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Resumo

O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Resumo

O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.

Introdução

Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular interesse é identificar quais fatores e processos atuam sobre genomas virais durante todo o ciclo infeccioso.

Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é que uma dupla encalhado DNA vírus que infecta uma parte substancial da população humana. Dentro da primeira hora de infecção, o genoma viral entra no núcleo, onde uma cascata ordenada da expressão dos genes virais resulta em coordenação com viral de replicação de DNA (vDNA)1. No núcleo, genomas estão sujeitos a regulamento epigenético, passam por reparo e recombinação, em são empacotados em capsids, tal que o primeiros virions descendentes são produzidos dentro de menos de seis horas. A avaliação abrangente das proteínas do genoma viral associada ao longo do curso da infecção vai estabelecer as bases para investigar os detalhes moleculares de processos que agem sobre genomas virais e irão fornecer insights sobre quais fatores virais e celulares estão envolvidas em vários estágios de infecção.

Métodos anteriores para a investigação de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral incluem purificação da afinidade das proteínas virais para a análise de proteínas celulares associados2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estes ensaios têm sido fundamentais para a identificação de fatores celulares envolvidos em respostas antiviral de acolhimento, bem como a modificação de cromatina viral, expressão gênica, e reparo do DNA. No entanto, é difícil verificar se interações dependem da associação com vDNA e proteomics apenas fornecer insights sobre as interações que ocorrem em função de um fator viral específico. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tem sido utilizada para identificar onde as proteínas virais e celulares específicas bind para genomas virais10,11,12,13,14 , 15 e hibridização fluorescente in situ (FISH) combinado com imunocitoquímica permitiu a visualização de fatores celulares que colocalize com vDNA16,17,18, 19 , 20. estes ensaios permitem análise espacial e temporal. No entanto, as limitações incluem a necessidade de anticorpos altamente específicos, sensibilidade limitada e a necessidade de anterior insight interações hospedeiro de vírus. Portanto, desenvolvemos um método baseado na iPOND (isolamento de proteínas DNA nascente)21 e aniPOND (iPOND nativo acelerada)22 para seletivamente rotular e purificar vDNA de infectados células para a imparcial identificação do genoma viral proteínas associadas por espectrometria de massa. iPOND tem sido fundamental para a investigação da dinâmica do garfo de replicação celular.

Para a purificação seletiva de genomas virais de células infectadas, replicar vDNA é rotulado com nucleosídeos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) ou 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguido por ligações covalentes conjugação de azida de biotina, através do clique em química para facilitar a purificação de única etapa de genomas virais e proteínas associadas em grânulos streptavidin-revestido (Figura 2B). Importante, infecções são realizadas em células estacionárias, que não estão envolvidas na replicação do DNA celular para permitir a rotulagem específica de vDNA. Além disso, a infecção HSV-1 faz com que a detenção do ciclo celular e inibe de23,de replicação de DNA celular24. Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com entrada genomas virais (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B) 25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. Além disso, ethynyl-modificado vDNA pode ser covalentemente conjugado com um fluoróforo para investigação espacial da dinâmica da proteína (Figura 2A e Figura 3). Imagem permite a visualização directa de vDNA é uma abordagem complementar para a validação das interações da proteína-vDNA e pode ser adaptada para controlar genomas virais durante a infecção. Nós antecipamos que essas abordagens podem ser mais modificadas para estudar qualquer aspecto da infecção herpética, incluindo latência e reativação e estudar outros vírus de DNA. Além disso, etiquetando com uridina 5-ethynyl (UE) pode permitir para a análise do genoma viral de RNA.

Protocolo

1. cultura celular, infecção Viral e rotulação de EdC ( Figura 1)

o seguinte protocolo envolve trabalhar com vírus. Por favor, consulte sua instituição ' protocolos de biossegurança s sobre manipulação segura de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh.

  1. Trypsinize um frasco de cultura de tecidos confluente 150 cm 2 de MRC-5 células e as células de transferência para uma placa de cultura de tecido de 2 600 cm contendo 100 mL DMEM acrescido de 10% FBS. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2 para 3-4 dias para chegar a fase estacionária e Confluencia. Um prato de 2 cm de 600 confluente contém ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condição e 1 chapa para cada controle negativo correspondente.
    Nota: Células devem alcançar a fase estacionária para inibir a replicação do DNA celular para garantir que apenas vDNA é rotulado e purificada em etapas subsequentes.
    Nota: Cada amostra requer uma cortesia unlabeled controlo negativo preparado usando as mesmas condições de infecção e ponto de tempo sem a adição de EdC.
    Nota: A escala versão desta experiência deve ser efectuada em tandem para testar para a rotulagem do DNA celular por imagem utilizando o crescimento de células comparáveis, infecção, EdC rotulando as condições e pontos (consulte a etapa 2).
  2. Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 em 7 mL salina de carbono frio (TBS). Remover o meio de crescimento e armazenar a 37 ° C. Para infectar, adicione o 7 mL vírus diluído para MRC-5 células e rock por 1h à temperatura ambiente. Após a adsorção, remover o inóculo, enxaguar com 50 mL temperatura TBS e substituir o original meio de crescimento. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2. Esta etapa deve ser efectuada para cada condição experimental e controlo negativo.
    Nota: Rotulagem de EdC aumento pode ser conseguido usando mutantes de HSV-1 defeituosos para a expressão do dUTPase viral (gene UL50) e/ou glycosylase uracil (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tem baixa especificidade e pode diminuir a ativação de diversos nucleosídeos análogos 25 , 27.
  3. Genomas virais de rótulo com EdC. Siga as instruções para rotular os genomas de entrada (1.3.1.), replicação de genomas (1.3.2.), ou forquilhas de replicação viral (1.3.3)..
    Nota: Só passo 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 deve ser realizado dependendo se entrada genomas, genomas replicadas ou forquilhas de replicação devem ser analisados em etapas subsequentes, respectivamente.
    Nota: EdU ou f-ara EdU pode ser substituído por EdC. A toxicidade de análogos de nucleosídeos deve ser monitorizada e minimizada.
    1. Uso prelabeled ações para realizar a infecção na etapa 1.2 e vá para a etapa 2 ou 3 dentro de 4h pós infecção (hpi) para investigar replicada vDNA ( figura 1A).
      Nota: Prepare o vírus prelabeled ações usando o protocolo descrito anteriormente, 25. Reservas de vírus devem ser passadas através de uma coluna de G-25 para remover qualquer residual EdC.
    2. Etiqueta vDNA replicação pela adição de 5-25 µM EdC para o meio de cultura celular de células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de adicionar, diluir EdC em 1 mL de meio de crescimento.
    3. Para rotular as forquilhas de replicação viral, após o início da replicação vDNA (≥ 4 hpi), etiqueta de pulso replicando vDNA com 5-25 µM EdC para 5 a 20 min. Para perseguir, lavar 3x com meio de perseguição contendo 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e então incubar na presença de meio de perseguição por um adicional 20-40 min ( Figura 1).
      Nota: Pulso e chase médio deve ser incubado a 37 ° C e 5% CO 2 antes do uso.
      Nota: Para experiências de perseguição do pulso, é importante considerar a quantidade de tempo que leva para nucleosídeos entrar na célula e ser phosphorylated antes que eles podem ser incorporados em replicação de DNA. Isso deve ser determinado empiricamente.
      Nota: Para determinar a resolução de experimentos de perseguição de pulso, calcule a taxa de replicação viral nas condições experimentais utilizadas. Isto pode ser determinado por PCR quantitativo de genomas virais durante uma única etapa crescimento tempo curso 26.
      Nota: Para imagens de genomas virais prosseguir para a etapa 2 e para a purificação de genomas virais prossiga para o passo 3.

2. Imagem de EdC rotulado de DNA ( Figura 2A)

Nota: é útil realizar imagens em conjunto com o método de purificação do genoma viral para verificar que o DNA celular não é rotulado em experimentos. Imagem também pode ser usada para visualizar a natureza de vDNA etiquetado e validar dados de proteômica. Exemplos de DNA viral e celular, os padrões de coloração são mostrados na Figura 3.

