Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

Resumo

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Resumo

Métodos de coloração de DNA são muito importantes para a investigação biomédica. Nós projetamos um método simples que permite a visualização de DNA a olho nu, a formação de um precipitado colorido. Ele funciona através da imersão a acrilamida ou gel de agarose DNA em uma solução de 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green eu (SG eu) e 0,20 mM nitro azul tetrazólio que produz um roxo precipitado de formazan quando expostos à luz solar ou especificamente a luz azul. Também, testes de recuperação de DNA foram realizados utilizando um plasmídeo resistente à ampicilina em um gel de agarose corado com nosso método. Obteve-se um maior número de colônias com nosso método do que com a tradicional mancha usando SG eu com iluminação ultravioleta. O método descrito é rápido, específico e não-tóxico para a deteção de DNA, permitindo a visualização de biomoléculas a "olho nu", sem um transiluminador e é barato e apropriado para uso em campo. Por estas razões, o nosso DNA novo método de coloração tem potenciais benefícios para a investigação e a indústria.

Introdução

Com os avanços em bioquímica e biologia molecular, os estudos envolvendo DNA exigiram melhores técnicas para analisar o DNA. O primeiro método para coloração de DNA foi prata coloração, que é muito sensível, mas carece de seletividade e não permite a recuperação de amostra. Mais tarde, o desenvolvimento de coloração fluorescente de DNA permitiu a seletiva quantificação de DNA com a possibilidade de recuperação da amostra. Dentre os corantes fluorescentes primeiros usados para quantificação de DNA foi de brometo de etídio¹, que é mutagênico². No entanto, agora existem corantes fluorescentes melhorados mais seguros e mais sensíveis, tais como GelRed e SYBR Green eu (SG eu)³; Mas todos estes corantes fluorescentes exigem o uso de um transiluminador de (UV) ultravioleta ou fluorímetro.

Existem outras técnicas para coloração visivelmente o DNA, como o azul de metileno⁴ e violeta cristal^5,6,7,8,9, mas todos estes sofrem de sensibilidade reduzida e seletividade. Os sais de tetrazólio são suscetíveis a redução de compostos orgânicos e quando isso acontece eles formam um insolúvel e colorida formazan precipitar^10,11. Recentemente, foram mostrados para ligar ao DNA devido seus anéis de tetrazólio positivo¹²sais de tetrazólio bivalente.

Em uma recente publicação¹³, foi proposta uma nova técnica visível para manchar e quantificação de DNA em gel de poliacrilamida, usando a redução de um sal de tetrazólio bivalente chamado nitro azul tetrazólio (NBT) e corantes fluorescentes como brometo de etídio, GelRed, SYBR Green I e SYBR Gold. Esta reação funcionou na presença de luz azul ou luz solar e permitiu a recuperação da amostra com qualidade melhorada em comparação com o uso de SG eu com um transiluminador UV. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado da técnica de coloração usando tetrazólio sais.

Protocolo

1. preparação e execução do Gel

1. Prepare o desnaturação não 12% gel de polyacrylamide gel usando a receita de sódio Dodecil sulfato de sódio-Polyacrylamide Gel eletroforese (SDS-PAGE) encontrados em Sapeka e Russell¹⁴ mas usando água em vez de SDS.
   1. Para preparar a 5 mL de solução de gel, use 1,7 mL de água destilada, 2 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED.
   2. Para preparar 2 mL de gel de empilhamento usar 1,5 mL de água, 0,33 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED. As dimensões do gel são 7,3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x w x d).
      Nota: Use um pente bem 15 de 0,75 mm de espessura para a melhor sensibilidade.
2. Adicione as quantidades adequadas de 6x carregando buffer e amostra de DNA para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (por exemplo, uso 1 µ l de tampão de carregamento 6 x a 5 µ l de amostra de DNA).
3. Coloca o gel na câmara de eletroforese vertical.
   1. Encha a câmara com 750 mL de 1 tampão de x TAE para executar 2 géis. Para preparar 1 L de 50 x TAE, usar 442 g da base Tris, 57,1 mL de ácido acético glacial e 100 mL de pH de EDTA 0,5 M 8. Adicionar água destilada até um volume final de 1 L.
   2. Carrega as amostras no gel. Funcione o gel a 100 V por 2 h.
4. Em alternativa, prepare um gel de agarose 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka¹⁴.
   1. 300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Funcione o gel por 45 min a 100 V.

2. NBT-SG eu coloração (Figura 1).

1. Gel do acrilamido coloração.
   1. Preparar as soluções: 0,1% w/v NBT e 1.2 x SG eu.
      Nota: É possível usar o brometo de etídio, GelRed e SYBR Gold em vez de SG eu, mas eu tive o melhor desempenho de SG.
   2. Despeje 16,75 mL de 1.2 x SYBR verde eu solução em um recipiente de tamanho apropriado.
      Nota: Usamos a tampa de uma caixa de ponta da pipeta como um recipiente, e esses volumes são calculados para cobrir o gel usando este recipiente; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d).
   3. Coloque o gel na solução. 3,25 ml de solução de 0,1% w/v NBT dar NBT de 0.2 mM e 1 x (equivalente a 2,0 µM) SG concentrações finais.
   4. Selar o recipiente com filme plástico e enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente.
      Nota: O filme plástico é usado para evitar salpicos e evitar a reação da película de alumínio com a coloração da solução.
   5. Agitar durante 25 min em um agitador orbital em 60 rpm.
   6. Remova o alumínio e tampa de plástico. Exponha à luz solar por 90 min máximo. Verificar a cada 5 min até que apareça a banda de interesse.
   7. Para usar a luz azul, preparar uma protoboard com 3 diodos emissores de luz (LED) e colocar os LEDs 5 mm da superfície do gel (verifique a coloração continuamente, como o tempo necessário dependerá da intensidade da fonte de luz LED).
2. A coloração do Gel do agarose.
   1. Depois de preparar e executar um agarose 1% gel conforme descrito nas seções 1.4 (as dimensões são 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x d), siga os mesmos passos como em 2.1 com essas modificações:
   2. Despeje 41,9 mL de 1.2 x SG eu solução na tampa de uma caixa de ponta da pipeta; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Adicione 8,1 mL da solução NBT de 0,1%.
   3. Selar o recipiente com filme plástico e em seguida, enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente.
   4. Agitar durante 1 h em um agitador orbital em 60 rpm.

3. os dados análise.

1. NBT-SG que as curvas de calibração.
   1. Obter imagens de gel de digitalização de 1200 dpi.
   2. Software aberto para análise de imagem. Endireite as imagens usando um editor de imagem. Execute uma densitometria de imagem.
   3. Calcule a área sob a curva. Prepare um gráfico do sinal/sinal_Max versus concentração de DNA.

4. o DNA recuperação.

1. Preparar um gel de agarose 1% em 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka¹⁴.
2. 300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Carrega 4 µ l de 100 plasmídeo de¹⁵ pDJ100 ng / µ l e escada de DNA, seguindo o esquema na Figura 2. Funcione o gel durante 1 h a 100 V.
3. Marcar e pesar dois tubos de microcentrifuga de 2 mL.
4. Corte o gel no meio para ter duas metades idênticas. Cada um deve conter a escada e o plasmídeo de amostra para comparar as diferentes técnicas de coloração. Uma representação esquemática é na Figura 2.
5. Manchar uma metade com NBT-SG eu como na etapa 2.
   1. Corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo. Guarde o pedaço de gel em um tubo e pesar.
6. Manchar a outra parte do gel com SG eu com 50 mL de 1 x SG eu solução e agitar lentamente (60 rpm) o gel por 1h na escuridão.
   1. Coloque o gel em um transiluminador e expor por 2 min. corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo.
   2. Guarde o pedaço de gel no outro tubo e pesar.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, mantendo os tubos a-20 ° C.
7. Realize a extração do plasmídeo usando um kit de extração comercial de gel.

5. plasmídeo normalização.

1. Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicione 10 µ l de plasmídeo extraído e 60 µ l do tipo que da água. Misturar e transferir para uma cubeta de quartzo de 60 µ l ou usar 2 µ l diretamente em um Nanodrop.
2. Medir os espectros de absorção entre 230 a 320 nm. Calcule a concentração de plasmídeo da amostra usando a seguinte fórmula:
   
   onde D é o factor de diluição aplicado (neste caso é 70/10), A_x é absorção x nm e 50 é o fator de conversão de µ g/mL para dsDNA.
3. Dilua as amostras para 9,1 ng / µ l.
4. Transformar células competentes de Escherichia coli (e. coli) (por exemplo, XL10 Gold) seguindo a transformação Inoue do procedimento¹⁶ usando 5 µ l de amostra diluída.
5. Contar o número de colônias sobre os pratos de Petri e observe a diluição. Calcular a colônia formando unidades (CFU) com a seguinte fórmula¹⁷:
   
   onde D é o factor de diluição, aplicado desde a cultura inicial.
6. Execute um teste-t não pareado.

Resultados

Um precipitado de formazan roxo aparece onde se encontra o DNA (verificado por espectrometria de massa¹³). No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração (Figura 3). O protocolo funciona para gel de agarose e acrilamida, mas tem uma menor intensidade e leva mais tempo em agarose. No entanto, o uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra usando um kit disponível comercialmente, e nã...

Discussão

Um sensível e romance método de coloração de DNA com base na redução do NBT e o uso do SG, que foi apresentado neste artigo. O passo crítico neste protocolo é o tempo de incubação do gel em NBT-SG eu solução e a concentração de NBT. O tempo de coloração para gel de agarose é maior que para géis de acrilamida por causa da maior espessura de gel de agarose. Esse método não funciona bem na presença de SDS como NBT precipita-se em contacto com ele. Se o gel Obtém um fundo roxo, recomendamos que o gel de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitro blue tetrazolium	Gold Biotechnology	298-83-9	reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	reagent used in the staining
Gel extraction kit	QIAGEN	28704	used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder	Thermo-Fisher	SM 1331	used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar	Merck		used to make LB-ampicillin culture plates
sodium chloride	Merck	1064045000	used to make LB-ampicillin culture plates
yeast extract	Becton, Dickinson and Company	212750	used to make LB-ampicillin culture plates
peptone	Merck	72161000	used to make LB-ampicillin culture plates
TEMED	AMRESCO	761	used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate	Calbiochem	2310	used to make polyacrylamide gels
acrylamide	invitrogen	15512-023	used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide	SIGMA	146072	used to make polyacrylamide gels
Tris-base	Merck	1083821000	used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA	J.T. Baker	8993-01	used to make TAE buffer
Acetic acid	Merck	1,000,632,500	used to make TAE buffer
agarose	Merck	16802	used to make TAE buffer
spectrophotometer	Tecan	infinite 200 pro	used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit	Merck	Elix 100	use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\
distilled water		-	used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl	J.T. Baker	9535-03	used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye	Thermo-Fisher	R0610
5 mm Blue LED	Jinyuan electronics	SP-021	light source used in integrity assay
protoboard	KANDH	KH102	light source support and circuit
9 V battery	Duracell	-	used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber	Biorad	1704486EDU	used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit	Biorad	1658002EDU	used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply	Biorad	1645050	used to power the electrophoresis