A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

Resumo

Este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que é um dispositivo compartimentado, projetado para orientar e restringir as larvas zebrafish. O projeto permite a transecção de cauda e a longo prazo coleção de imagens de alta resolução de microscopia fluorescente de cicatrização e regeneração.

Resumo

A larva de peixe-zebra é um organismo modelo importante para biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas. Além disso, a larva de peixe-zebra é um sistema valioso para ao vivo de alta resolução imagem microscópica dos fenômenos biológicos dinâmicos no espaço e no tempo com resolução de celular. No entanto, o tradicional método de encapsulamento de agarose para geração de imagens ao vivo pode impedir o desenvolvimento larval e regeneração do tecido. Portanto, este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que foi projetado e fabricado como um dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar as larvas para microscopia de alta resolução, permitindo transecção da barbatana caudal dentro do dispositivo e desenvolvimento subsequente de cauda desenfreada e re-crescimento. Este dispositivo permite a imagem a longo prazo, mantendo a viabilidade e ferindo. Dado que o molde de zWEDGI 3D impresso, a personalização de suas geometrias torná-lo facilmente modificado para zebrafish diversos aplicativos de imagem. Além disso, o zWEDGI oferece que inúmeros benefícios, tais como o acesso para a larva durante a experimentação ferindo ou para a aplicação de reagentes, em paralelo a orientação de várias larvas para a imagem latente simplificada e reusabilidade do dispositivo.

Introdução

A capacidade regenerativa de larvas de peixe-zebra Danio rerio tornam um organismo modelo ideal examinar a resposta de ferida, bem como a cura e regeneração do^1,2,3,4. Acesso a uma matriz de linhas zebrafish transgênicos e anatômica transparência do zebrafish ainda mais aumentar sua utilidade para estudos em vivo da ferida resposta eventos, bem como de longo prazo processos regenerativos⁴. O estudo desses processos biológicos usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de alta resolução, portanto, exige um dispositivo de zebrafish imagens ao vivo que permite alta estabilidade e movimento mínimo da larva zebrafish, mantendo a viabilidade. É a chave que o dispositivo permite ferindo eficaz enquanto cura e regeneração ocorrer não afetado pelo dispositivo.

O padrão método estabilização de imagens ao vivo de incorporar a larva em agarose durante a imagem latente ao vivo restringe o crescimento e ferida regeneração⁵ e pode aumentar as taxas de morte uma vez que as larvas começam a mostrar sinais de necrose de tecido e estresse cardíaco após quatro horas⁴. Portanto, a remoção de agarose de regiões de interesse é muitas vezes necessária para permitir o desenvolvimento normal e regeneração⁶, expondo as larvas de dano potencial, como o agarose é cortar fora. Além disso, com o agarose incorporação técnica, o usuário deve orientar as larvas em curto espaço de tempo antes que a agarose solidifica^5,6,7. Rapidamente manipulando a larva requer não apenas a habilidade do usuário, também corre o risco de danos para a larva. Embora métodos para estabilizar a larva para geração de imagens ao vivo têm sido descritos para contornar estes inconvenientes, tais como agar estriadas poços³ ou divets⁸, o uso do vácuo do silicone graxa para criar uma imagem de câmara com tubulação de PVC ou outro materiais⁶e rotacional tubo⁹, muitos destes métodos são de trabalho intensivo, desarrumado, muitas vezes não recuperável e não permitir a manipulação ambiental (tratamentos, ferindo de drogas etc.) depois que o peixe tem sido montado.

Portanto, o dispositivo de zWEDGI (Figura 1) foi projetado para superar algumas das desvantagens de ágar de montagem para a imagem latente ao vivo a longo prazo de larvas de zebrafish permitindo a manipulação da amostra. O zWEDGI consiste de três semi-aberto compartimentadas câmaras (figura 1A) para permitir para carregamento, retenção, ferindo e imagem latente de larvas de zebrafish pós fertilização de 2 a 4 dias. O dispositivo é fabricado a partir de polidimetilsiloxano (PDMS) e colocado a lamínula de um prato de imagem de 60 mm vidro inferior. O projeto apresentado aqui foi destinado para estudos de cura ferida, no entanto o uso de um design modular e tecnologias de fabricação padrão fazer o design de zWEDGI modificável e passível de uma variedade de procedimentos experimentais, especialmente para os procedimentos que exigir a retenção mínima com manipulação experimental e imagem a longo prazo.

