Tratamento de Stent biodegradável magnésio de aneurisma sacular em um modelo do rato - introdução da técnica cirúrgica

Resumo

Reproduzido de modelos animais experimentais são necessários para o teste de materiais de embolização de romance, que foi criadas para tratar de oclusão endovascular de aneurisma intracraniana (IA). O presente estudo tem como objetivo desenvolver uma técnica cirúrgica segura e padronizada para stent assistida embolização de aneurisma sacular em um modelo animal de rato.

Resumo

O andamento constante no arsenal de técnicas disponíveis para tratamento endovascular de aneurisma intracraniano requer modelos animais experimentais acessíveis e reproduzidos para testar materiais de embolização romance como desviadores de stents e fluxo. O objetivo do presente projeto foi projetar um seguro, rápido, e técnica cirúrgica padronizada para stent assistida embolização de aneurisma sacular em um modelo animal de rato.

Aneurisma sacular foram criada a partir de um enxerto arterial da aorta descendente. Os aneurismas hipoglossal foram transplantados através de anastomose fim-a-lado para a aorta abdominal infra-renal de um syngenic machos Wistar rato pesagem > 500g. Após a anastomose de aneurisma, embolização de aneurisma foi realizada utilizando stents magnésio expansível por balão (2,5 x 6 mm). O sistema de stent foi retrógrado introduzido a partir da aorta abdominal inferior usando uma técnica de Seldinger modificada.

Após uma série de piloto de 6 animais, um total de 67 ratos foram operados de acordo com o estabelecido procedimentos habituais de funcionamento. Quer dizer, tempo de cirurgia, anastomose mau tempo e mau tempo do local da punção de artéria de sutura foram 167 ± 22 min, 26 ± 6 min e 11 ± 5 min, respectivamente. A taxa de mortalidade foi de 6% (n = 4). A taxa de morbidade foi de 7,5% (n = 5), e trombose de stent foi encontrada em 4 casos (n = 2 cedo, n = 2 final de trombose de stent).

Os resultados demonstram a viabilidade de oclusão de stent padronizada de aneurisma sacular lateral em ratos - com baixos índices de morbidade e mortalidade. Este procedimento de embolização do stent combina a oportunidade de estudar conceitos inovadores de stent ou desviador de fluxo com base em dispositivos, bem como os aspectos moleculares da cura.

Introdução

Hemorragia subaracnoidea devido a uma ruptura de aneurisma intracraniano está associada com uma alta taxa de mortalidade e pobre resultado neurológico em muitos sobreviventes. Atualmente existem duas abordagens gerais para ocluir IA: qualquer recorte microcirúrgica (que exige exposição operativa do aneurisma), ou oclusão endovascular. Como o tratamento de bobina menos invasivo endovascular do estreito gargalo i foi mostrado para ser associada com morbidade ligeiramente inferior (especialmente na circulação posterior^1,2), opções de tratamento endovascular tornaram-se o modalidade preferida de muitos centros de neurocirurgia. Inúmeros dispositivos foram desenvolvidos a fim de estender as indicações de tratamento endovascular e superar a limitação principal de recorrência IA depois de bobinamento. Stents intracranianas são especialmente promissoras para superar essas limitações, como eles servem como um andaime para neo-endothelization e bobina de prevenção da hérnia, bem como proteger a artéria pai e melhorar intraluminal intraaneurysmal trombose causada por redução do afluxo de sangue. Há uma necessidade de estudar novos stents intracraniana em um modelo animal de baixo custo; a nível macroscópico e molecular.

O objetivo deste estudo foi criar um seguro, rápido e padronizada a técnica cirúrgica para a aplicação do stent em um modelo de aneurisma sacular já estabelecido em ratos^3,4,5. No presente projeto, avaliamos o papel de um stent biodegradável de magnésio.

Protocolo

Wistar macho ratos com um peso médio de 592 g (± 50 SD) e a média de idade de 20 semanas foram alojados em instalações animais em uma temperatura de 22-24 ° C e o ciclo claro/escuro de 12 horas, com livre acesso à água da torneira e uma dieta de pelota. Os animais receberam atendimento dos humanos em conformidade com as normas institucionais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Animal conta no Cantão de Berna, Suíça (ser 102/13). Seguimos rigorosamente as recomendações para a pesquisa Animal: relato de experimentos In Vivo (diretrizes de chegada).