  1. Realizar infecções e EdC rotulando como indicado na etapa 1, exceto usando reduzidas condições em lamelas em um prato de cultura de tecidos de 12 poços contendo 1 mL de meio de cultura.
  2. Correção de células com 1 mL 3,7% paraformaldeído em 1X PBS por 15 min no RT Após a fixação, enxaguar células 2x com 1ml 3% BSA em PBS.
    Cuidado: Paraformaldehyde pode causar lesões graves ou permanentes. Siga as precauções de segurança.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e lamelas podem ser armazenadas a 4 ° C, na segunda lavagem por até 3 dias.
  3. Permeabilize células com 1 mL de tampão de permeabilização [ver Tabela de materiais] por 20 min à temperatura ambiente enquanto balançando.
  4. Enxaguar com 1 mL de BSA 3% e, em seguida, bloco com BSA de 3% 1 mL de PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando.
  5. Adicione 1 mL da reação clique cocktail [ver Tabela de materiais] para lamelas covalentemente conjugar Alexa Fluor 488 azida de EdC rotulado de DNA. Incube a temperatura ambiente por 30 min, enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.
  6. Mancha DNA celular com 1 mL de uma diluição de 1:2,000 de Hoechst em PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.
  7. Mancha com anticorpos primários e secundários, de acordo com o padrão de imunofluorescência indirecta protocolos 25.
    Nota: VDNA rotulado colocalizes com ICP8, ICP4 ou UL42 e rotulado celular DNA colocalizes com mancha de Hoechst.
  8. Montar lamelas em slides e imagem células usando um microscópio de fluorescência.
    Nota: Slides podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.

3. Purificação de proteínas associadas e vDNA

Nota: vários aspectos deste protocolo foram adaptados de Leung et al. 22
Nota: todos os buffers e reagentes devem ser refrigerados no gelo antes da utilização e todas as etapas devem ser realizadas no gelo salvo indicação em contrário.