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Protocolo

Nota: O projeto de zWEDGI base foi formulado para larvas de zebrafish pós-fertilização de 2 a 4 dias (dpf) e sigam as orientações do centro de recursos da Universidade de Wisconsin-Madison pesquisa animais.

1. design e impressão 3D de moldes

1. modelo o PDMS componente do dispositivo com geometrias desejadas e atributos em um 3D modelagem de software ⁵. Criar um assembly de um molde em branco e a parte PDMS e gerar um molde negativo para a parte PDMS, criando uma cavidade no molde correspondente à parte PDSM. Salve o molde como um arquivo. STL para impressão 3D ( Figura 2, etapa 1.1).
   Nota: Um arquivo de formato (. STL) estereolitografia do design do molde aqui apresentado ( Figura 1) está disponível para download em https://morgridge.org/designs/.
Moldes de
2. imprimir usando uma impressora 3D de fotopolímero ( Figura 2, etapa 1.2). Fazer vários moldes em uma única impressão, se possível, então, mais do que um dispositivo pode ser moldado com um único lote de PDMS.
   Nota: O exemplo mostrado foi impressa no modo de alta resolução com uma 0,075 mm feixe diâmetro e 0,05 mm espessura, utilizando fotopolímero resina ⁵.
   1. Moldes limpa usando um pincel fino, álcool desnaturado em um frasco de spray e ar comprimido suavemente Esfregue e remova a resina não polimerizada. Remover qualquer material proveniente das regiões microchannel.
   2. Pós-curar os moldes em um instrumento de cura UV post por 60 min de cada lado, como renunciar não polimerizada é tóxico para as larvas de zebrafish ¹⁰.
3. Do lado da cavidade do molde com lixa de grão 200 sobre uma superfície plana de areia até que todas as superfícies de vedação estejam em contato com a lixa (carregamento de geometrias de canal e o perímetro do molde). Lixe levemente com 400 e 600 lixa, progressivamente, para produzir superfícies lisas niveladas através de todos os revestimentos de geometria ( Figura 2, etapa 1.3). Medir a profundidade da cavidade após o lixamento com um indicador de dial para verificar se ele é próximo a profundidade projetada.
   1. Limpar moldes e cobrir os discos (1 ¾ de polegada de diâmetro x ¼ de polegada espessura de vidro de borosilicato ou acrílico; um vidro cobrir por molde), colocando em um ultra-som limpador cheios de água por 30 min ou lavagem com água corrente.
   2. Assoprar seque com ar comprimido e limpar ambos os moldes e cobre com álcool isopropílico e ar comprimido filtrado. Use um banco limpo como um lugar para fabricar os dispositivos para minimizar a contaminação de detritos no ar. Deixe os moldes limpos e vidro abrange o banco limpo ou um prato de petri coberto até que seja necessário.

2. PDMS fabricação do dispositivo de zWEDGI

1. fazer o PDMS por 184 derramamento do silicone elastômero polydimethylsiloxane (PDMS) na proporção de 5:1 (base para activator) em um copo de plástico. Misture bem por 2 min com uma vara de madeira do ofício, agitando o gel sobre sobre si mesmo, como amassar o pão. Para 5 moldes, use 10g de base e 2 g de ativador.
   1. De gás mistura num exsicador de vácuo para 25-45 min até todas as bolhas sumiram.
   2. Preencher a cavidade de cada um dos moldes 3D impressos com aproximadamente 0,75 mL de PDMS utilizando uma seringa de 10mL até o molde ligeiramente transborda com um menisco ( Figura 2, etapa 2.1).
   3. De gás os moldes preenchidos por 45 min remover as bolhas adicionais que podem ter se formado durante o preenchimento.
2. Aplicar um disco de tampa de vidro na parte superior do molde cheio de PDMS, pressionando o disco para baixo em um ângulo para impedir que as bolhas sejam presos ( Figura 2, etapa 2.2). Permitir o excesso PDMS ser expulso como a capa de disco de vidro é aplicada.
3. Uso da catraca pequena braçadeira de prender o disco tampa firmemente ao molde.
   Nota: Isso cria uma superfície plana quando o PDMS é curado e produz-se através de orifícios onde as geometrias 3D impressas estão alinhadas com a lamela de vidro. Como alternativa, para aumentar o número de dispositivos que podem ser curadas ao mesmo tempo, construir um dispositivo de grampo multi (por exemplo. Figura 2, passo 2.3).
4. Curar o dispositivo PDMS nos moldes preso no 100 ^o C em um forno para 90 min ( Figura 2, passo 2.4). Retire os moldes do forno e deixar arrefecer até eles podem ser facilmente manipulados. Se o dispositivo de fixação metal, remova o conjunto de disco molde e tampa da mordaça para impedir que o metal continuar curar o PDMS devido ao calor residual.
   Nota: O dispositivo é mais fácil de remover do molde enquanto ainda mornos e não totalmente curado. No entanto, uma vez que o molde é removido do forno e o disco de capa é removido, o dispositivo pode sentar-se por um par de dias antes de prosseguir para desmoldagem. Se o dispositivo é desenformado logo depois de retirar do forno de cura, coloque-o em um prato de petri coberto para minimizar contaminantes ao mesmo tempo que lhe permite curar totalmente.

3. ZWEDGI de plasma-ligação para o prato de vidro

1. pinça o molde que contém o dispositivo PDMS em um torno de bancada para que o molde ' geometrias s estão enfrentando até, paralelamente ao banco da estação de trabalho.
   1. Start para remover o dispositivo PDMS, liberando o PDMS puxar guia do molde usando uma pinça com ponta plana. Trabalho em torno do perímetro do molde com a pinça (como tirar um bolo fora de uma pan ( Figura 2, passo 3.1)).
   2. Uso filtrada de ar comprimido e uma pinça para puxar suavemente o dispositivo fora do molde, segurando a guia de puxar e soprando ar sob o dispositivo. Trabalhar lentamente, permitindo que o ar para ajudar separado o PDMS do molde, tendo especial cuidado com as pontas de uma pinça em torno as seções finas túnel.
2. Coloque o dispositivo PDMS de cabeça para baixo no interior da capa de um prato com fundo de vidro para que a restrição túnel cunhas são tocar o plástico ( Figura 2, passo 3.2).
3. Coloque a tampa de prato com zWEDGI de cabeça para baixo e o prato com fundo de vidro correspondente em um plasma limpador com o vidro interior virada para cima ( Figura 2, passo 3.3).
   1. Evacuar o plasma câmara de limpeza até que a pressão atinge 500 mTorr.
   2. Conjunto poder de radiofrequência (RF) de alta. Exponha o dispositivo e o prato de frequência de RF para aproximadamente 2 min. lentamente depressurisem a câmara e retornar o dispositivo e o prato para uma capa de sala limpa.
4. Remover o dispositivo PDMS da tampa do prato. Vire o zWEDGI PDMS para a orientação correta sobre o vidro, posicionando-o cuidadosamente sobre o centro bem do prato fundo vidro ( Figura 2, passo 3.4)
   1. usando o back-end de uma pinça, pressione levemente sobre o PDMS dispositivo para garantir que as bolhas de ar não fiquem retidos por baixo. Aplique pressão em torno da minutos geometrias dos canais micro e suavizar o PDMS nas bordas ( Figura 5).
      Nota: Completo contato entre o vidro e o PDMS garante melhor aderência do adesivo de plasma. O dispositivo de zWEDGI pode ser plasma ligado para outros formatos de prato com fundo de vidro, como um vidro com fundo 6-poços plate ( Figura 2).
   2. Colocar a cobertura sobre o prato de dispositivo antes de remover a capa do quarto desinfetado.
      Nota: Uma vez que os dispositivos foram fixados para o vidro, o protocolo pode ser pausado até que estejam prontos para uso.

4. Preparação e carregamento de larvas da canaleta

Nota: maneio geral zebrafish foi realizado por The Zebrafish Book, disponível online em http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embriões e zebrafish adulto foram mantidos conforme descrito anteriormente, ¹. Utilizou-se a estirpe selvagem tipo AB. Siga a instituição ’ s Animal conta protocolo para detalhes sobre os requisitos de imagem ao vivo larvas.

1. Enxaguar os canais com um mínimo de etanol a 70% 100 µ l por canal, usando uma micropipeta para lavar com a restrição do túnel. Remova o etanol e enxágue 2 ou 3 vezes com água bidestilada. Deixar secar ao ar.
2. Preencher os canais com leite desnatado (em uma concentração de 1% diluído em água) durante 10 minutos à temperatura ambiente para minimizar a aderência das larvas para a lamela de vidro do prato. Em seguida, delicadamente mergulhe o dispositivo várias vezes em água bidestilada para enxaguar. Deixe secar de cabeça para baixo.
   Nota: Protocolo pode ser uma pausa aqui. Esta preparação do dispositivo de zWEDGI pode ser feita vários dias antes de usar. Loja coberto à temperatura ambiente.
3. Preparar 1% baixo derretimento ponto de agarose (LMP), combinando-se 100 µ l 2% derretido LMP agarose com 100 µ l 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaina - etil 3-aminobenzoato) na E3 reserva ¹¹ pré aquecido para 38 ^ó C. manter a 1% solução de agarose/tricaina em 38 ^o C em um bloco quente para evitar a coagulação.
   Nota: Para microscopia do multiphoton ¹¹, usar ou variantes de zebrafish un-pigmentadas (como casper ¹²) ou manter as larvas na E3 contendo 0,2 mM N-phenylthiourea para evitar a formação de pigmento ¹¹ para minimizar a absorção de comprimentos de onda de infravermelhos próximos ultra-short.
   Cuidado: N-phenylthiourea é tóxico. Siga a instituição ' regras de s para a eliminação.
4. Anesthetize larvas na E3 de buffer contendo 0,2 mg/mL metanosulfonato (tricaina/E3) ¹¹. Espere até que as larvas são imóvel e não-responsivos a um estímulo de toque.
5. Pre-molhado os canais com alguns microlitros de tricaina/E3.
   1. Escolher acima uma única larva usando a ponta da pipeta um orifício largo. Deposite as larvas dentro do canal de carregamento ( Figura 3A). Usando a ponta da pipeta ou ferramenta similar, orientar a larva na câmara de carga, tal que o lado dorsal enfrenta a borda reta da câmara de carga e os rostos de cauda em direção o restrição túnel ( Figura 3B).
   2. Retire cuidadosamente o fluido da câmara ferindo, permitindo a larva a fluir para o túnel de restrição ( Figura 3). Remova a maior parte do líquido, mantendo a umidade em torno da larva ( Figura 3D). Este processo pode ser assistido pela inclinação do prato ligeiramente em direção a câmara ferindo.
6. Coloque LMP agarose a 1% em tricaina/E3 (~ 38 ^o C) sobre a larva ' cabeça, enchendo a câmara de carregamento ( Figura 3E). Permitir que a agarose solidificar com a larva na posição correta. Adicione tricaina/E3 à câmara ferindo conforme necessário para manter a hidratação. Repita este processo para os restantes 2 canais de carregamento.
7. Usando uma agulha de seringa, Retire cuidadosamente qualquer agarose que infiltrou através do túnel de restrição na câmara ferindo ( Figura 3F). Adicionar tricaina/E3 adicionais ou apenas sobre o agarose (para ferimento, imagem latente de curto prazo ou ferida tratamento isolamento) ou para encher o prato de cultura (para a imagem latente a longo prazo). Substitua a tampa do prato de cultura para evitar a evaporação. As larvas podem ser fotografadas neste momento (incólume) ou feridas.

