Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Resumo

O objetivo do presente protocolo é avaliar o efeito dos factores pro e anti migratory na migração de células dentro de uma matriz tridimensional de fibrina.

Resumo

Atualmente, a maioria dos modelos em vitro de cicatrização, tais como ensaios de risco bem estabelecidos, envolvem estudando o fechamento da célula migração e ferida em superfícies bidimensionais. No entanto, o ambiente fisiológico no qual ferida na vivo tem lugar de cura é tridimensional, ao invés de bidimensional. Está se tornando cada vez mais claro que o comportamento da célula difere grandemente em bidimensional vs ambientes tridimensionais; Portanto, há uma necessidade de mais fisiologicamente relevantes em vitro modelos para estudar os comportamentos de migração celular no encerramento da ferida. O método descrito neste documento permite o estudo da migração celular em um modelo tridimensional que melhor reflete as condições fisiológicas do que ensaios zero bidimensionais previamente estabelecidos. A finalidade deste modelo é avaliar a consequência natural da célula através do exame de migração celular longe um esferoide corpo incorporado dentro de uma matriz de fibrina na presença de fatores de pro ou anti migratory. Usando esse método, célula consequência natural do organismo em uma matriz tridimensional de esferoide pode ser observado e é facilmente quantificável ao longo do tempo através de microscopia brightfield e análise da área de corpo de esferoide. O efeito de fatores pro-migratórias e/ou inibitórios sobre a migração de células também pode ser avaliado neste sistema. Este método fornece a pesquisadores com um método simples de analisar a migração celular no ferimento tridimensional associado matrizes em vitro, aumentando assim a relevância da vitro em células estudos prévio à utilização de animais na vivo modelos.

Introdução

Cicatrização de feridas é um processo complexo que resulta na restauração da integridade de tecidos após lesão. Este processo é dividido em quatro fases sobrepostas englobadas por hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação,-que cada um são regulados por uma combinação complexa de pistas solúveis, interações célula-matriz e comunicações célula-célula. ^{1 , 2} a orquestração destes tacos controla uma infinidade de respostas celulares na cicatrização de feridas, importante, incluindo migração celular. ^{3 , 4} migração celular é um processo altamente dinâmico dependente as propriedades bioquímicas e biofísicas de meio de matriz extracelular e celulares fenótipos. ⁵ células continuamente sonda ambiente matriz extracelular através de vias mediadas por integrina; Este processo permite que as células a perceber uma ampla gama de propriedades de matriz, incluindo topografia, rigidez e confinamento. Análise de bidimensional (2D) de migração celular demonstra que a migração é impulsionada pela formação de lamellipodia na vanguarda através da geração de feixes de filamentos de actina. Subsequente formação de aderências focais na vanguarda, em combinação com actomyosin conduzido contração e retração à aresta de fuga, conduz a célula para frente. ⁶ migração celular tridimensional (3D) atualmente não é bem compreendida, no entanto, estudos recentes demonstram que a migração 3D é marcadamente diferente do que o acima descrito o mecanismo em 2D e é, provavelmente, conduzido por mecanismos alterative. Por exemplo, estudos recentes por Petrie et al. demonstrado que, dependendo das propriedades do ECM, células em matrizes 3D podem alternar entre lamellipodium e lobopodium conduzido mecanismos de migração. ⁷ porque a migração celular é um componente crítico da resposta de cicatrização de feridas, modelos 3D de migração celular são críticos para compreender as respostas fisiológicas aos diversos estímulos durante a cicatrização de feridas. Embora o comportamento migratório de célula em superfícies 2D foi mostrado para variar muito de migração em matrizes 3D, modelos em vitro mais atuais de migração celular durante a processo, incluindo o ensaio de risco bem estabelecido, de cicatrização de feridas utilizam 2D culturas de monocamada. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} mais recentemente desenvolvidos ensaios utilizaram uma matriz 3D, mas ainda cultura de células em um monolayer em cima da matriz, limitando assim a capacidade de verdadeiramente recapitular a tridimensionalidade do ambiente celular in vivo. ¹⁵