1. o laboratório equipamento, suprimentos consumíveis, instrumentos cirúrgicos

1. Usar uma sala de cirurgia tranquila, asséptica e manter a temperatura de 23 ± 3 ° C.
2. Use uma mesa cirúrgica com uma superfície que é fácil de limpar e desinfectar e cubra com um pano de cirurgia. Use um microscópio cirúrgico da mesa com uma câmera para gravar a cirurgia e uma luz infravermelha para aquecer o animal antes e após a cirurgia.
3. Obter o seguinte material consumível para criar o aneurisma da parede lateral e implante de stent.
   1. Obter maiores e menores estéril celulose e gaze Cotonetes, seringas com agulhas ocas 18G e 26G e uma agulha com ponta para substituição de irrigação/volume.
   2. Obter materiais de sutura, incluindo 10-0 não absorvíveis e 9-0 micro sutura não absorvível de 6-0 e 5-0 sutura e sutura absorvível 3-0.
   3. Obter a solução isotônica de cloreto de sódio de 0,9% para a substituição de irrigação/volume e para assegurar a limpeza dos instrumentos durante a cirurgia
4. Obter os seguintes instrumentos para implante de stent: punção da agulha 19g, fio guia hidrofóbico, 4 Fogaty bainha e uma seringa de compressor de ar para a dilatação do balão.
5. Obter o seguinte material consumível para decellularization de parede do aneurisma:
   1. Obter microtubos para armazenamento de aneurisma-24 ° c e rótulos para identificação, bem como um agitador de laboratório para assegurar o tratamento completo químico do aneurisma.
   2. Obter 0,1% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e solução salina tamponada fosfato (PBS) para o processo de decellularization adequada.
6. Obter os instrumentos de cirurgia padrão a seguir:
   1. Obter mais grosseiros instrumentos cirúrgicos: tesoura cirúrgica, pinça de tecidos moles, propagador de tecidos moles, fórceps de reto e curvado, três pinças Mosquito, porta-agulha.
   2. Obter instrumentos cirúrgicos micro: microtesouras retas e curvas, reto e curvado microfórceps e quatro clipes de mini vasculares temporárias com aplicadores de clip vascular correspondente.

2. anestesia

1. Coloque o rato em uma câmara de gás e anestesia com uma mistura de isoflurano e oxigênio (4% de isoflurano). Manter a inalação até o animal perde a consciência.
2. Remover o animal anestesiado da câmara de gás e injetar a anestesia de definitiva constituído de uma mistura de peso-adaptado de cloridrato de medetomidina (0,5 mg/kg) e cloridrato de cetamina (50mg/kg) intraperitonealmente (injetando em direito ou abdômen inferior esquerdo).
3. Monitore a profundidade da anestesia em intervalos definidos durante a cirurgia com uma dedo do pé-pitada nociva para confirmar que o rato está totalmente anestesiados e não responde. Se houver um dedo do pé-pitada de readminster reflexo, a anestesia com uma injeção intraperitoneal peso-adaptado de cetamina e medetomidina. Anestesia suficiente é necessário antes de abrir a cavidade abdominal e realizar a anastomose fim-a-lado e inserção de stent.
4. Coloque o rato sob a lâmpada de aquecimento infravermelha até a anestesia intraperitoneal entrará em vigor, como o aquecimento pré-operatório efetivamente evita resfriamento extensa durante a cirurgia.

3. cirúrgica preparação e posicionamento do rato

1. Pesar o rato, extrair a língua para proteger as vias aéreas superiores e aplicar a pomada para evitar a dessecação da córnea.
2. Use fita adesiva para fixar o rato para uma pequena placa lavável e evitar qualquer pressão ou tração para as patas.
3. O rato na área operacional a barba com um barbeador de animais pequeno e desinfectar região cirúrgica.
4. Coloque dois marcadores grossos 2-3 centímetros distante sob as costas do animal para causar tanto lordose lombar e toraco-lombar quanto possível. Isso garante a melhor exposição do retroperitônio e mais fácil aplicação do stent.
5. Cobrir o rato com uma cortina de abertura estéril e colocá-la sob o microscópio de operação. Configure dois suportes ao lado do animal para facilitar uma posição mais confortável para as mãos do experimentador.
6. Lavar e desinfectar as mãos e Calce luvas estéreis. É útil ter um assistente presente especialmente para a implantação de stent.
7. Realizar a cirurgia em condições assépticas, de acordo com as recomendações para os animais de laboratório,^6,7.