5. Imagem e ferindo as larvas

1. usando uma lâmina de bisturi estéril, transecto barbatana posterior a notocorda ¹¹ na câmara ferindo ( Figura 3, G, H). Adicionar tricaina/E3 adicionais se necessário e feche a tampa do prato de cultura.
   Nota: Alternativamente, dependendo da janela de tempo do desenvolvimento do interesse, as larvas podem ser feridas, permitidas recuperar na E3 e mantidas na incubadora (28,5 ^ó C) até a imagem desejada, no ponto em que podem ser carregados em canais como descrito acima.
2. Instalar o dispositivo de zWEDGI com larvas anestesiadas em um microscópio invertido em uma inserção de estágio que irá acomodar o prato de fundo de vidro de 60mm. Localize a cauda da larva no canal mais alta, girando o prato como necessário para obter a cauda na posição desejada. Imagem conforme necessário para o experimento específico.
   Nota: O zWEDGI é amplamente aplicável para microscopia de luz de alta resolução, incluindo widefield fluorescência e microscopia eletrônica de varredura a laser. Há uma série de considerações de parâmetro quando zebrafish larvas de imagem, mas específicos de parâmetros de imagem são instrumento, amostra e dependente do experimento. Aqui, a cauda larval foi fotografada em uma compilação personalizada do multiphoton microscópio ^{5 , 11} utilizando os seguintes parâmetros: 40 X tempo trabalho distância água imersão objetivo, excitação de laser 890 nm, filtro de emissão 445/20 nm e resolução 512 x 512.

6. Final do experimento

1. remover o prato zWEDGI de microscópio. Eutanásia em larvas, colocando o zWEDGI em um banho de água gelada ou no 4 ^o C pelo menos 20 min e avaliar por ausência de batimentos cardíacos e a circulação.
   Nota: Porque as larvas são mantidas em compartimentos separados, as larvas podem ser individualmente recuperadas puxando suavemente no agar com fórceps ou pipeta. O ágar-ágar pode ser removido da região da cabeça e a larva usado para procedimentos adicionais, tais como a fixação para a mancha do anticorpo ou transformadas para extração de RNA ou proteína.
2. Após a remoção das larvas e agar, limpar o zWEDGI com etanol e água destilada, conforme descrito na etapa 4.1 e conjunto de cabeça para baixo para o ar seco. Loja coberto em um local fresco e seco. Re-casaco com leite desnatado (etapa 4.2) conforme necessário antes da próxima utilização.
   Nota: zWEDGIs pode ser reutilizado várias vezes, até o PDMS começa a ir muito longe do vidro.

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Resultados

O dispositivo de microfluidic zWEDGI PDMS é um dispositivo funcionalmente compartimentado projetado para acomodar quatro funções principais (listadas abaixo) associadas com imagens ao vivo da barbatana caudal, ferindo a cura e a rebrota nas larvas de peixe-zebra. PDMS foi escolhido para a fabricação de zWEDGI porque não só é prontamente disponível e um padrão da indústria para biocompatibilidade, mas também funciona bem em moldes. Além disso, PDMS torna o dispositivo reutiliz...

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Discussão

A finalidade do dispositivo zWEDGI é capturar o lapso de tempo 3D estabilizando e orientando os peixes dentro a pequena distância de trabalho de um objectivo de microscópio de alta resolução de imagem. Ao mesmo tempo atender a estas especificações de projeto, acabou também uma melhoria tradicional baseada em ágar preparação para geração de imagens ao vivo. Existem três passos críticos (abaixo) na fabricação do zWEDGI, que, se não for feito corretamente, pode resultar em dispositivos com defeito:

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane