Um protocolo eficiente e reprodutível para distração osteogênese em um modelo de rato, levando a um fêmur regenerada funcional

Resumo

Este estudo descreve um protocolo reproduzível e detalhado usando um fixador externo recentemente desenvolvido para osteogênese distração () em um rato femoral modelo quais licenças fisiológica do peso-rolamento pelo animal após a remoção do fixador externo.

Resumo

Este protocolo descreve o uso de um fixador externo recentemente desenvolvido para osteogênese de distração em um modelo do rato femoral. Osteogênese de distração (DO) é uma técnica cirúrgica levando a regeneração após uma osteotomia de osso. As extremidades osteotomized são movidas longe um do outro por distração gradual para alcançar o alongamento desejado. Este procedimento é amplamente utilizado em seres humanos para membros inferiores ou superiores, alongamento, tratamento após um osso pseudartrose, ou a regeneração de um defeito ósseo após uma cirurgia para a excisão de tumor de osso, bem como na reconstrução maxilo-facial. Poucos estudos demonstram claramente a eficiência do seu protocolo na obtenção de um osso regenerado funcional, ou seja, osso que irá apoiar o peso-rolamento fisiológico sem fratura após a remoção do fixador externo. Além disso, os protocolos para variar e reprodutibilidade é limitada pela falta de informação, fazendo a comparação entre estudos difíceis. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo reprodutível, que inclui um design de fixador externo apropriado para rato alongamento do membro, com uma técnica cirúrgica detalhada que permite fisiológica do peso-rolamento pelo animal após a remoção do externo fixador externo.

Introdução

Osteogênese de distração (DO) é que uma técnica cirúrgica amplamente usada clinicamente^1,2,3,4 em seres humanos para baixa^1,2 e alongamento do membro superior³ , tratamento após um osso pseudartrose, ou a regeneração de um defeito ósseo após uma cirurgia para a excisão de tumor ósseo, bem como na reconstrução maxilofacial⁴. FAZER leva a regeneração do osso após a colocação de um fixador externo em osso e osteotomia. As extremidades osteotomized são movidas longe um do outro por distração gradual² para alcançar o alongamento desejado. Segue um período de consolidação, durante o qual não há nenhum mais alongamento.

O procedimento é dividido em três fases distintas: latência, distração e consolidação. Geralmente, um período de latência de 7 dias começa logo após osteotomia⁴. Isso permite que a reparação óssea começar a etapa inicial do processo cura⁴. O período de latência é seguido por um período de distração onde as forças de tração são aplicadas para o calo regenerado e tecidos moles circundantes^1,2,4. Quando o alongamento desejado é atingido, paragens de distração e o período de consolidação começa. Durante este período, o fixador externo seja mantido até o osso regenerado é funcional o suficiente para suportar a sua remoção.

Vários parâmetros de influenciar a reparação óssea, tais como o comprimento e a taxa de alongamento, tipo de fixador externo, frequência de distração, a duração do período de consolidação, o tipo de stress mecânico aplicado para o calo distraído. Como exemplo, a taxa e frequência de alongamento podem levar a consolidação prematura⁵ ou a interrupção do processo através da criação de dano irrecuperável como tecido necrótico ou cistos dentro o calo^6,7.

Muitos protocolos foram aplicadas a diferentes modelos animais^8,9,10 para estudar os processos de reparação óssea e maximizar a consolidação óssea. Em ratos, a maioria dos estudos^{11,12,13,14,15} focada em como encurtar o protocolo por acelerar a consolidação de calo. Alguns desses estudos experimentais utilizados fixadores externos já comercialmente disponíveis para aplicações clínicas humana^5,13,15,16. No entanto, estes tipos de fixador externo na não são adequados para fazer o fêmur de ratos, que apresenta diferentes características anatômicas do fêmur humano. Além disso, poucos estudos demonstram claramente a eficiência de seus protocolos na obtenção de um osso regenerado funcional^7,16. Portanto, é difícil comparar os resultados de vários estudos, devido a suas diferentes protocolos e falta de informação sobre o fixador externo^12,13,14,17.