4. aneurisma da colheita de enxerto

1. Sob anestesia geral, abra o abdômen abaixo do processo xifoide. Primeiro, cortar a pele na linha de midventral com uma tesoura afiada e separar a pele da musculatura. Em seguida, cortar a musculatura abdominal e identificar o diafragma acima do fígado no ponto de inserção da cavidade torácica.
2. Cortar o diafragma e o tecido conjuntivo com uma tesoura afiada para acessar a cavidade torácica e cortar as costelas com grandes tesouras e meio centímetro para a direita e a esquerda do esterno.
3. Quando a caixa torácica está aberta, sacrifique o rato com uma overdose intracardíaca de cloridrato de cetamina (120 mg/kg).
4. Mobilizar o pulmão esquerdo e corrigi-lo para o lado direito com a ajuda de um cotonete de celulose.
5. Após a exposição adequada do arco da aorta, prenda o ázigos e as veias cava cranianas esquerdas com duas pinças mosquito acima da aorta e cortar no meio. Deixe os grampos sobre as terminações de vasos cortados para evitar sangramento venoso retrógrado. Use os grampos para mover o coração e as veias para o lado, permitindo melhor acesso ao arco aórtico e aorta de decrescente.
6. Disse a aorta usando uma técnica microcirúrgica com micro tesouras e microfórceps.
7. Trace a aorta para cima da seção decrescente para o arco aórtico e identificar a artéria subclávia esquerda e a artéria intercostal primeira, deixando a aorta.
8. Coloque um não-absorvíveis 6-0 sutura apenas craniana da primeira Artéria intercostal e amarrá-la. Na extremidade proximal, corte a aorta logo após a origem da artéria subclávia esquerda. É importante usar uma única perpendicular corte como ele reduz a chance de irregularidades na vanguarda da prótese vascular. Finalmente, remova o recém-criado aneurisma com um corte logo abaixo a ligadura.
9. Após a medição o aneurisma, transplante imediatamente o enxerto em rato o destinatário.

5. aplicativo de criação e stent aneurisma

1. Abordagem cirúrgica
   1. Iniciar a incisão cutânea no terço distal do abdômen com tesoura afiada e corte em um midventral posição distal do processo xifoide até 1 cm. Separe com cuidado da pele e tecido subcutâneo da musculatura. Use a mesma tesoura para abrir os músculos abdominais ao longo da linea alba. Use fórceps para aumentar os músculos durante o corte para evitar danificar os órgãos intra-abdominais.
   2. Após a laparotomia, mova o intestino, o ceco e cólon para a direita. Use um afastador auto exploração mantém a cavidade abdominal aberta e corrigir os órgãos. Coloque um cotonete por baixo do fígado para removê-lo da área cirúrgica e aumentar a exposição retroperitoneal.
      Nota: Se a massa gorda está a obstruir a vista, pode ser colocado fora da cavidade abdominal e coberto com gaze molhada para evitar a depleção de fluidos extensa.
   3. Esvazie a bexiga urinária para alcançar a máxima exposição da aorta abdominal infra-renal. Isto pode ser realizada também através de suaves pressões a parede da bexiga, ou vesical descarga usando uma agulha oca de 26G.
   4. Protege a bexiga e testículos de desidratação e extensiva manipulação durante a cirurgia, cobrindo-os com um cotonete molhado celulose estéril.
   5. Abra o peritônio parietal, cobrindo a aorta com duas pinças sem corte. Tenha cuidado com os ureteres quase transparentes, vasos testiculares e a artéria mesentérica superior. Tão logo o peritônio parietal é aberto, a aorta abdominal será localizada apenas debaixo dela. Muitas vezes está coberto por uma fina camada de tecido adiposo.
   6. Comece com uma dissecação da aorta abdominal usando dois micropinça para liberá-lo da gordura retroperitoneal circundante até um comprimento do navio é visível. Continue com a dissecação afiada usando micro tesouras e microfórceps. Apenas segure adventitia durante este procedimento para evitar danos à parede do vaso.
2. Dissecação da aorta abdominal
   Nota: Para facilitar a descrição da estratégia cirúrgica dividimos a aorta abdominal em três segmentos distintos (Figura 1).
   1. Inicie a dissecação no segmento distal - o que é tecnicamente mais desafiador.
      Nota: O segmento distal é subdividido entre a bifurcação ilíaca e iliolombar veia e artéria. Este segmento serve como o ponto para a inserção de punção e stent de aorta abdominal distal.
      1. Disse a aorta com micro tesouras e micropinça da V. cava por corte ao lado da camada adventícia arterial entre os dois navios.
         Nota: Pequenas artérias lombares podem surgir infrequentemente como vasos segmentares da superfície dorsal da aorta abdominal e interferir com o procedimento. Coagulação e corte dos vasos é necessária para evitar exsudação retrógrado durante a sutura do vaso.
      2. Identificar a artéria iliolombar certo; sua origem pode variar significativamente neste segmento, mas mais frequentemente está localizada mais caudal do que a contrapartida à esquerda.
         Nota: Esta condição raramente interfere com o local de punção de inserção planejada stent na artéria, mas pode exigir um ponto de punção mais longe removido ou - para a mais extrema variabilidade anatômica - uma ligadura de vasos da Artéria iliolombar certo.
      3. Depois de preparar a aorta neste segmento, coloque uma almofada de borracha coloridas por baixo o recipiente para indicar onde será realizada a punção arterial. Evite esticar o navio neste segmento. Estiramento elástico na parede do vaso pode levar à ruptura do vaso descontrolada após punção arterial, que por sua vez, impedirá a reconstrução final. Portanto, é importante liberar de todas as adesões no local de punção da artéria aorta e evitar qualquer colocação de compressas de gaze por baixo da aorta.
   2. Disse a aorta da V. cava no segmento médio da mesma forma como descrito antes.
      Nota: O segmento médio subdivide-se entre a veia iliolombar e a artéria e a veia renal. Este segmento é usado para a implantação de aneurisma e posicionamento do stent.
      1. Identificar a artéria mesentérica superior na sua origem a partir da aorta abdominal e preservá-lo durante todos os procedimentos.
      2. Ligate ou coagular artérias da superfície dorsal da aorta nesta seção também. Para evitar danos ao plexo lombossacral, certifique-se de rubor suficiente e ser consciente do tempo curto da coagulação.
      3. Estabelece a localização do stent após dissecção da aorta neste segmento. Antecipe possíveis interferências do stent com vasos abdominais antes de definir o local final para o aneurisma e o stent.
      4. Depois de estabelecer a localização do aneurisma e stent, coloque um pequeno pedaço de gaze e uma almofada de borracha coloridas sob a aorta para melhor exposição.
   3. Finalmente, disse o segmento proximal da aorta abdominal. Isto é tecnicamente mais simples do que o mesmo procedimento nos segmentos de média e distais.
      Nota: O segmento proximal encontra-se proximal para a veia renal. É usado para a aplicação do clipe temporário mais proximal durante a implantação de stent de técnica de Seldinger.
      1. Depois de abrir o peritônio parietal, separe os vasos com duas pinças sem corte.
      2. Após Circunavegação dorsal da aorta com pinça curva, sem corte, coloque um pequeno pedaço de uma almofada de borracha coloridas por baixo para facilitar a aplicação mais tarde proximal clip.
3. Criação de aneurisma
   1. Braçadeira da aorta no segmento médio, aplicando a pinça distal, seguida de proximal para garantir um enchimento firme da embarcação e facilita a arteriotomia subsequente.
   2. Remova a adventícia no local da anastomose planejada. Segure a adventícia com microfórceps e cuidadosamente cortado com tesouras micro sem ferir a parede do vaso.
   3. Levantar um pequeno pedaço de parede vaso com microfórceps e realizar uma incisão linear com microtesoura. A arteriotomia deve ser do mesmo tamanho que a base do aneurisma.
   4. Irrigue a artéria em ambas as direções com solução salina em uma agulha com ponta romba.
   5. Coloque os dois primeiros pontos de anastomose fim-a-lado, que é realizada com sutura não absorvível de 9-0, na extremidade proximal e distal da arteriotomia. Segure a mínimo possível durante a sutura da parede do vaso e certifique-se de que as suturas passam cada camada da parede do vaso. Eles só devem capturar a parte ventral da aorta para evitar constrição da artéria; que poderia levar à ruptura do vaso durante a aplicação do stent.
   6. Feche a incisão com sutura interrompida. Começar a sutura do lado esquerdo e terminar isso antes de continuar para o outro lado. Quando a parede estiver concluída, verifique a seção de endoluminal da anastomose para suturas erradamente colocadas.
      Nota: neste ponto, terapêutica intra-aneurismática diferente tais como aplicação de bobina pode ser introduzida.
   7. Depois de terminar a anastomose, remova a braçadeira distal primeiro. Coloque uma sutura extra em caso de sangramento importante de refluxo. Gerencie menor exsudação pressionando levemente um pequeno pedaço de gaze para a fonte do sangramento. Tecido adiposo ou uma camada adventícia anteriormente obtida pode ser útil também. Agora retire a pinça proximal.
   8. Lave o local da anastomose e cortar as pontas restantes de ligadura no dome aneurisma.
   9. Observe a patência da aorta abdominal distal, com o teste de ordenhando direto.
   10. Retire o cotonete de gaze pequeno sob a almofada de borracha coloridas, como todos os segmentos da aorta devem ser aproximadamente na mesma altura antes da inserção do stent. Evite cobrindo as linhas de sutura da anastomose com o tecido adiposo como os suportes do stent devem ser visíveis ao posicionamento do stent sob o aneurisma recém-criado.
   11. Para evitar danos causados por isquemia prolongada, permitem 10 minutos de reperfusão antes de continuar com o aperto da aorta proximal e a inserção do stent.
   12. Esvazie a bexiga antes da implantação do stent.
4. Implante de stent
   Nota: É útil ter um assistente na mão para as etapas seguintes, especialmente para a inflação de stent final.
   1. O local de punção da artéria no segmento distal clip primeiro. Começar com a pinça distal e siga com o proximal. Remova o tecido conjuntivo frouxo e (parcialmente) adventitia no local da punção com microtesoura.
   2. Coloque uma pinça grande temporária no segmento proximal para evitar grandes hemorragias durante a punção arterial.
   3. Realizar a punção arterial no segmento distal com uma agulha de punção 18G. Levante um pequeno pedaço da parede do vaso com micropinça para facilitar a punção e reduzir o risco de perfuração ambas as paredes dos vasos da aorta.
   4. Irrigue a artéria completamente após a punção com solução salina em ambas as direções usando uma agulha com ponta romba.
   5. Insira um fio-guia hidrofóbico no local da punção e remova a braçadeira proximal no segmento distal.
   6. Empurre o fio-guia para a frente até ao nível da mordaça no segmento proximal. Inserir a sonda de Teflon de acordo com a técnica de Seldinger, usando o fio-guia previamente inserido.
      Nota: Fios guia hidrofóbico são mais adequados do que os hidrofílicos como eles têm uma aderência superior e proporcionam melhor controle manual. Como introdutores de Teflon são mais fáceis de inserir do que apresentadores de polipropileno, eles reduzem o risco de ruptura descontrolada no local da punção.
   7. Empurre o dilatador para cima imediatamente proximal ao local da anastomose, a bainha está localizada a cerca de meio centímetro abaixo.
   8. Retire o fio-guia e o dilatador e garantir que a torneira de 3 vias é desligada para evitar perdas desnecessárias de sangue.
   9. Após aspirar o sistema balão, inserir o stent de magnésio absorvível usando o introdutor de Fogarty 4. Insuflar o balão com uma barra de pressão antes de remover o dispositivo introdutor para proteger o endotélio do vaso recolhido de dano induzido por cilha e reduzir o risco de tropeços no intraaneurysmal previamente implantada a strut material (Figura 2).
   10. Quando o stent é na posição final, cuidadosamente insufle o balão com 8-9 bar. Verifica continuamente as suturas de anastomose fim-a-lado para ripar possível.
   11. Após stent adequada dilatação e adesão à parede do vaso da aorta, esvazie e retire o balão.
   12. Ao retirar o introdutor, tem um clipe temporário à mão para aplicação imediata proximal ao local da punção como retrógrada escorrendo de artérias proximais de patentes pode ser significativo.
   13. Remova a braçadeira temporária no segmento proximal depois de colocar o clipe proximal no segmento distal. Observe a anastomose fim-a-lado, como qualquer aumento da pressão intra-aórtico devido recorte distal pode causar sangramento no local da sutura.
   14. Limpe o local da punção com solução salina de uma agulha com ponta em ambas as direções. Depois é suture com uma técnica interrompida usando thread não absorvíveis 10-0. Se possível, evite agarrar a parede do vaso com o microfórceps e certifique-se de que cada sutura passa por todas as camadas da parede do vaso. Sutura no navio extrema punção local para evitar a estenose do vaso.
   15. Adicione extras suturas se grande hemorragia ocorre como resultado de refluxo. Em caso de menor exsudação, secure hemostasia através de suaves pressões ao sangramento local usando um cotonete da gaze ou um segmento previamente preservado da adventícia. Pequenos pedaços de tecido adiposo podem ser útil também.
   16. Remova a almofada de borracha coloridas por baixo do local da punção. A pulsação da aorta será claramente visível proximal e distal ao site da anastomose. Seleção para desobstrução de artéria distal com o teste de ordenha direto.

6. encerramento

1. Remover todas as compressas de gaze e lave suavemente na cavidade abdominal com soro fisiológico, isótono para retirar resíduos e promover a substituição de volume.
2. Remova o espaçador de tecidos moles e o intestino delgado, ceco e massa gorda voltar à sua posição anatômica correta.
3. Use a sutura não absorvível de 5-0 para unir os músculos abdominais. Para reduzir a tração da pele, coloque algumas suturas subcutâneas usando uma sutura absorvível 3-0. Use a mesma sutura 3-0 para fechar a pele.
4. Após o encerramento, desinfectar a pele e colocar o animal sob a luz infravermelha para fornecê-lo com calor.

Resultados

A duração média da cirurgia foi 167 min (± 22), 26 min (± 6) de que eram necessários para criação de aneurisma e um mais 23 (± 7) min necessário para a aplicação do stent e reconstrução da arteriotomia (Figura 3).

Macroscópicas em-stent trombose, morbidade e mortalidade foram os pontos de extremidade principais do estudo. Os períodos regulares de acompanhamento foram 7 dias (n = 28) ...

Discussão

Modelos de stents e animal bioabsorvível
Nos últimos anos, a tendência geral em medicina esteve longe implantes permanentes (que permanecem no corpo do paciente para o resto da sua vida) para materiais bio-absorvíveis. Stents de magnésio, em particular, são já bastante estabelecidos em Cardiologia^8,9. Infelizmente esses stents ainda não foram testados para outras aplicações, tais como doenças cerebrovasculares. Por esta razão, deci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine			any generic
Ketamin			any generic
Buprenorphine			any generic
Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
10-0 non-absorbable suture	Covidien, USA	N2530 Monosof
Operation microscope	Zeiss, Germany
Digital microscope camera	Sony, Japan	HXR-MC1P
Standard surgical instruments		multiple	see protocol 7.a
Microsurgical instruments		multiple	see protocol 7.b
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Temporary vascular clamps	B. Braun, Germany
19G Puncture needle	Angiomed GmbH, Germany	15820010
Hydrophobic guide wire	Cook Medical, USA	G00650
4F sheat	Cordis Corporation, USA	504-604A
Inflation syringe
Laboratory shaker	Stuart	SRT6
Magnesium Stent 2.5/6 AMS with Polymer coating	Biotronik, Switzerland
Surgery drape
Sterile cellulose swabs
Syringes 1 ml and 2 ml
Hollow needles 18G and 26G
Isotonic sodium chloride
Microtubes
Eye ointment	Bausch + Lomb Inc, USA	Lacrinorm	any generic
Small animal shaver