Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Resumo

Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.

Resumo

Os neurônios dependem a isolação elétrica e suporte trófico de oligodendrócitos microambiental. Apesar da importância de oligodendrócitos, as ferramentas avançadas atualmente utilizadas para estudar os neurônios, apenas parcialmente foram tomadas por pesquisadores do oligodendrocyte. Células específicas do tipo de coloração por transdução viral é uma abordagem útil para estudar a dinâmica de organela ao vivo. Este artigo descreve um protocolo para a visualização de mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro por transdução com vírus adeno-associado (AAV), carregando genes mitochondrial proteínas fluorescentes alvo sob o controle transcricional de o promotor de proteína básica da mielina. Inclui o protocolo para fazer organotypic fatias de cérebro de rato coronal. Segue um procedimento para Time-Lapse de imagem de mitocôndrias em seguida. Esses métodos podem ser transferidos para outras organelas e podem ser particularmente útil para estudar organelas na bainha de mielina. Finalmente, descrevemos uma técnica prontamente disponível para visualização de mielina Imaculada em fatias vivos pela microscopia Confocal reflectância (núcleo). Núcleo não requer nenhum equipamento extra e pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo.

Introdução

Matéria de branco do cérebro é composta de axônios de células nervosas envolvidos em mielina, uma membrana de plasma estendida especializada formada pelos oligodendrócitos. Mielina é necessária para a propagação do potencial de ação rápida e confiável e sobrevivência a longo prazo dos dendritos, e uma perda de mielina pode causar disfunção neurológica. Apesar de sua importância, as propriedades de oligodendrócitos são menos conhecidas em comparação com os neurônios e astrócitos. Consequentemente, menos ferramentas foram desenvolvidas para estudar oligodendrócitos.

Viva de imagem das organelas celulares como mitocôndrias, retículo endoplasmatic (ER) ou diferentes estruturas vesiculares podem ser útil para estudar as mudanças dinâmicas nas organelas ao longo do tempo. Tradicionalmente, imagem latente de oligodendrócitos vivos foi realizada em monoculturas^1,2. No entanto, oligodendrócitos em monocultura não exibir o compacto de mielina, e organotypic ou fatias de cérebro aguda podem, portanto, ser uma opção melhor, ao estudar o movimento de organelas e localização. Localização de pequenas organelas e proteínas na bainha de mielina pode ser desafiador devido à curta distância entre o dendritos axônio e a bainha de mielina circundante. Assim, procedimentos de imunocoloração microscópica luz sozinho não têm a resolução espacial para discriminar entre organelas na bainha de mielina e os dendritos axônio. Isso pode ser resolvido por transdução viral com genes para proteínas fluorescentes organela-alvo conduzidos pelos promotores de tipo específico de célula. As vantagens são uma expressão de célula específica e esparsa, que permite a avaliação precisa da localização da organela e dinâmica. Animais transgénicos também podem ser usados para atingir uma organela-alvo específicos de célula expressão³. No entanto, a produção e a manutenção de animais transgénicos é caros e geralmente não oferece a expressão esparsa que pode ser alcançada por métodos virais.

O método descrito aqui usa transdução viral de oligodendrócitos com proteínas fluorescentes mitocondrial-alvo (dsred ou verde proteína fluorescente, GFP) conduzido pelo promotor de proteína básica da mielina (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) para Visualizar mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro. Além disso, a expressão de uma outra proteína fluorescente no citoplasma (GFP usado junto com o mito-dsred ou tdtomato usado com mito-GFP) é usado para permitir a visualização da morfologia celular, incluindo os compartimentos citoplasmáticos da bainha de mielina. O protocolo inclui o procedimento para fazer fatias de cérebro de organotypic (uma versão modificada do protocolo descrito por De Simoni, Yu, 2006,^4,5). Em seguida, descrevemos o procedimento da imagem latente lapso de tempo para estudar o movimento mitocondrial. Este procedimento usa um microscópio confocal ereto com uma troca contínua do meio da imagem latente, uma configuração que permite fácil aplicação de drogas ou outras alterações médias durante a imagem latente. O procedimento da imagem latente lapso de tempo pode ser executado em qualquer microscópio confocal, com algum equipamento extra para manter vivas as fatias conforme descrito abaixo. O protocolo também contém várias dicas para otimizar imagens e reduzir a fototoxicidade.