Assim, o objetivo deste estudo foi descrever, em um modelo do rato, um protocolo eficiente e reprodutível para fazer sobre o fêmur que leva a um osso regenerado funcional. Para este fim, nós projetamos um fixador externo caseiro e fácil de usar, especialmente para o fêmur de ratos, que descrevemos em detalhe no presente protocolo. Na elaboração de especificações técnicas para este dispositivo, levamos em conta todas as limitações fundamentais para uma boa distribuição de tensões mecânicas e evitando a produção de tensão residual. Especificação técnica incluiu uma geometria apropriada para o dispositivo para permitir que a força de tração pura em ossos e tecidos circundantes, um peso adequado para a marcha do animal, controle do comprimento de alongamento ósseo e um bom alinhamento dos segmentos ósseos sem produção de tensão de cisalhamento no cruzamento de pinos e osso. Além disso, este dispositivo teve que ser utilizável sem sedação do animal durante a distração, biocompatível e podem ser esterilizada sem danos. Após 7 semanas de consolidação, este protocolo para fazer sobre o fêmur de rato levou a um osso regenerado funcional, demonstrado pelo fisiológica do peso-rolamento dos animais sem fratura do calo regenerada após a remoção do fixador externo. A marcha fisiológica dos animais era consistente com arquiteturais parâmetros obtidos de análise micro-CT do calo regenerado e análise de raios-x.

Protocolo

todos os procedimentos descritos foram aprovados da Universidade de Aix-Marseille animal cuidados e uso Comissão institucional e o Ministério de pesquisa francês e realizados na casa animal convencional de (Faculdade de medicina de Marselha França).

1. definir especificações funcionais do fixador externo baseado sobre as diretrizes a seguir

1. fixação do osso Optimize.
   1. Implante segmentação metade pinos com de 1 mm de diâmetro (da seção rosqueada).
2. Escolher um projeto para reduzir o desconforto para o animal.
   1. Escolher um fixador externo de um tamanho pequeno que se encaixa em um volume de 7.723 mm ³ (32 x 19 x 12,7 mm).
   2. Escolher um fixador externo com baixo peso, menos de 13 g sem os pinos, para evitar perturbar os animais ' marcha. Escolher o alumínio como o material para os dois blocos devido à sua baixa densidade.
      Nota: Os chanfros dos blocos diminuem consideravelmente o peso das duas partes.
3. Controlar o movimento do fixador externo, tal que a direção da força de tração é mantida paralela à direção do osso e certifique-se de forças de tração puras.
   1. Uso um deslizamento da barra que atravessa os dois blocos. Groove e abra os blocos para que cada um possa carregar dois pinos.
   2. Usar um parafuso de alongamento com um lado liso que gira livremente no bloco e pode ser tomado pelos dedos e com um lado rosca impregnam o segundo bloco por rotação. Ancore dois pinos no osso, em cada lado da fratura, para manter a direção da força de tração paralela à direção do osso. Manter as forças de tração no eixo longitudinal para permitir a boa distribuição de stress nos pinos. Fixe os quatro pinos com parafusos de bloqueio.
4. Escolher materiais como alumínio, titânio e aço que pode suportar temperaturas de esterilização.
5. , Certifique-se de que o posicionamento no pino corresponde à geometria de fixador externo ( Figura 1 -B).
   1. Usar um guia de perfuração que contém uma pinça apertada no osso para manter a posição de perfuração.
   2. Encurtar o braço de alavanca do grampo para baixo força de aperto. Coloque a braçadeira no meio do dispositivo, acima da fratura futura, para limpar os lados.
6. Make a distração fácil manual ajuste adicionando um parafuso recartilhado para apertar e soltar o bloco móvel.
   1. Use um parafuso grande o suficiente para manipular com dedos sozinhos.
   2. Adicionar uma porca quadrada perfurada no meio do parafuso de alongamento entre os dois blocos, para permitir fácil distração.
   3. Fazer esta porca quadrada (8 mm de cada lado) maior do que os dois blocos para permitir o uso manual com um pino fino ou qualquer tipo de objeto. Vire o parafuso de ¼ vire para permitir que um alongamento de 0,125 mm.

2. Cirurgia

Nota: um assistente é necessário para todos os procedimentos cirúrgicos. Quatro 12 semanas ratos Sprague Dawley masculinos foram alimentados com um padrão de laboratório dieta ad libitum.

1. Preparar ferramentas cirúrgicas.
   1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos seguintes: 1 rugine, Senn 2 ' 1 Bisturi, 1 de micro agulha Hegar Olsen-titular, 1 porta-agulha Mayo-Hegar, 1 tesoura de mayo e retractores s.
   2. Esterilizar o fixador externo, o guia de perfuração, 4 pinos meia-rosca, 4 parafusos, a ponta e a sequência de caracteres da broca e a ponta e a sequência de caracteres da piezotome. Esterilizar estes instrumentos em autoclave a 135 ° C por 18 min.
   3. Instalar uma almofada de aquecimento abaixo o campo estéril, sobre a mesa cirúrgica. Coloque todos os instrumentos ou ferramentas em outro campo estéril.
2. Anesthetize e preparar o animal.
   1. Pesa o rato para preparar a mistura analgésica e anestésico
   2. determinar e calcular a quantidade de Bupremorphine e carprofeno para preparar a mistura analgésica extemporaneamente. Use a buprenorfina (0,03 mg/mL) e carprofeno (5 mg/mL) respectivamente em 0,05 mg/kg e 5 mg/kg
   3. Conter o rato e por via subcutânea injetar a mistura analgésica. aguarde alguns segundos, em seguida, injetar intraperitonealmente a mistura anestésica.
   4. Raspar o membro posterior direito com um barbeador elétrico e desinfectar o membro com solução de iodo-povidona.
   5. Colocar o animal lateralmente (direita para cima) sobre o campo estéril para permitir o posicionamento correto do fixador externo ao longo do eixo mediolateral.
   6. Colocar uma compressa esterilizada sobre sua cabeça para proteger seus olhos durante a cirurgia.
3. Implante o fixador externo no fêmur.
   1. Marco da incisão na pele. Com um marcador, desenhe um ponto da parte distal (joelho) e um segundo ponto na parte proximal (quadril), seguindo a linha mediana no plano sagital. Em seguida, desenhe uma linha entre estes 2 pontos.
   2. Incisão da pele esticada ao longo da linha de desenho usando um bisturi.
   3. Corte entre o bíceps femoral e vasto lateral até que o fêmur está completamente exposto, com a ajuda de um bisturi. Uso o 2 Senn ' retractores s (talvez seja necessário um assistente) para facilitar a incisão do músculo.
   4. Levantar o periósteo e desconecte o tecido mole do osso com a ajuda de um rugine.
   5. Verificar que o fêmur exposto é tempo suficiente.
      1. Inserir pinos nos buracos mais proximais e distais do fixador externo.
      2. Posicionar o fixador externo e verificar que os dois pinos podem ser ancorados em fêmur.
   6. Implante 4 pinos de metade-rosca de 1 mm no fêmur em paralelo.
      1. Levar o guia de perfuração e distante mover os músculos com 2 Senn ' retractores s. Aperte a braçadeira do guia de perfuração no meio do fêmur.
      2. Broca 4 pré-furos no fêmur. Usando uma furadeira elétrica, furos a uma velocidade de 2.000 rpm, passando de uma broca de metal de diâmetro de 0,6 mm através dos furos de 4 guia.
         1. Começar com o mais proximal e distal buracos e terminar com os dois médio queridos do guia. Tenha cuidado ao passar por ambos os córtices mas para não danificar os tecidos moles sob o fêmur.
      3. Tirar o perfuração guia.
      4. Ampliar os 4 pre-furos com pino de meio-segmentadas de 0,8 mm.
         1. Trabalho o alfinete e para trás e a 0,6 milímetros furos. Tenha cuidado para ficar perpendicular ao fêmur e coletor por ambos os córtices.
      5. Pinos de metade-rosca de 1 mm do implante.
         1. Segure a cabeça do pino de meio-rosca de 1 mm com um porta-agulha.
         2. Afundar o pino para alargar o pré buraco. Verifique se os pinos penetram ambos os córtices e não projetam-se mais de 1 mm, com um Senn ' retractor de s.
      6. Conectar-se o fixador externo para os metade-rosca 4 pinos. Certifique-se de que o deslocamento (distância entre o fixador ' s dois blocos e a superfície do osso) é de cerca de 6 mm para permitir a fácil pontos e boa rigidez do sistema ¹⁸.
      7. Proteger os 4 parafusos de fixação, de forma que o fixador externo é bloqueado para os pinos.
4. Osteotomize fêmur.
   1. Executar uma osteotomia entre os 2 pinos centrais com um piezotome.
   2. Fechar o wound usando um ponto corrido com um fio de sutura absorvível (5.0) e porta-agulha Mayo-Hegar. Certifique-se apenas a pele é costurada e não os músculos.
5. Verifique se o monitor e cirurgia animais.
   1. Realizar um raio-x, logo após a cirurgia, enquanto o animal ainda está anestesiado. Verifique a profundidade de todos os pinos e extremidades osteotomizadas alinhados após o longo eixo.
   2. Certifique-se de analgesia e antibioprophylaxy por via subcutânea de buprenorfina (0,03 mg/mL) e Enrofloxacine (50 mg/mL) respectivamente em 0,05 mg/kg e 10 mg/kg.
   3. Determinar e calcular a quantidade de antipamezole para reverter a anestesia. Usar antipamezole 1mg/kg e fazer uma injeção subcutânea para administrar o produto. Permitir que o animal recuperar a consciência e devolvê-lo à sua jaula.
   4. Seis horas após a cirurgia, injetar uma segunda dose da mistura de analgesia (buprenorfina e carprofeno) respectivamente em 0,05 mg/kg e 5 mg/kg por via subcutânea.
      Para os próximos 3 dias, pelo menos, dar essas injeções duas vezes por dia para a mistura de analgesia e uma vez por dia para o antibioprophylaxy. Regulares exames clínicos devem ser realizados para avaliar a eficácia da analgesia e devem ser modificados de acordo com os sinais de comportamento de cada animal.
   5. Verificar que os animais podem caminhar usando seu membro hind operado normalmente no dia seguinte a cirurgia.

3. Distração

1. deixar o fixador externo em neutro de fixação para 1 semana. Raio-x do membro no final desta fase. Verificar o posicionamento dos pinos e o alinhamento dos segmentos osso.
2. Manualmente gire a porca quadrada metade (0,25 mm) no sentido horário cada 12 h para executar a distração. Distrair-se durante 10 dias, que deverá conduzir a um alongamento do osso de 5mm, representando 12% alongamento relativo para o comprimento inicial do segmento ósseo operado.
   1. Não anestesiar o animal durante esta etapa. O membro meio por meio e no final deste período para verificar o posicionamento dos pinos e alinhamento dos segmentos de osso de raio-x.
3. Manter o fixador externo por 47 dias. Raio-x do membro semanalmente para verificar o progresso da calcificação lacuna distraído. No dia 64, remover o fixador externo e deixe o animal caminhar livremente para mais de 2 dias (dia 66). O período de consolidação total dura semanas 7.
4. Eutanásia em todos os ratos após 7 semanas de consolidação com uma overdose de sevoflurano inalado.
5. Ressecar fêmures distraídos e contralaterais sem os tecidos circunvizinhos.
   1. Fazer uma incisão na pele sobre a cicatriz localizado na linha mediana, seguindo o plano sagital com a ajuda de um bisturi. Executar a incisão da parte superior do quadril para a frente do joelho.
   2. Corte entre o bíceps femoral e vasto lateral com um bisturi, até que o fêmur está completamente exposto. Tanto quanto possível, desconectar o músculo que está ligado ao osso.
   3. Cortar todos os ligamentos do joelho e desmontar a articulação.
   4. Cortar a cápsula da articulação do quadril.
   5. Limpe o osso sem remover os pinos de metade-rosca. Remover todo o tecido mole com um bisturi.
6. Repita os passos de 3.5.1 para 3.5.5 para o fêmur contralateral.
7. Raio x fêmures distraídos e contralaterais. Remova os 4 pinos meia-rosca e armazenar todos os fêmures a-20 ° C para análise microtomografia computadorizada (resolução de 10 µm).

Resultados

As imagens de raio-x tiradas do final do procedimento cirúrgico para o final da consolidação não mostraram nenhum afrouxamento dos pinos meia-rosca no fêmur, indicando a fixação estável. Os pinos foram paralelas e bem preservado. Osteotomized extremidades estavam bem alinhadas ao longo do eixo longitudinal do osso durante o processo de fazer (Figura 2). No final do período de latência, sem áreas calcificadas eram visíveis (Fig...

Discussão

Este estudo descreve um protocolo reprodutível, que inclui um design de fixador externo apropriado para rato alongamento do membro, com uma técnica cirúrgica detalhada que permite fisiológica do peso-rolamento pelo animal após a remoção do fixador externo. Nosso protocolo levou a um osso regenerado funcional. Depois de 47 dias de consolidação, remoção do fixador externo caseiro e 2 dias do peso-rolamento fisiológico pelo animal não induzir qualquer fractura do calo regeneradora. Graças a reconstrução de m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kétamine	Renaudin	578 540-2	Supply by animal house
Médétomidine	Virbac	6799091	Supply by animal house
Sevoflurane	Centravet	567 477-2	Supply by animal house
Buprenorphine	Indivor France	3400932731060	Supply by animal house
Enrofloxacine	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	Supply by animal house
Piezotome	Satelec Acteon	F57510
Heating pet pad	Therasage	AL8365936	Supply by the animal house
Dental X-ray	S.A.R.L Innovation médicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
Micro-CT system	nanoScan SPECT/CT	GEIT-31105EN (05/14)	Subcontract by IVTV central Lyon
Micro-CT analysis Software	phoenix datos X2 reconstruction	none	Free software
Electric razor	Brawn	GT415	Supply by animal house
Senn’s retractors	Word Precision Instruments	501718	Blunt version
Betadine Solution	Mundipharma Medical Company	D08AG02	Supply by animal house
Resorbable suture thread (5.0)	Ethicon	JV1023	Supply by animal house
Rugine	Word Precision Instruments	503406
Mayo-Hegar needle holder	Word Precision Instruments	V503382
Metal drill	Beuterlock	V020944018003
Micro Olsen-Hegar Needle-holder	Word Precision Instruments	501989
Mayo scissor	Word Precision Instruments	501752
Scalpel	Word Precision Instruments	500236
Sprague-Dawley	Janvier	none	12 weaks and male