  1. Colheita núcleos.
    Nota: Antes de isolamento dos núcleos, formaldeído pode ser usado para a ligação cruzada proteínas para o DNA. Condições mais rigorosas de lavagem podem ser usadas durante a purificação de DNA em grânulos streptavidin-revestido. Para crcondições osslinking e lavagem ver Sirbu et al 21.
    1. substituir o meio de cultura com 20 mL de solução tampão de núcleos (NEB) e incube por 20 min a 4 ° C, com ocasionais de balanço. Núcleos se tornará visíveis no microscópio.
    2. Raspar núcleos da placa usando um raspador de célula e transfira para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C para núcleos de Pelotas, descartar o sobrenadante.
      Nota: Trypan coloração azul pode ser usado para verificar o isolamento dos núcleos de células.
    3. Suavemente desalojar a pelota nuclear em 10 mL de PBS, transferir para um tubo cônico de 15 mL, pelota e por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS.
      Nota: Núcleos podem ser congelados e o protocolo pode ser interrompido neste ponto. Para fazer isso, delicadamente Ressuspender o nuclear em 500 µ l de congelamento do buffer e incubar o tubo em um banho de gelo seco-etanol. Armazenar os núcleos congelados a-80 ° C. Antes da utilização, descongelar núcleos à temperatura ambiente, transferir rapidamente de gelo, adicionar 10 mL de PBS, pedra delicadamente para misturar, pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C e remover completamente a PBS. Núcleos de congelamento pode resultar em rendimento reduzido.
  2. Covalentemente conjugado biotina-azida de EdC rotulado vDNA.
    1. Ressuspender o pellet nuclear na reação de 10ml clique misturar [ver Tabela de materiais] suavemente pipetando acima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 mL.
      Nota: É importante que os reagentes incluídos no mix clique reação são adicionados na ordem indicada.
    2. Rode durante 1h a 4 ° C. Enquanto roda preparar e relaxar Buffers B1, B2 e B3 [ver Tabela de materiais].
    3. Núcleos de pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover clique em mistura de reação e lavar o sedimento por suavemente resuspending em 10 mL de PBS e centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C.
    4. Suavemente resuspenda o pellet nuclear em 1 mL de PBS e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando a ponta da pipeta um grande furo. Núcleos de pelotas por centrifugação durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS e congelamento flash em azoto líquido.
      Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e núcleos congelados podem ser armazenados no-80 ° C. Freeze degelo ajuda com Lise subsequente, por isso é recomendado que os núcleos ser flash congelado mesmo quando avançar para o passo 3.3 no mesmo dia.
  3. Lyse núcleos e fragmento de DNA.
    1. Descongelar núcleos no gelo e ressuspender em 500 µ l de Buffer B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar no gelo por 45 min.
    2. Sonicate amostras 6 vezes por 30 s cada em amplitude de 40%, usando uma sonda de microtip de 3 mm. Colocar as amostras no gelo por 30 s entre pulsos. Depois sonication, amostras devem aparecer, claro, não nublado.
      Nota: Condições Sonication devem ser otimizadas para sonicators individuais. Para obter instruções detalhadas sobre como otimizar condições sonication referir Leung et al. 22.
    3. os restos da célula de pelotas por centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O tamanho da pelota deve diminuir substancialmente. Filtrar o sobrenadante através de filtro de célula 100 µM e manter o fluxo através de.
    4. Adicionar 500 µ l tampão B2 a filtrada sobrenadante. 900 µ l desta amostra será usado na etapa 3.4.2.
    5. Tomar uma alíquota de cada condição para isolamento de DNA (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x solução de SDS-bicarbonato [ver Tabela de materiais]. Prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).
    6. Tomar uma alíquota de cada condição para a entrada da proteína (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x amortecedor da amostra Laemmli, congelamento em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C. utilizar na etapa 3.5.6.
  4. Bind biotinilado DNA para streptavidin revestido grânulos.
    1. Preparar Streptavidin T1 grânulos magnéticos Transferindo 300 µ l de chorume grânulo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare um tubo de grânulos por amostra. Lavagem de contas 3 x 1 ml de tampão B2 num Vortex para Ressuspender, aplicando um ímã para separar as contas, e aspirando o tampão de lavagem.
      Nota: Otimizado resultado de condições no rendimento maximizado e vinculação de fundo mínimo de vinculação. Determinou-se experimentalmente que grânulos magnéticos Streptavidin T1 têm uma capacidade de ligação significativamente maior do que grânulos de agarose, bem como outros grânulos de estreptavidina e menos fundo vinculação do Streptavidin C1 grânulos ( Figura 4A ).
    2. Adicionar 900 µ l da amostra da etapa 3.3.4. aos talões lavados e rodar durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Fazer grânulos de vórtice não, uma vez que a amostra é adicionada a eles.
      Nota: Se uma quantidade significativa de DNA ou proteína está isolada no controle negativo sem rótulo, esta etapa pode ser reduzida de durante a noite a 4 h para reduzir a ligação fundo.
  5. Lave grânulos e eluir vDNA e proteínas associadas.
    Nota: É recomendável usar filtro dicas para as etapas restantes.
    1. Amostras de lugar em uma cremalheira do tubo de microcentrífuga magnético, remover sobrenadante, Ressuspender delicadamente em 1 mL de tampão B2, rode a 4 ° C por 5 min.
    2. Repita o passo 3.5.1 três vezes.
    3. Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga magnético, remover o sobrenadante, delicadamente Resuspenda em 1 mL de tampão B3 e rode a 4 ° C por 5 min.
    4. Mistura de grânulo transferir 100 µ l (volume de 1/10 th) para um tubo novo para isolamento de DNA acoplado. Aplicar este tubo ao ímã, remover o sobrenadante, resuspenda grânulos em 100 µ l 1 x solução de SDS-bicarbonato e prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).
    5. Aplicar o tubo contendo a mistura de grânulo de 900 µ l restantes da etapa 3.5.3. ao ímã, remover o sobrenadante e ressuspender grânulos em 50 µ l 2 x Laemmli tampão de amostra para eluir proteínas e complexos DNA-proteína.
    6. Amostras de ferver a 95 ° C por 15 min, vortex, rapidamente girar a microcentrífuga e aplicar o ímã. Eluato de transferência para um novo tubo, congelamento flash e loja a -80 ° C.
      Nota: Bloqueios de tampão de uso para assegurar que os tubos não pop abrir enquanto ferver.
      Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C durante várias semanas.
    7. Analisar amostras da proteína por azul de Coomassie mancha, mancha ocidental ou espectrometria de massa por procedimentos padrão 25. Resultados representativos são mostrados na Figura 4 e Figura 5.
      Nota: Para determinar se o rendimento de proteína é suficiente para espectrometria de massa, 7,5 µ l de cada amostra é usado para análise pela coloração de azul de Coomassie e 7,5 µ l para a mancha ocidental de um representante do genoma viral associada da proteína (ICP4, ICP8 ou UL42). O mesmo volume de lysates da etapa 3.3.6. são executados ao lado de Controlarar para níveis de entrada de proteínas. A amostra restante (35 µ l) é então analisada por massa espectrometria conforme descrito anteriormente 25.
  6. Isolamento de DNA
    1. incubar as amostras da escadaria 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h Remove uma amostra de grânulos magnéticos, se necessário.
    2. Extrair amostras com álcool de fenol: clorofórmio: isoamílico 150 µ l (PCI) e transferir a fase aquosa para um tubo novo.
    3. Extrair o restante PCI com 100 µ l Tris-EDTA (TE) e adicionar a fase aquosa para um tubo novo.
    4. Extrair amostras com álcool de clorofórmio: isoamílico 200 µ l (24:1).
    5. Purificar a fase aquosa, usando o Kit de purificação de PCR de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
      Nota: O indicador de pH em Buffer PB ficará roxo quando adicionado à amostra. Adicionar 10 & #181; PH de NaOAc 3M L 5.0 para diminuir o pH da amostra.
    6. Concentração de DNA determinar usando um dados.
      Nota: Este protocolo normalmente rende 100-400 ng grânulo-ligado DNA. Sem DNA deve ser detectado no eluído do controlo negativo no qual EdC não foi adicionado na etapa 1.3.
    7. DNA pode ser armazenado em uma baixa ligação DNA tube 4 ou - 20 ° C e pode ser usado para PCR em tempo real ou a análise do sequenciamento de alto rendimento.

