um rendimento de biotinilação inferior ao esperado.

Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular por biotinilação

Os princípios deste ensaio são em grande parte semelhantes aos da biotinilação celular, com várias exceções, sendo o mais importante o uso de reagentes reversíveis de biotinilação. Os grupos de biotina (destes) possuem disuLigação de ligações, dentro das suas estruturas, que são suscetíveis a agentes redutores; Isto é explorado para assegurar que apenas as proteínas de superfície celular tomadas nos locais intracelulares durante o período de ensaio serão deixadas biotiniladas. Um ensaio geralmente ocorre da seguinte maneira. As células são primeiro lavadas e biotiniladas com reagentes frios, então o meio de cultura de células a 37 ° C é reintroduzido e as células são devolvidas à incubadora; Isso faz com que as proteínas de superfície celular marcadas sofram endocitose. O agente redutor de glutationa - que não pode penetrar na membrana - é então adicionado para quebrar as ligações dissulfureto das porções de biotina ligadas às proteínas que permanecem na superfície celular. Finalmente, as ligações de dissulfureto quebradas são feitas reagir com iodoacetamida, consumindo os grupos de tiolos lábeis e impedindo que as ligações se reformem. Como antes, as células são então lisadas, e as proteínas marcadas são precipitadas usando estreptavidina-agarose.

O disco de limitaçõesUssed na seção anterior também se aplicam aqui devido às semelhanças compartilhadas entre os métodos. Além disso, vale a pena ter em mente que as mudanças de temperatura envolvidas neste ensaio impedem a determinação exata de quanta proteína é endocitada para cada incremento de tempo, particularmente no caso de proteínas de reciclagem rapidamente ou internamente recicladas. O ensaio, portanto, apenas fornece uma estimativa semiquantitativa das taxas endocíticas. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total pode ser utilizada para rastrear a absorção de cada vesícula carregada e fornecer uma medida mais precisa da cinética da endocitose. Por conseguinte, pode proporcionar um complemento muito útil a este ensaio, assumindo que existe uma construção quimérica marcada de forma fluorescente da proteína de interesse ¹¹ .

Protocolo

1. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular em astrocitos por biotinilação

NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula da molécula da matriz extracelular na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais ).

1. Usando o método descrito em Noel et al. ¹² , preparar culturas de astrocitos corticais aproximadamente 2 semanas antes do ensaio e cultivá-las em frascos de cultura ventilados de 75 cm2. Quando os astrocitos são 80 a 90% confluentes, separe-os da superfície da cultura usando 0,05% de tripsina e, em seguida, passe-os 1: 3.
2. Às 48 horas anteriores ao ensaio, quando as células são novamente 80 - 90% de confluência, astrocitos de passagem 1: 3 (responsável pelo cHange no formato de cultura) em pratos de cultura celular de 60 mm de modo que estejam> 70% confluentes no dia da realização do experimento. Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente entre pratos.
3. Às 16 h antes do ensaio, laminina de pipeta em meio de cultura até uma concentração final de 24 nM e incuba a 37 ° C.
4. Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e, em seguida, colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H ₂ O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / mL de sulfo-NHS-LC-biotina em CM-PBS), tampão de extinção (NH4Cl 50 mM em CM-PBS), tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, coqueador de inibidor de protease 1X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (10 mM Tris (pH 7,4), EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X).
5. RemOve pratos segurando as culturas de astrocite da incubadora e descarte o meio.
6. Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado.
7. Pipetar 2 mL de tampão de biotina em cada poço e inclinar suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir uma cobertura completa. Deixe em gelo durante 30 min.
8. Remova o tampão de biotina usando um aspirador e substitua-o por um tampão de extinção de 4 mL. Deixe no gelo por 10 min.
9. Aspirar o buffer de extinção e substituir por um volume equivalente do mesmo. Mais uma vez, deixe no gelo durante 10 min.
10. Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido.
11. Raspe as células em 1 mL de CM-PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para o tubo de microcentrífuga.
12. Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e volte a suspender as células em 500 μL de tampão de lise.
13. Deixe amostras em gelo durante 30 min, vortexando a cada 5 minutos, ou plAce eles em um rotator de extremidade a ponta a 4 ° C.
14. Centrifugar o lisado a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar quaisquer materiais insolúveis em detergente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
    1. Economize 50 μL deste lisado e adicione o buffer de carregamento a ele. Em seguida, desnaturar-se por aquecimento a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração "entrada", contendo proteínas de superfície celular biotiniladas, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas.
15. Amplie a abertura de uma ponta de pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material da extremidade usando um par de tesoura afiada. Utilizando esta ponta de pipeta, transfira 75 μL de esferas de estreptavidina-agarose (normalmente armazenadas a 4 ° C) até o lisado e incuba a 4 ° C durante 3 h no agitador / balancim.
    1. Como a estreptavidina-agarose é frequentemente vendida como uma pasta contendo 50% de grânulos por volume, suspensa numa solução antimicrobiana, triturar a pasta para garantir que as esferasSão uniformemente suspensos e, em seguida, pipetar 150 μL da suspensão em cada amostra.
16. Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1500 xg durante 30 s a 4 ° C.
    1. Economize 50 μL do sobrenadante (adicione o tampão de carga e desnaturado a 95 ° C em um banho de água ou bloco de aquecimento); Isso representa a fração "intracelular", e é composto principalmente de proteínas citossicas não biotiniladas.
17. Ressuspender os grânulos sedimentados em 1 mL de tampão de lavagem e arrasar isto durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (como no passo 1.16), e descartar o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas.
18. Granular as esferas por centrifugação (1500 xg durante 30 s a 4 ° C) e descartar o tampão de lavagem subjacente. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas desnaturando isso a 95 ° C; Esta fraçãoSó contém proteínas de superfície celular biotiniladas (fração "superfície celular").
    1. Separar a entrada, a superfície celular e as frações intracelulares por SDS-PAGE ¹³ e analisar pelo Western Blot ¹⁴ .
       NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas.

2. Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular em Astrocytes por Biotinilação

NOTA: No seguinte, descrevemos um experimento típico de biotinilação de pulso-perseguição usado nesta instância para rastrear a endocitose de AQP4 em astrocitos. esteO método é baseado no usado por Madrid et al. ¹⁵ . Os materiais especializados necessários incluem sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarose, glutationa reduzida e iodoacetamida (ver Tabela de Materiais ).

1. Prepare culturas de astrocitos corticais de mouse em pratos de 60 mm usando os métodos descritos na seção anterior. Certifique-se de que as células estejam aproximadamente a 70% confluentes no dia do ensaio, e que cada prato contém um número equivalente de células.
2. Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H ₂ O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotina em CM-PBS), tampão redutor (50 mM de glutationa reduzida, NaCl 75 mM e NaOH 75 mM), tampão de extinção (iodoacetamida 50 mM, BSA a 1% em CM-PBS) Tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM, 1% triton X-100, 1Coque de inibidor de protease X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X).
3. Prepare um meio de cultura celular fresco (DMEM suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina) e coloque-o em um banho de água a 37 ° C.
4. Remova as culturas de astrocitos da incubadora e aspirar o meio usando um aspirador.
5. Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado.
6. Pipetar 3 mL de tampão de biotina em cada prato, incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe isso no gelo durante 30 min.
7. Aspirar o tampão de biotina e substituí-lo por 5 ml de meio quente. Incubar um prato de cultura a 37 ° C durante 15 min e um segundo prato à mesma temperatura durante 30 min. Deixe um outro prato aos 46; C como a amostra de 0 min.
8. No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido. Pipetar 6 mL de tampão redutor sobre células e deixar em gelo durante 15 min.
9. Remova o tampão redutor e, em seguida, substitua-o por 6 ml de tampão redutor fresco. Coloque no gelo por mais 15 min.
10. Remova a solução redutora e substitua-a por um tampão de remoção de 6 ml. Deixe em gelo durante 15 min.
11. Repita o passo de extinção mais uma vez.
12. Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de PBS arrefecido.
13. Raspe células para 1 mL de PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.
14. Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 μL de tampão de lise.
15. Deixe isso no gelo durante 30 min e vortex a cada 5 min. Alternativamente, coloque as amostras em um rotador de extremidade a ponta a 4 ° C durante este período.
16. CentrífugaSai a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os materiais insolúveis em detergente, então transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 μL deste lisado, adicione-lhe tampão de carga e desnaturar a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração "entrada", contendo proteínas endocitadas biotiniladas, bem como proteínas não biotiniladas.
17. Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 μL da pasta de estreptavidina-agarose ao lisado e incuba a 4 ° C por 3 h no agitador / balancim. Consulte 1.15 para obter detalhes adicionais sobre esta etapa.
18. Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s a 4 ° C.
19. Resuspendar os grânulos em 1 mL de tampão de lavagem e rolar durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (conforme o passo 2.18), e descarte o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas.
20. Grânulos de pelotização por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s, a 4 ° C, e descartar oveAcumulação de buffer de lavagem. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas por desnaturação a 95 ° C; Esta fração deve conter apenas proteínas internas de superfície celular (fração "endocitosa").
21. Separe a entrada, a superfície celular e as frações não ligadas por SDS-PAGE ¹³ e analise com o Western Blot ¹⁴ .
    NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas.

Resultados

Usando a biotinilação de superfície celular para avaliar a expressão da membrana plasmática de AQP4 em astrocitos
As culturas de astrocitos tratados com laminina e células de controlo não tratadas foram sujeitas a biotinilação de superfície celular usando os métodos descritos. As proteínas biotiniladas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose e depois separadas via SDS-PAGE. As frações de superfície celular foram avaliadas para AQ...

Discussão

Modificações:
Como esses métodos foram projetados para uso com células aderentes, especificamos o uso de PBS contendo 100 mg / L de MgCl ₂ ∙ 6H ₂ O e

100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para os passos de lavagem e como base de certos tampões de modo a garantir que as células permaneçam ligadas à superfície da cultura e que as junções célula-célula não sejam interrompidas. No entanto, os protocolos também podem ser aplicados a tipos de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
Bromophenol blue	Bio-Rad	#1610404
cOmplete protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21331
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamide	Bio-Rad	#163-2109
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma-Aldrich	L2020	Thaw on ice.
L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)	Leica Biosystems	B-DG-CE
Penicillin/streptomycin	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G6529
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
Streptavidin agarose resin	Thermo Fisher Scientific	#20347
Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody	Alomone	AQP-004
Tris base (Trizma base)	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500