Por último, uma maneira rápida e simples para visualizar a mielina imaculada pela microscopia Confocal reflectância (núcleo) é descrita. Isso pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido desenvolvidas para mielina imagem sem qualquer coloração necessária, mas a maioria destes requerem específico equipamento e conhecimentos^6,7,8. O procedimento descrito aqui usa as propriedades reflexivas da bainha de mielina e é uma versão simplificada de comprimento de onda único-excitação de microscopia de reflectância espectral de Confocal (Pontuação, no qual vários comprimentos de onda de laser é combinadas para visualizar mielina) ⁹. núcleo pode ser feito em qualquer microscópio confocal que tem um laser de 488 nm e um filtro de emissão 470-500 nm bandpass ou um filtro de emissão ajustável.

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Protocolo

os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela autoridade norueguesa de pesquisa Animal. Fornecedores e números de catálogo para os consumíveis e outros necessários equipamentos estão disponíveis na lista de materiais no final do documento.

1. preparação de fatias de Organotypic

Nota: esta receita usa dois filhotes de rato no pós-Natal dia 7-9 (p7-9), que rendem 24 fatias de organotypic divididas em dois pratos de seis-poço de cultura. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos devem ser feitos em uma capa de estéril e luvas de nitrilo ou látex devem ser usadas. Devem ser usados apenas ingredientes de grau de cultura celular.