O objetivo do método aqui descrito é estudar a migração celular em um modelo 3D fisiologicamente relevante, em vez de em uma superfície 2D, a fim de obter uma compreensão mais robusta de respostas de migração associados os estímulos aplicados. Este método permite a avaliação da migração celular dentro de uma matriz de coágulo de fibrina 3D na presença de fatores que ativar ou inibir vias associadas a migração celular. Uma matriz de fibrina foi escolhida para esse método devido as peças de fibrina papel crítico nos estágios iniciais de cicatrização de feridas; seguir lesão, um coágulo de fibrina é formada dentro de ambientes de ferida para travar a perda de sangue e serve como um andaime para infiltração de pilha inicial durante a remodelação e reparação tecidual. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} além disso, fibrina é usada clinicamente como um vedador cirúrgico e a composição dos selantes foi amarrada a migração celular e ultimate resultados de cura. Um estudo anterior por Cox et al. investigou a migração de fibroblastos com coágulos de fibrina, compostos de fibrina variada e concentrações de trombina para fins de otimização de um selante de fibrina. Nesses estudos, a migração de células de coágulos de fibrina em pratos plásticos foi quantificada. ²⁰ aqui apresentamos um método que permite a quantificação da migração de células dentro do ambiente 3D de fibrina. Enquanto o método descrito neste protocolo especificamente usa fibrina, este modelo pode ser facilmente modificado para usar materiais alternativos matriz conforme desejado, tais como colágeno ou outras matrizes 3D. Além disso, apresentamos o uso de esferoides de fibroblasto neste ensaio como a migração de fibroblastos no leito da ferida é de suma importância para a síntese de matriz extracelular e remodelação/reparação de tecidos. No entanto, durante o reparo processo neutrófilos são o primeiro tipo de célula para migrar para o leito da lesão, seguido por macrófagos. Fibroblastos, então, começar a infiltrar o ambiente da ferida aproximadamente 48 horas após a lesão inicial, no início da fase proliferativa da processo de cicatrização de feridas. ¹⁹ este ensaio pode ser facilmente modificado para incluir os neutrófilos, macrófagos ou outros tipos de células para avaliar como alterações na estrutura do coágulo de fibrina afetam a migração desses tipos de célula. ²¹

Para implementar este ensaio, em primeiro lugar, um esferoide de fibroblasto é formado usando uma modificação das técnicas descritas anteriormente para cultura de células-tronco. ²² o spheroid fibroblasto é posteriormente transferido para uma matriz de fibrina 3D, e a consequência pode ser facilmente monitorizada e quantificada durante vários dias. Este protocolo leva em consideração o 3D dos sistemas fisiológicos incorporando esferoides 3D celular dentro de uma matriz de fibrina, evitando assim as limitações na relevância provocada por um usando uma superfície de crescimento 2D com uma monocamada de células migratórias comportamento modelo, enquanto ainda permitindo a avaliação do comportamento de células em um ambiente altamente controlado em vitro .

Protocolo

1. dia 1: célula e preparação do reagente

Nota: toda preparação celular e reagente deve ser executada em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação das amostras.

1. Morna filtrada Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio (DMEM), soro bovino fetal (FBS), L-glutamina e penicilina/estreptomicina em banho maria a 37 ° C.
2. Preparar mídia de fibroblastos dérmicos humanos neonatal (HDFn), completando aquecido DMEM com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 1% L-glutamina.
3. Descongelar um frasco de congelados HDFns e centrífuga para 8 min a 200 x g para remover o meio de criopreservação. Ressuspender as células em meios de HDFn preparados em uma densidade de sementes de 1 x 10 ⁶ células/mL em um frasco de cultura T-75.
4. Balão de lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) para permitir a proliferação celular.
5. Loja HDFn mídia em 4 ° C.
6. Preparar pro e anti migratory reagentes conforme necessário.

2. Dia 3: Spheroid preparação

1. executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.
2. Quando células alcançar 80% de confluência, mídia, Aspire e adicionar 5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Balão de loja em uma incubadora de 37 ° C por 5 min separar totalmente as células da superfície do balão.
3. Adicionar 5 mL de mídia aquecida no balão para neutralizar a tripsina.
4. Em um tubo de microcentrifugadora, misture 10 μL de Trypan azul e 10 μL da suspensão celular.
5. Centrifugar a suspensão celular original para 8 min a 200 g. x
6. Enquanto a suspensão celular é ser centrifugada, adicionar 10 μL da suspensão celular Trypan azul para um hemocytometer e realizar uma contagem celular.
7. Após centrifugação, Aspire mídia sem desalojar o centrifugado. Ressuspender as células em uma concentração de 1,25 x 10 ⁵ células/mL.
8. Adicionar 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) para o fundo de um prato de Petri para manter um ambiente hidratado durante o crescimento do esferoide de 10 cm.
9. Inverter a tampa da caixa de Petri. Adicionar vários 20 μL gotas de suspensão de células para a superfície interna da tampa do prato de Petri.
10. Rapidamente inverter a tampa novamente e coloque-o na parte inferior do prato, tomando cuidado para não deslocar as gotas de suspensão. a Figura 1 ilustra o enforcamento com sucesso formado gotas.
11. Cuidadosamente coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C e permitir esferoides crescer em um enforcamento larga cultura por um período de 72 h.

3. Dia 6: Incorporação de esferoides em 3D Matrix

1. executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.
2. Para a formação da primeira camada de fibrina, criar uma solução de coágulo volume suficiente para adicionar 100 μL de solução de coágulo por alvéolo para poços como muitos como necessário (1 esferoide por alvéolo). Os coágulos são compostos de 10% 10 X HEPES de buffer por volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl ₂, pH 7,4), fibrinogênio humano de 2 mg/mL e trombina alfa humana de 0,1 U/mL. O restante do volume coágulo é composto de água ultrapura.
   1. Adicionar trombina última e rapidamente adicionar solução desejados poços em uma placa de 48 para prevenir coágulos de polimerização antes sendo adicionadas aos poços.
3. Suavemente agitar/torneira bem placa para garantir que a mistura do coágulo de fibrina é revestimento todo o bem e em seguida coloque a placa bem na incubadora para 1 h permitir que a camada inferior de coágulo polimerizar. Não agite bem placa forte o suficiente para induzir a formação de bolhas; simplesmente rock placa conforme necessário até que a totalidade do poço é revestida. Se volumes maiores de coágulo são utilizados, este passo pode não ser necessário.
4. Esferoides de transferência para a camada de fibrina. Placa
   1. remover o poço e o prato de Petri contendo esferoides no enforcamento soltar cultura da incubadora e examinar esferoides sob um microscópio. Em seguida, coloque o prato ao subúrbio de cultura.
   2. Inverter cuidadosamente a tampa da caixa de Petri para permitir o acesso para o enforcamento cair culturas.
   3. Cuidadosamente usando uma agulha 21G, ligada a uma seringa de 1 mL, transferir uma gota da tampa invertida no centro de cada bem, tomando cuidado para não perfurar a camada de fibrina polimerizada, revestindo o fundo do poço. Para efetivamente transferir a gota, puxe lentamente a queda para a agulha. Pare de puxar o êmbolo, assim que a gota inteira está dentro da agulha; puxando a queda para trás longe demais pode apresentar bolhas de ar, que podem interromper a transferência eficaz esferoide ou imagens subsequentes.
   4. Examinar a placa bem sob um microscópio para garantir que esferoides transferiram corretamente em poços tudo desejados.
5. Para a formação da segunda camada de fibrina, criar uma outra solução de coágulo, usando a mesma preparação como acima para a criação da primeira camada de fibrina (passo 3.2). Pipetar 100 μL em cada gota que contenham esferoide e examinar ao microscópio novamente para garantir que esferoides ainda estão intactos e não foram empurrados para as bordas dos poços cuidadosamente.
6. Devolve a chapa bem para a incubadora e permitir que a segunda camada polimerizar por 1 h.

4. Dia 6: Adição de fatores inibitórios ou Pro-migratória

1. mídia HDFn aquecido a 37 ° C.
2. Execute as seguintes etapas em um capuz para evitar a contaminação.
3. Preparar a mídia para cada grupo incluindo concentrações adequadas de pro/anti-migratory agentes a ser avaliada.
4. Remover a placa bem da incubadora e coloque em uma capa de cultura.
5. Adicionar 500 μL de mídia padrão para cada poço do grupo controle de esferoide, 500 μL de mídia inibitória a cada poço do grupo esferoide inibidora de migração e 500 μL de mídia pro-migratórias a cada poço do grupo migração aprimorada esferoide.
6. Devolve a chapa bem para a incubadora.
7. Mídia de mudança cada 48 h.

5. Dias 6-9: avaliação da migração celular e proliferação

1. imagem esferoides usando microscopia brightfield imediatamente após a adição da mídia (0 h) e em seguida cada 24h por 72 h. opcional: em cada ponto de tempo, pegue uma imagem de z-pilha a fim de determinar se migração está ocorrendo em aviões fora da área principal de foco. Em nossa experiência, isso não ocorre; no entanto, é útil garantir que este é o caso em cada experimento.
2. Uso ImageJ para determinar a consequência natural de célula em cada poço, analisando o aumento percentual de área para cada esferoide traçando a borda de célula para cada esferoide em cada ponto de tempo sucessivos e usando o " medida " função para obter a área de.

Resultados

Cultura de esferoide pode ser utilizada para avaliar com sucesso o efeito dos agentes pro e antimigratórias na migração de fibroblastos in vitro
Esferoides fibroblasto 3D podem ser formadas através de cultura de gota de suspensão durante um período de 72 h (Figura 1). Após o período de cultura, esferoides são incorporados dentro da matriz do coágulo e fotografaram usando microscopia brightfield (Figura 2

Discussão

Este protocolo permite para o exame de migração celular, na cicatrização de feridas associada ECMs através de um modelo 3D in vitro . Um passo crucial na boa execução do processo é o desenvolvimento adequado de esferoides de fibroblastos; concentração de células durante a preparação foi otimizada para dar uma concentração inicial de 2.500 células/soltar, permitindo esferoides de forma confiável ao longo de um período de incubação de 72 h. Se um número insuficiente de células é usado, esfer...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes