Avaliação da fragilidade do osso Cortical bovino, usando testes de zero

Resumo

Este estudo avalia a tenacidade à fratura de osso cortical bovino a nível sub-meso usando exames microscópicos de zero. Este é um original, objetivo, rigoroso, e reprodutível método proposto para sondar a tenacidade à fratura abaixo a escala macroscópica. Potenciais aplicações estão a estudar alterações fragilidade óssea devido a doenças como a osteoporose.

Resumo

Osso é um material complexo hierárquico com cinco níveis distintos de organização. Fatores como o envelhecimento e doenças como a osteoporose aumentam a fragilidade do osso, tornando-se sujeito a fratura. Devido ao grande impacto sócio-económico de fratura óssea na nossa sociedade, há uma necessidade de novas formas de avaliar o desempenho mecânico de cada nível hierárquico do osso. Embora a rigidez e resistência podem ser analisados em todas as escalas – nano, micro, meso-, e macroscópica – avaliação de fratura está até agora confinada aos ensaios macroscópicos. Essa limitação restringe a nossa compreensão de fratura óssea e restringe o escopo de laboratório e estudos clínicos. Nesta pesquisa, investigamos a resistência da fratura de osso do microscópico para as escalas de comprimento mesoscópica usando micro arranhão testes, combinadas com a mecânica da fratura linear. Os testes são realizados na orientação longitudinal curta em espécimes de osso cortical bovino. Um protocolo experimental meticuloso é desenvolvido e um grande número (102) de testes são realizados para avaliar a tenacidade à fratura de espécimes de osso cortical, enquanto a contabilidade para a heterogeneidade associada com a microestrutura do osso.

Introdução

Neste estudo, podemos medir a tenacidade à fratura de osso compacto bovino na mesoescala (osteomas) para a microescala (nível lamelar) usando uma nova técnica de zero micro^{1,2,3,4, 5}. Processos de fratura incluindo propagação iniciação e crack no osso sejam diretamente influenciados pelas escalas de comprimento devido a diferentes componentes estruturais e organização em diferentes níveis de hierarquia. Portanto, avaliar a fratura óssea em menores escalas de comprimento é essencial rendendo um entendimento fundamental de fragilidade óssea. Por um lado, compacto de testes convencionais, tais como três pontos de flexão, tensão, e testes de flexão são comumente realizadas em bovino fêmur e tíbia para caracterização de fratura em escala macroscópica^{6,7, 8}. por outro lado, para medir a tenacidade à fratura em escala microscópica, fratura de recuo do Vicker foi proposto⁹. Micro recuo foi executado usando do indenter da Vicker para gerar rachaduras radiais. Além disso, o método de dureza Oliver Pharr nanoindentação fratura foi realizado usando um cubo afiada canto do indenter¹⁰.

Os estudos de resistência de fratura nanoindentação baseado acima, os comprimentos das fissuras gerados foram medidos pelo observador e um modelo semi-empíricos foi utilizado para calcular a tenacidade à fratura. No entanto, esses métodos são reprodutíveis, subjetivo, e os resultados são altamente dependentes da habilidade do observador, devido à necessidade de medir os comprimentos de rachadura usando microscopia ótica ou microscopia eletrônica. Além disso, zero testes foram conduzidos em escala nanométrica, mas o modelo matemático subjacente não é baseado em física que não leva em conta a redução da resistência devido a rachaduras e defeitos¹¹. Assim, existe uma lacuna de conhecimento: um método para avaliação de fratura em nível microscópico com base em um modelo mecanicista baseado em física. Esta lacuna de conhecimento motivado a aplicação de micro arranhão testes para compactar osso focando primeiro espécimes suínos⁵. O estudo foi ainda mais estendido agora para entender o osso cortical bovino.

Duas orientações diferentes dos espécimes são possíveis: transversal longitudinal e a curta distância longitudinal. Longitudinal transversal corresponde a fratura Propriedades perpendiculares ao eixo longitudinal do fêmur. Considerando que, a curto, longitudinal corresponde às propriedades fratura ao longo do eixo longitudinal do fêmur⁵. Neste estudo, aplicamos testes zero de ossos corticais bovina para caracterizar a resistência de fratura do osso no sentido longitudinal curta.

Protocolo

Nota: O protocolo descrito aqui, segue as diretrizes de cuidados com animais do Comité de uso e cuidados de Animal institucionais de Illinois.

1. o modelo contratos

1. Coletar recém-colhidas fêmures bovina de um departamento de Estados Unidos de agricultura USDA-certificada matadouro e transportá-los em sacos de plástico de ar apertado em um refrigerador.
   Nota: Para o estudo realizado aqui, fêmures foram coletadas de animais que foram 24 a 30 meses, alimentado com milho e pesava cerca de 1.000 - 1.100 libras.
2. Congele os fêmures no –20 ° C até o início do processo de preparação de espécime. Esta temperatura mantém os fêmures fresco^12,13,14.

2. corte, limpeza e incorporando os espécimes

1. Descongele os fêmures congelados em um recipiente com água por cerca de 2 h à temperatura ambiente.
2. Corte vários discos de cerca de 10-15 mm de espessura da região média da diáfise usando uma serra de fita mesa top diamante para produzir espécimes com área de seção transversal uniforme do osso cortical.
3. Use um kit de dissecação para remover qualquer tecido mole ou carne anexado ao osso cortical.
4. As seções transversais dos fêmures obtidas na etapa 2.2 usando uma lâmina de diamante-wafering em uma velocidade baixa serra sob condições de chuva ao longo do eixo longitudinal do osso para obter várias seções aproximadamente cuboidal.
   Nota: Aqui, apenas a preparação das amostras e zero testes realizados sobre o short – amostras longitudinais são discutidas. No entanto, exceto para a direção do corte, o procedimento de preparação permanece o mesmo para a orientação transversal.
5. Limpe os espécimes em uma solução preparada usando 1,5% aniônico limpa e água sanitária de 5% para uma duração de 20 min em um líquido de limpeza ultra-sônico.
6. Incorporar os espécimes de osso cortical em resina acrílica (neste documento methacrylate de polymethyl (PMMA)) para facilitar a manipulação e a estabilidade.
   1. Para incorporar os espécimes, primeiro revesti as paredes do molde com um agente de liberação. Em seguida, misture a resina acrílica e o endurecedor num copo, de acordo com as instruções dadas pelo fabricante do PMMA.
   2. Coloque um dos espécimes cortar osso cortical em cada molde com a superfície a ser riscado virado para baixo. Deite a mistura de resina acrílica para estes preparados suportes de amostra. Deixe os espécimes cura para uma duração de até 4-5 h.
7. Cortar os espécimes incorporados em discos de espesso de 5 mm, expondo a superfície a ser riscado, usando a baixa velocidade vi e montar os espécimes para discos de metal (alumínio) de diâmetro 34 mm e altura 5 mm usando adesivo de cianoacrilato.
8. Embrulhe os espécimes em um indicador embebido em novelos balanceada salina solução (HBSS) e refrigerar a 4 ° C até o uso mais de^15,16.

3. esmerilhamento e polimento de protocolos

Nota: Um pré-requisito para testes de alta precisão em escalas de comprimento pequeno é uma superfície lisa e nivelada de espécimes. Anterior de polimento protocolos^13,17 resultar em uma grande rugosidade da superfície, levando a considerável imprecisão na medição. O desafio reside em conseguir baixa média rugosidade da superfície, menos de 100 nm, sobre uma superfície de² de 3 x 8 mm de grande área.

1. Moa as amostras de osso cortical bovino à temperatura ambiente utilizando grão 400 e 600 trabalhos de carboneto de silício de grão por 1 min e 5 min, respectivamente. Manter o moedor-polidor a base velocidades de 100 rpm e 150 rpm, respectivamente.
2. Máquina de moer os espécimes de osso cortical bovino à temperatura ambiente sobre os documentos de grão 800 e 1.200 para uma duração de 15 min para cada etapa. Manter o moedor-polidor em uma velocidade base de 150 rpm, velocidade da cabeça de 60 rpm e operando com carga de 1 lb.
3. Polonês os espécimes usando 3 µm e 1 µm 0,25 µm soluções de suspensão de diamante na mesma ordem em um duro, perfurado, pano não tecido para uma duração de 90 min à temperatura ambiente. Manter a carga de funcionamento de cada etapa em 1 lb com as velocidades de base e cabeça do polidor a 300 rpm e 60 rpm, respectivamente.
4. Polir a amostra usando solução de suspensão 0,05 µm da alumina em um pano macio, sintética rayon para uma duração de 90 min no 1 lb com base e cabeça a velocidade de 100 rpm e 60 rpm, respectivamente, também à temperatura ambiente.
5. Colocar as amostras em um copo com água desionizada e colocar o béquer em um banho ultra-sônico por 2 min entre cada etapa consecutiva de esmerilhamento e polimento para limpar os resíduos e evitar a contaminação cruzada.
6. Ver os as características de superfície usando microscopia ótica e SEM imagem.
   Nota: Como mostrado na Figura 1, osteomas, canais de Havers, linhas de cimento, regiões intersticiais e lacunas foram observadas em espécimes do osso cortical bovino. Esses métodos de imagem revelam a natureza porosa, heterogênea e anisotrópica de espécimes de osso cortical. Além disso, avançado exame de superfície das amostras foi realizada para avaliar a qualidade da superfície polida. Uma superfície polida representativa é mostrada na Figura 2.

4. micro teste de alergia

Nota: Micro arranhão de testes é realizado sobre as amostras de osso cortical bovino polido usando um micro testador de zero (Figura 3). Um diamante do indenter de Rockwell com um raio de 200 µm e apex ângulo de 120° é usado para o estudo. O instrumento permite a aplicação de uma carga linear progressiva até 30 s. Além disso, o instrumento é equipado com sensores de alta precisão para medir a carga horizontal, profundidade de penetração e emissões acústicas geradas devido a coçar. O instrumento pode capturar os panoramas de sulcos zero.

1. Antes de ensaios de amostras de osso cortical, calibre a ponta do indenter de Rockwell usando policarbonato como material de referência³.
2. Colocar a amostra de osso cortical no palco e escolha o site de teste de alergia, usando o microscópio ótico configurar integrado ao módulo de micro testador de zero.
3. Aplicar uma carga linear progressiva com uma carga inicial de 30 mN e final de carga de 30 s. A taxa de carregamento deve ser definida como 60 N/min e o comprimento de zero a 3 mm.
4. Executar a série de testes de zero sobre o curta longitudinal (Figura 3b) amostras de osso cortical bovino, conforme ilustrado na Figura 3.
5. Molhe a superfície do espécime com HBSS após um conjunto de todos os três a quatro testes de zero para mantê-los hidratados.
6. Analise os dados de teste cutâneo com base na mecânica da fratura não-linear modelagem².

Resultados

Microscopia de força atômica foi usada para medir a rugosidade da superfície polida. Como regra geral, o espécime qualifica-se como um bem polido se a aspereza de superfície é uma ordem de magnitude menor do que as características da superfície de interesse. Neste caso, a aspereza de superfície medida de 60 nm sobre uma área de µm 40 µm x 40 inscreve-se claramente este critério.

A Figura 4

Discussão

Testes de zero micro induzir uma fratura de modo misto³. Além disso, nas amostras curtas longitudinais osso cortical bovino, processos de fratura são ativados como a sonda cava mais fundo. Para um arranhão de longo de 3 mm, o volume prismático sondado é cerca de 3.600 µm de comprimento, 600 µm de largura e 480 µm profundo. Este grande volume ajudou em prever uma resposta homogeneizada. Um modelo de mecânica de fratura não-linear permitiu-nos extrair a resistência da fratura baseada o

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table Top Diamond Band Saw	McMaster Carr, Elmhurst, IL	Model  C-40	Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	112780	Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser	(Through) Grainger, Peoria, Illinois	39J365	Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	497250	8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester	Anton Paar Switzerland AG	163251	Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope	JEOL USA, Inc., Peabody, MA		Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG	FEI Company		Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Bovine Femur	L&M Slaughter house, Georgetown, IL		Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner	Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603	1104-1	Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting	Electron Microscopy Sciences	24210-02	Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080400	Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080600	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080800	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	16081200	Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407638	Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407518	Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406631	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406630	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406629	Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	40-6377-032	Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025126	Buffer Solution