1. Garrafas de autoclave, ferramentas de dissecação (1 tesoura grande, 1 pequena tesoura, 1 espátula plana grande, 1 pequena espátula arredondada e afiada e 1 fórceps, Ver os materiais de lista para obter detalhes), vidro pipetas, pontas de pipetas e lenços de tecido usados para a preparação de fatia.
2. Como metade das pipetas de vidro devem ser usados com grande abertura, romper a extremidade estreita.
   1. Pontuação com um scriber do diamante pen (se disponível) em torno da pipeta apenas abaixo do ponto onde o vidro começa a estreitar. Então coloque a extremidade pontiaguda da pipeta em uma luva de nitrilo ou similar. Cuidadosamente, quebre a ponta dobrando a pipeta enquanto a empurra contra uma bancada de trabalho.
   2. Então sem corte final quebrado, esfregando um pedaço de papel da areia ou derreter ligeiramente em um bico de Bunsen. As pipetas quebradas são usadas para transferir o cérebro corte fatias com extremidade quebrada transformada-se o bulbo de borracha e abre o grande final tocar as solução/fatias.
      Nota: Isto não é feito em uma capa de estéril e pode ser feito de vários dias de antecedência.
3. Preparar pratos de cultura.
   Nota: Isto pode ser feito no dia antes de cortar ou pelo menos 2 horas antes de cortar.
   1. Membranas de politetrafluoretileno (PTFE) esterilizar (" confetti "). Use duas pinças esterilizadas para retirar as peças de plástico azuis circundantes único confete e esterilizar mergulhando duas vezes em uma placa de Petri contendo 96% de etanol (EtOH). Em seguida, estabelecer confete flat em um prato de Petri estéril grande secar.
      Nota: O confetti são membranas PTFE hidrofílicas semelhantes das membranas nas inserções de cultura. O uso de confetes auxilia a imagem ao vivo porque única fatias podem ser facilmente transferidas da inserção para a configuração do microscópio, levantando o confetti com fórceps (ver 4.8. para obter detalhes). Alternativamente, as fatias do cérebro podem ser cultivadas sem o confetti (em que as fatias irão anexar diretamente para a membrana da inserção da cultura). Neste caso, a inserção da membrana deve ser cortada com um bisturi para transferir a fatia para o banho do microscópio.
   2. Adicionar 1 mL de meio de cultura (receita em reagentes ' tabela) para cada poço dos pratos bem seis cultura.
   3. Cultura de um lugar inserir em cada poço usando Pinças esterilizadas. Evitar bolhas de ar entre a inserção e o meio de cultura.
      Nota: Para economizar dinheiro e o ambiente, é possível reutilizar as inserções de cultura. Isso pode ser feito por lavagem completa em água destilada H ₂ O (dH ₂ O) seguida de incubação em 70% EtOH durante um período mínimo de 24 h até reutilização. Ao se preparar para uma nova cultura, secar as inserções em uma placa de cultura de células sob radiação ultravioleta (UV) luz de 15-30 min.
   4. Coloque dois confetti (esterilizado e seco) em cada uma das inserções da cultura. Coloque o confete para as bordas das pastilhas para sobreposição mínima.
   5. Colocar as placas na incubadora a 37 ° C com 5% CO ₂ cultura celular.
4. Meio de dissecação frio de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás bioxide (95% O ₂ /5%CO ₂). Para manter a solução estéril, conectar o tubo do cilindro de gás de um filtro de seringa estéril (tamanho de poros de 0,22 µm). Filtro
   1. par a outra extremidade da seringa a um tubo estéril conectado a uma pipeta de vidro estéril. Colocar a pipeta de vidro na solução, cobrir com parafilm e ligar o gás. Manter o meio de dissecação na Ice.
5. Preparar a área de dissecação/fatiar.
   Nota: Idealmente, este procedimento deve ser feito em uma capa de estéril. Se isto não for possível, o vibratome pode ser deixada em uma bancada de trabalho. Neste caso, é recomendável usar uma máscara de rede e cara de cabelo.
   1. Usando uma única borda lâmina de barbear, cortar um pedaço retangular (aproximadamente 2 cm x 0,5 cm) de gel de agarose (receita em reagentes ' tabela) e colar isso no palco do vibratome, tal que o lado comprido enfrenta a lâmina vibratome.
   2. Limpe todas as superfícies e as partes vibratome com 70% EtOH e limpe-o com lenços de tecido autoclavados.
      Nota: É importante que todas as peças que estarão em contato com o tecido cerebral são completamente secas desde EtOH pode danificar as células.
   3. Anexar uma lâmina de barbear estéril para o vibratome e executar a verificação de vibração se o vibratome tem essa função.
   4. Ferramentas de dissecação autoclavado lugar no bairro juntamente com tecido autoclavado wipes, quatro pequenos pratos de Petri, um bisturi de ponta redonda, 2 pipetas de vidro com bulbos de borracha, duas pipetas de vidro Open-end (ver pt. 1.1) e super cola (pulverizada com EtOH).
   5. Pour médio borbulhados dissecação para o barco de vibratome e para os quatro pequenos pratos de Petri.