Resultados

O uso da química clique para a purificação do DNA de células primeiro foi realizado pelo iPOND método21. O objetivo do iPOND é purificar forquilhas de replicação celular, para a identificação de proteínas associadas. Nós adaptamos essa técnica para estudar especificamente as interações da proteína vDNA durante a infecção. Manipulação da abordagem de rotular genomas virais com EdC (Figura 1), combinadas com infecçõ...

Discussão

Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos ...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos a Hannah Fox pela ajuda na preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI030612.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
MRC-5 cellsATCCCCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dishThermo Fisher Scientific166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stockStocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)GE Healthcare17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
2´-deoxycytidine (deoxyC)Sigma-AldrichD3897Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
Nuclear Extraction Buffer (NEB)Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraperBellco glass7731-22000Autoclave before use
Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7.2 (10x)1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbateSigma-AldrichA4034Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azideInvitrogenB10184Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year 
Click Reaction MixPrepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)  
Complete Protease Inhibitor CocktailRoche11697498001Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
Freezing bufferPrepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probeSonicsVCX 130
Cell strainerFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
2x Laemmli sample bufferMix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
Cap locks for 1.5 mL tubeFisher ScientificNC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
12-well tissue culture dishCorning3513
CoverslipsFisher Scientific12-545-100Autoclave before use
Microscope slidesFisher Scientific12-552-5
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1605Prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitMolecular ProbesC10337Prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
Mouse anti-ICP8 primary antibodyAbcamab20194Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)Abcamab19311Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibodyLife Technologiesa11005Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
2x SDS-bicarb solution2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcoholMix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcoholMix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kitQiagen28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks65 °C and 95 °C

Referências

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

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