      Nota: Este passo só deve ser feito imediatamente antes de dissecação desde médio a partir deste ponto não é borbulhar ou mantido no gelo
6. Montagem e dissecar cérebros.
   Nota: Para obter fatias de saudáveis, esta etapa deve ser feita rapidamente e com precisão. É necessário alguma prática.
   1. Eutanásia animal #1 pela luxação do neckor de acordo com as diretrizes locais e então decapitar com a tesoura grande.
   2. Usando pequenas, afiadas tesouras, rapidamente retire a pele, fazendo uma incisão sagital do pescoço ao nariz e retirá-para revelar o crânio.
      1. Corte ao longo da sutura sagital, seguida por incisões laterais na parte interior dos ossos frontal e a sutura lamboid (fronteira entre os hemisférios e cerebelo).
      2. Use pinça para dobrar aberto no crânio de cada lado. Os nervos cranianos são cortados do cérebro inserindo uma espátula arredondada, afiada sob o lado ventral do cérebro e suavemente movendo a espátula lateralmente.
   3. Usar uma lâmina única borda para fazer uma coronal corte rostral no cerebelo.
      Nota: Esta corte irá determinar o ângulo em que as fatias são cortadas. É, portanto, conveniente em um ângulo reto.
   4. Flip o cérebro fora do crânio e em um pequeno prato de Petri contendo meio de dissecação.
   5. Repetir passos 1.6.1.-1.6.4. para animal #2 e lugar este cérebro em uma segunda Petri dish.
      Nota: Os animais não são estéreis. Faz a dissecação de um lado da capa e em seguida, mova para o lado oposto, limpo uma vez que o cérebro tem sido retirado do crânio.
   6. Alterar luvas.
   Cérebro de anexar
   7. para vibratome fase: adicionar uma camada fina de super bonder no palco em frente do gel do agarose montado. Segure o lado do cérebro #1 com uma simples espátula grande com o recém cortadas (caudal) tocando a espátula e o revestimento do lado ventral (e sendo tão perto quanto possível) o gel de agarose.
      1. Em seguida, Coloque suavemente o cérebro para a cola por estendendo-os a espátula com um conjunto de pinças. Certifique-se de deixar espaço suficiente para o cérebro #2.
         Nota: É importante que o cérebro está bem conectado ao palco, mas sem excessiva colagem, como isto pode obstruir o corte.
   8. Imediatamente após a montagem do cérebro #1, use a espátula grande para adicionar algumas gotas de meio de dissecação em cima do cérebro. Isto manterá o cérebro húmido, endurecer a cola e evitar que grudem para os lados dos cérebros.
   9. Repita etapas 1.6.7 e 1.6.8. para cérebro #2.
   10. Anexar o palco sobre o barco de vibratome.
7. Corte 230 µm coronal fatias grossas com uma amplitude de 1-1.5 mm, uma frequência de 85 Hz e uma velocidade de 0,2 mm/s. Collect fatias aproximadamente entre 1,4 mm rostral e caudal de Bregma 2,1 mm.
   1. Fatias coletar cortarem cada fatia usando pipetas de vidro Open-end (pt. 1.1). Transfira as fatias para uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Usar um bisturi arredondado para cortar as fatias em dois pedaços, dividindo os dois hemisférios.
8. Quando todas as fatias são cortadas, coloque as fatias para os pratos de cultura.
   1. Tirar o prato de cultura (um de cada vez) a incubadora.
   2. Cuidadosamente usando as pipetas de vidro Open-end, transferir uma fatia para cada um dos papelinhos.
      Nota: As fatias devem deitado no meio do confete. Isto requer alguma habilidade. No entanto, se algumas fatias não são perfeitas, é melhor deixá-los do to gastar tempo tentando movê-los como é importante entrar todas as fatias da incubadora mais rápido possível.
   3. Usar uma pipeta de vidro (extremidade pontiaguda) para remover suavemente o excesso de meio sem tocar a fatia.
      Nota: Fatias não devem ser mergulhadas em água durante a incubação. Assim, o excesso de meio deve ser aspirado tal que as fatias são expostas ao ar (uma fina película de médio ainda vai cobrir as fatias). Fatias que permanecem imersos no líquido serão geralmente insalubre ou morrer (4 e nossas observações).
   4. Mover o prato de volta na incubadora, uma vez que todos os papelinhos tem uma fatia.
   5. Repita etapas 1.7.8.-1.8.4. prato #2.
9. Alterar o meio de cultura.
   Nota: Isto deve ser feito no dia seguinte (dia 1 in vitro, DIV1) de corte e em seguida a cada 2-3 dias.
   1. Pré-aqueça o meio de cultura em banho-maria ou incubadora.
   2. Em um capuz estéril, usar sucção à vácuo ou uma pipeta regular com uma ponta estéril para aspirar o meio de cultura de cada poço. Isto é feito delicadamente derrubando o prato (por cerca de 30 graus) e colocando a ponta da pipeta na borda da inserção da cultura.
   3. Remover aproximadamente 800 µ l de cada poço (deixando apenas suficiente médio para manter a parte inferior da inserção da coberta no meio). Em seguida, usando uma pipeta limpa, adicione 800 µ l do meio pré-aquecido a cada poço. Em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora de cultura celular.

2. Transdução viral

1. compra ou fazer AAVs com um plasmídeo de interesse, conforme descrito anteriormente, ^{10 , 11}.
   Nota: Este protocolo descreve o uso do serótipo AAV 2/8 (AAV 2/8) carregando mitocondrial alvo dsred ou GFP como gene repórter sob o controle transcricional da proteína básica de mielina promotor ¹² (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) para visualizar as mitocôndrias oligodendrocyte. AAV 2/8 carregando GFP ou tdtomato como gene repórter conduzido pelo promotor geral CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) é usado para visualizar o citoplasma oligodendrocyte. Assim, a combinação de AAV2/8 MBP_mito_dsred com CAG_GFP de AAV 2/8 dá mitocôndrias vermelhas e verde citoplasma em oligodendrócitos, Considerando que a combinação de AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dá verdes mitocôndrias e citoplasma de vermelha. As construções são descritas em mais detalhe em outro lugar ¹³.
2. No dia 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrócitos com os AAVs.
   Cuidado: Siga as normas de segurança para trabalhar com AAVs. Certifique-se de ter a formação adequada e a aprovação de nível de biossegurança exigido. Todos os pontos seguintes devem efectuar-se em um gabinete de segurança biológica classe II usando luvas e avental. Aqui, aplicação do vírus adeno-associados à área das fatias de córtex é descrita, como esta é a área que mostra a melhor recuperação. Meio de cultura de
   1. dilua o AAV no pré-aquecido (37 ° C). Diluições em torno de 2 × 10 ⁹ genoma cópias/mL (GC/mL) são recomendadas para obter uma transdução esparsa de oligodendrócitos, que permite a geração de imagens de células únicas dentro da fatia. No entanto, um piloto usando diferentes títulos deve ser feito para garantir uma densidade de oligodendrócitos transduzidas que é adequada para as experiências específicas. Se forem utilizados dois AAVs diferentes, deveriam ser misturadas na mesma solução e adicionados à auxiliar simultaneamente.
   2. Adicionar cerca de 1,3 µ l diluída AAV para cada fatia: Certifique-se de fora da ponta da pipeta é seca. Pipetar µ l 1.3 diluído AAV e segurar a pipeta acima do córtex, tão próxima quanto possível sem tocar na fatia com a ponta da pipeta (cerca de 1 mm).
   3. Então Empurre lentamente uma solução fora da pipeta. Quando a solução toca a fatia, mova a ponta da pipeta sobre o córtex para espalhar a solução sobre a área do córtex inteiro.
      Nota: Este procedimento deve ser feito tão rapidamente quanto possível para evitar manter as fatias para fora do capô por mais tempo do que o necessário. Fazer isso em um prato ao tempo e o primeiro prato que volta na incubadora antes de começar no prato #2. Para obter uma distribuição satisfatória de AAV, sem danificar o tecido requer alguma prática e uma mão firme.
3. Se um microscópio de fluorescência vertical está disponível no laboratório de célula, a expressão da proteína pode ser verificado durante o tempo em cultura, colocando o prato sob o microscópio.
   Nota: O prato não deve ser mantido fora da incubadora por mais de 2-5 minutos.

3. Imagem de lapso de tempo

Nota: A imagem pode ser realizada sempre que os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes são suficientes e as fatias com um ar saudáveis (geralmente DIV11-14).

1. Certifique-se que o microscópio, perfusão e aquecimento estão corretamente configuradas para que a solução de imagem borbulhada é aquecida e pode entrar e sair do banho.
   Nota: Existem várias soluções para câmaras de banho. Uma versão simples é apresentada aqui.
   1. Fazer em - e tomadas do banho por agulhas de seringa cega (curvado ~ 45 °) que estão conectados para os lados da banheira por aderência blu-aderência/fun.
   2. Certifique-se de que a tubulação vai de um frasco de solução de imagem borbulhado continuamente, através da bomba peristáltica, através do tubo de aquecimento da caldeira e depois para a agulha da seringa a entrada no banho.
   3. Conectar-se a outro tubo à saída da agulha da seringa. Este tubo depois vai através da bomba peristáltica e volta para o frasco de solução de imagem (ou uma garrafa de resíduos).
2. Solução de imagem de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás de bioxide.
   Nota: Isto deve ser started pelo menos 15 minutos antes de imagem e continuar durante todo o experimento.
3. Vez na bomba peristáltica e aquecedor e executar a solução através do banho para obter a temperatura ideal de banho (37 ± 0,5 ° C). Certifique-se de que o sensor do termómetro conectado à unidade de temperatura está submersa na solução banho.
4. Ligar o microscópio, lâmpada da fluorescência e lasers apropriados.
Caminho de
5. conjunto acima uma luz adequada para a amostra.
   Nota: Isto pode variar dependendo da configuração do microscópio e sonda. Conhecimento geral de como usar o microscópio confocal é necessário e não será tratado aqui.
6. Usar um objectivo de imersão de água com o apropriado ampliação e abertura numérica (n.a.). Nós usamos um objectivo de plano-apochromat de imersão de água 40 x (n.a. 1.0).
7. Open pinhole para alcançar uma secção óptica de aproximadamente 2 a 2,5 µm para o vídeo lapso de tempo. Isso reduz a ocorrência de mitocôndrias, movendo-se fora de foco durante o lapso de tempo.
8. Fatia de organotypic de transferência para o banho:
   1. Adicionar uma gota de solução de imagem ou de meio de cultura para uma placa de Petri de plástico pequeno.
   2. Em uma capa de estéril, estéril de uso de fórceps para transferir uma fatia de organotypic da membrana inserir para a gota. O fórceps só devem tocar o confete e não a fatia.
   3. Colocar a tampa sobre o prato de Petri.
   4. Imediatamente colocar a placa de cultura contendo o resto das fatias de volta na incubadora.
   5. Trazer placa de Petri contendo fatia para o microscópio.
   6. Desligar a bomba peristáltica enquanto transfere a fatia para banho de microscópio. Primeiro, use fórceps para levantar confetti com fatia de placa de Petri para o topo do banho (o confetti flutuarão). Então coloque as duas pontas da pinça de cada lado do confete para que eles toquem o confete sem tocar a fatia e empurre o confetti através da solução no fundo da banheira. Centralizar o confete no meio do banho.
   Uso de fórceps para colocar a âncora de grampo (harpa) em cima do Confeti sem tocar a fatia de
   7. .
      Nota: Uma harpa é uma âncora de platina em forma de ferradura que é usada para evitar que a fatia de flutuante ou à deriva no banho. Para fatias agudas, cordas finas correr de um lado da harpa para o outro (semelhante a uma harpa de música). Para fatias de organotypic, a harpa deve ser stringless e ajustar o tamanho do confetti de tal forma que ele pode pôr em cima do Confeti sem tocar a fatia.
   8. Ligar bomba peristáltica.
9. Baixar o objectivo para a amostra.
10. Selecione a célula e região para imagem.
    Nota: Evite a exposição excessiva das células da luz de laser, pois isso pode causar toxicidade celular (veja dicas nos pontos abaixo).
    1. Use as oculares e a lâmpada fluorescente para encontrar um oligodendrocyte aparência saudável com a expressão correta. Tipicamente, oligodendrócitos que têm um forte superexpressão da proteína fluorescente aparecem insalubres. Oligodendrócitos insalubres terão processos com uma aparência sem forma, e as mitocôndrias aparecerá fragmentadas. Oligodendrócitos saudáveis, a soma e processos aparecem lisos e mitocôndrias têm vários comprimentos (embora normalmente muito mais curto do que em neurônios e astrócitos ^{13 , 14 , 15}).
    2. Coloque a célula de interesse no meio do campo de vista.
    3. Uso o " viver " função no software (para microscópios Zeiss e Leica) para identificar a célula na tela e escolha uma área de interesse, por exemplo, uma parte da célula que contém vários processos primários ou bainhas de mielina ou um único processo ou bainha de mielina.
       Nota: Para conseguir o máximo de processos/bainhas de imagem possível, escolher áreas contendo processos que põem relativamente plana na direção x-y.
    4. Ampliar o campo de interesse (normalmente, produzindo uma imagem com tamanho de pixel de 0,14 - 0,30 µm).
    5. Usando o " regiões " tool, desenhe um retângulo ao redor da área e escolha a opção para digitalizar apenas a região selecionada. Varredura de tempo e, portanto, exposição do laser, é reduzida pela verificação somente a região selecionada.
       Nota: Regiões retangulares horizontais serão digitalizadas mais rápido do que o verticais regiões devido ao menor número de linhas digitalizadas necessário. Se uma região retangular vertical é digitalizada, o tempo de digitalização pode ser reduzido, rodando o campo de verificação de 90º (usando a ferramenta de rotação).
11. Poder de ajuste do laser e ganho para ter uma boa visão sobre mitocôndrias.
    Nota: Use o poder do laser mínimo necessário. Se possível, aumente o ganho ao invés de crescente poder do laser. Além de causar toxicidade celular, poder do laser muito alto irá branquear os objetos imagens ao longo do tempo, exigindo um novo aumento de potência do laser ou ganho durante a verificação. O poder do laser necessária e ganho dependerá do nível de expressão e o microscópio. Com um microscópio confocal LSM700, usamos um 555 nm laser com uma potência de 20-40 µW para imagem dsred ou tdtomato e um 488 nm do laser é usado em 20-30 µW a imagem GFP (medido na abertura traseira do objectivo de poder do laser). Ganho é definido alto para geração de imagens ao vivo, geralmente na faixa de 700-800 para as boas práticas agrícolas e 850-980 para dsred e tdtomato. O alto ganho pode causar algum ruído de fundo mais, que é removido, aumentando o deslocamento digital (deslocamento valores normalmente colocam entre 0 e 15). Em nossa experiência, usando o MBP_mito_GFP dá um melhor sinal-ruído do que MBP_mito_dsred.
Velocidade de digitalização
12. select.
    Nota: Minimizar o tempo de digitalização usando uma velocidade de digitalização rápida e desenhando-se uma pequena região de digitalização (ver ponto 4.10.5 abaixo). Também é possível salvar a digitalização tempo realizando uma varredura bidirecional. No entanto, isso não é recomendado devido à pior qualidade de imagem.
13. Conjunto de frequência e duração da gravação de lapso de tempo, por exemplo, captura imagens em 2 segundos para um total de 20 minutos para a imagem latente mitocondrial em oligodendrócitos.
    Nota: A frequência e a duração devem ser definidas de acordo com a mobilidade dos objetos de interesse. Maior frequência irá expor o espécime para mais a luz do laser, mas mais rápido-mover objetos também exigem uma menor duração total de vídeos de lapso de tempo (por exemplo, as mitocôndrias nos neurônios, que se movem com mais frequência e em uma velocidade muito maior do que as mitocôndrias em oligodendrócitos, são tipicamente fotografada a cada segundo por um total de 2 minutos ¹⁶).
14. Iniciar a gravação de lapso de tempo.
    Nota: O mitocôndria pode mover-se fora de foco e/ou deriva da região da imagem durante a gravação. Para minimizar as vibrações e movimento, ajuste em - e saídas de banho e reduzir a velocidade da bomba, se necessário. Pequenas mudanças em foco geralmente ainda ocorrem. Assim, o monitoramento contínuo da tela durante a imagem latente é necessária, com pequenos ajustes do foco durante a gravação.
15. Captura uma z-pilha da célula inteira para futura identificação de célula e fotografada processo.
    Nota: Para melhor resolução, a pinhole deve ser reposto para 1 unidade arejada para a pilha de z.
16. Opcional: Visualizar mielina imaculada.
    Nota: Em oligodendrócitos transformados com GFP (citoplasmática), das bainhas de mielina geralmente pode ser identificadas como linhas retas do citoplasma (as cristas citoplasmáticas) ligadas a um processo primário (ver Figura 2 A e B). No entanto, se a expressão de GFP é demasiado fraco ou um marcador citoplasmático não é usado, é possível visualizar a bainha de mielina por microscopia confocal de reflectância (núcleo), como explicado aqui.
    1. Configurar um novo caminho de luz no software com excitação do laser em 488 nm e captura emitida luz em torno do mesmo comprimento de onda, por exemplo, 470-500 nm.
    2. Ajustar poder laser e ganhar até mielina é visível (ver exemplo em < forte classe = "Xfig "> Figura 3). Usando um microscópio de LSM 510 Meta, normalmente usamos um poder do laser de 7-12 µW (medido na abertura traseira do objectivo).
17. Opcional: elaboração de fatias de imunocoloração.
    1. Se a célula de imagem deve ser identificada após imunocoloração, capturar uma imagem de baixa ampliação (10x) da célula e indique sua localização na imagem desenhando uma seta ou similar. Para auxiliar a deteção da célula, recomenda-se também desenhar um mapa manual da fatia inteira, indicando a localização da célula.
    2. Fix fatia em paraformaldeído 4% (PFA) agitador por 1 hora em temperatura ambiente.
       Atenção: O PFA é prejudicial. Usar protectores e só usar um capuz ventilado.
    3. Diluir o fixador 01:10 em PBS e sai a 4 ° C até começando a imuno-histoquímica conforme descrito em outro lugar ¹⁷.
       Nota: Embora as fatias podem ser deixadas no fixador diluído por várias semanas, fluorescência pode desvanecer-se. Realização de imuno-histoquímica no prazo de 10 dias de fixação é recomendada.

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Resultados

Organotypic fatias de cérebro que foram cultivadas e transfectadas conforme descrito acima mostraram uma distribuição esparsa de oligodendrócitos corticais expressando mito_dsred e GFP. Imunocoloração com anticorpos contra Olig2 e MBP confirmou que a expressão era específica de oligodendrócitos (Figura 1).

Para geração de imagens ao vivo, oligodendrócitos transduzidos foram reconhecidos ...

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Discussão

O protocolo para fazer culturas de organotypic descritas aqui é uma versão modificada de¹⁸ do protocolo descrito por De Simoni e Yu (2006)⁵. As mudanças mais importantes foram esboçadas abaixo. Tampão Tris é adicionado ao meio de cultura, o que melhora a sobrevivência das fatias quando fora da incubadora durante a transdução viral e mudança do meio de célula. O procedimento de esterilização para confetti também mudou. Enquanto outros protocolos esterilize conf...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
BD Microlance 19G	BD	301500	Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas	AGA	105701
Brand pipette bulbs	Sigma-Aldrich	Z615927	Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner)	VWR	89038-530
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	64-0106	Temperature controller - thermometer part
CaCl2	Fluka	21100
CO2	AGA	100309	CO2 for incubator
Cover glass, square Corning	Thermo  Fischer Scientific	13206778	To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Delicate forceps	Finescience	11063-07	For dissection
Diamond scriber pen	Ted Pella Inc.	54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm	VWR	612-1702	Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade	Electron Microscopy Sciences	#7200	Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	Gibco-Invitrogen	24010-043
Filter paper circles	Schleicher & Schuell	300,220	Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack	Loctite	1270884	Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2	Katrin	344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber,	Warner Instruments	64-1418	Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3	Sigma	H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2	Heto-Holten	96004000M	Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated	Gibco-Invitrogen	26050-088
KCl	Sigma	P9541
LCR Membrane, PTFE,	Millipore	FHLC0130	Confetti
Leica VT1200	Leica	14048142065	Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES	Thermo  Fischer Scientific	42360024
MgCl2	R.P. Normapur	25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B	Electron Microscopy Sciences	62411-B	Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit	Millipore	SLGPM33RA	Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm	Millipore	PICM03050	Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module	GILSON	F155001	Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaHCO3	Fluka	71628
Nunclon Delta Surface	Thermo  Fischer Scientific	140675	Culture plate
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000	Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm	VWR	291-1211
Paraformaldehyde, granular	Electron Microscopy Sciences	#19208
PC-R perfusion chamber	SiSkiYou	15280000E	Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15070-063
Petri dish 140 mm	Heger	1075	Large Petri dish
Petri dish 92x16 mm	Sarstedt	82.1473	Medium Petri dish
Petridish 55x14,2 mm	VWR	391-0868	Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417	PBS tablets
R2 Two Channel Head	GILSON	F117800	Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Large spatula for dissection
Sand paper	VWR	MMMA63119	Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm	Finescience	14130-17	Large scissors for dissection
Scissors, 8,5	Finescience	14084-08	Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade	Electron Microscopy Sciences	#71972	Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm	Millipore	SCGPT05RE	Filter to sterilize solutions
Super glue precision	Loctite	1577386
Surgical scalpel blade no. 22	Swann Morton Ltd.	209	Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B	Warner Instruments	64-0100	Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base	Sigma	T1503
Trizma HCl	Sigma	T3253
Water jacketed incubator series II	Forma Scientific	78653-2882	Incubator