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Resumo

Este estudo implementado sequenciamento do genoma inteiro para análise de mutações em genes que conferem resistência a drogas antifúngicas no Candida glabrata. Isolados de c. glabrata resistentes à echinocandins, azóis e 5-flucitosina, foram sequenciados para ilustrar a metodologia. Perfis de susceptibilidade dos isolados correlacionaram com a presença ou ausência de padrões específicos de mutação nos genes.

Resumo

Candida glabrata pode rapidamente adquirir mutações que resultam em resistência às drogas, especialmente de azóis e echinocandins. Identificação de mutações genéticas é essencial, como resistência detectada em vitro muitas vezes pode ser correlacionado com o fracasso clínico. Nós examinamos a viabilidade do uso de sequenciamento do genoma inteiro (WGS) para análise de todo o genoma de resistência a drogas antifúngicas no c. glabrata. O objectivo era torecognize facilitadores e barreiras na implementação do GTS e mede a sua eficácia. Este paper descreve os pontos de verificação de chave de controle de qualidade e componentes essenciais da metodologia WGS para investigar marcadores genéticos associados com reduzida susceptibilidade aos agentes antifúngicos. Também estima-se que a precisão da análise de dados e turn-around-time de testes.

Suscetibilidade fenotípica de 12 clínicos e uma cepa ATCC de c. glabrata foi determinada através de testes de susceptibilidade. Estes incluídos três isolam pares, de três pacientes, que se desenvolveu a ascensão em concentrações inibitórias mínimas de drogas. Em dois pares, o segundo isolar cada par desenvolvido resistência a echinocandins. O segundo isolado do terceiro par desenvolveu resistência ao 5-flucitosina. O restante composto por sensíveis e resistentes azólicos isolados. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes ligados à resistência echinocandin, AZOL e 5-flucitosina foram confirmados em isolados resistentes através de WGS utilizando o sequenciamento de geração seguinte.  Non-sinônimo SNPs em resistência antifúngica genes tais como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 foram identificados. Em geral, uma média de 98% das leituras WGS dos isolados de c. glabrata , mapeados para o genoma de referência com uma cobertura de cerca 75-fold leitura de profundidade. O tempo de retorno e custo eram comparáveis aos Sanger sequenciamento.

Em conclusão, WGS de c. glabrata era viável em revelar clinicamente significativas mutações envolvida na resistência à classes de diferentes drogas antifúngicas, sem a necessidade de múltiplas reações de PCR/DNA arranjar em sequência. Isto representa um passo positivo para estabelecer capacidade de WGS no laboratório clínico para a deteção simultânea de substituições confere resistência antifúngico.

Introdução

Candida glabrata é um patógeno encontrado cada vez mais importância como uma espécie que apresenta resistência as azóis bem mais recentemente, como o echinocandins1,2,3. Ao contrário do diploide c. albicans, o genoma haploide de c. glabrata pode permitir adquirir mutações e desenvolver resistência a múltiplas drogas mais facilmente. Co resistência para ambas as classes de drogas também tem sido relatado4. Portanto, avaliação precoce de susceptibilidade e detecção de resistência a drogas em c. glabrata são cruciais para a terapia correta, orientada, bem como no contexto da mordomia antifúngico para limitar os condutores de resistência antimicrobiana1 , 5 , 6. estabelecimento de um fluxo de trabalho eficiente para rapidamente detectar a presença de mutações confirmação ligado a biomarcadores de resistência em isolados resistentes irá também ajudar a melhorar a prescrever as decisões e os resultados clínicos.

Susceptibilidade é geralmente avaliada pela medição de concentração inibitória mínima (CIM), que é definida como a menor concentração da droga que resulta em uma redução significativa no crescimento de um microorganismo em comparação com o de um crescimento de drogas controle. Os clínicos e Laboratory Standards Institute (CLSI) e Comité Europeu em testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) têm como padrão susceptibilidade, métodos de ensaio para determinação da MIC mais exata e consistente7, 8. No entanto, o utilitário de antifúngico MIC permanece limitado, especialmente para o echinocandins, em particular com relação a comparações interlaboratoriais onde metodologias variadas e condições são usadas9. Há também correlação incerta de microfones com resposta ao tratamento echinocandin e incapacidade de distinguir WT (ou sensíveis) isolados daqueles abrigando FKS mutações (echinocandin-resistentes)10,11. Apesar da disponibilidade de confirmação single-gene PCRs e Sanger sequenciamento dos marcadores de resistência antifúngicos, realização de resultados é muitas vezes adiada devido à falta de detecção simultânea de múltiplos resistência marcadores5,12. Daí, a deteção simultânea de mutações de resistência-conferindo em locais diferentes no genoma, habilitado por análise baseada no sequenciamento do genoma inteiro, oferece vantagens significativas sobre as abordagens atuais.

Genoma de sequenciamento (WGS) foi implementado com sucesso para controlar a transmissão da doença durante surtos, bem como uma abordagem para a resistência de avaliação e drogas de risco todo o genoma testes em bactérias e vírus13. Recentes avanços na tecnologia de sequenciamento de ácidos nucleicos fizeram o sequenciamento do genoma inteiro (WGS) de patógenos em um turn-around-time clinicamente acionável tanto técnica e economicamente viável. Sequenciamento de DNA oferece importantes vantagens sobre outros métodos de identificação do patógeno e caracterização empregadas em laboratórios de microbiologia14,15,16. Primeiro, ele fornece uma solução universal com qualidade, velocidade e alto rendimento. Sequenciamento pode ser aplicado a qualquer um dos microrganismos e permite economias de escala nos laboratórios locais ou regionais. Em segundo lugar, que produz dados em um formato de 'futuro' passível de comparação aos níveis nacionais e internacional. Finalmente, a potencial utilidade do WGS na medicina tem sido aumentada pelo rápido crescimento das bases de dados públicas contendo genomas de referência, que podem ser vinculadas a bases de dados equivalentes que contêm metadados adicionais clínicos e epidemiológicos17 ,18.

Estudos recentes têm demonstrado a utilidade da GTS para identificação de marcadores de resistência antifúngicos de isolados clínicos de Candida spp. 10 , 19 , 20. isto é principalmente devido à disponibilidade de sequenciadores de bancada de alta produtividade, dutos de Bioinformática estabelecida e diminuindo o custo do sequenciamento de21,22. A vantagem do WGS fúngicas sobre Sanger sequenciamento é que WGS permite sequenciamento de genomas múltiplas em uma única corrida. Além disso, GTS de genomas de Candida pode identificar mutações romance em alvos de drogas, rastrear a evolução genética e o surgimento de tipos de sequência clinicamente relevantes de22,20,23. Mais importante, em casos de multirresistência intrínseca, WGS pode auxiliar na deteção adiantada de mutações de resistência-conferindo antes da seleção de tratamento22,24.

Aqui, examinamos a viabilidade do WGS-habilitado o rastreio de mutações associadas com resistência de droga para diferentes classes de agentes antifúngicos. Apresentamos uma metodologia para a implementação do WGS do usuário final e perspectivas do laboratório de Micologia diagnóstica. Foram incluídos nesta análise três isolar pares cultivadas de três casos clínicos separados no qual em vitro resistência à echinocandins e 5-flucitosina desenvolvido ao longo do tempo após o tratamento antifúngico.

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Protocolo

Nenhuma aprovação ética foi necessária para este estudo.

1. a subcultura e inóculo preparação para Candida glabrata

  1. Selecione um painel de isolados de C.glabrata a ser estudado, que também deve incluir pelo menos um c. glabrata americano tipo cultura Collection (ATCC) com padrão de susceptibilidade conhecido.
  2. Subcultura um isolado tocando uma única colônia com uma ansa de plástico descartável estéril e estrias em ágar de um meio de Sabouraud dextrose (ASD) placa8.
  3. Incube a placa SDA por 24-48 h a 35 ° C, para uma cultura pura de isolado com bom crescimento.

2. determinação da susceptibilidade

  1. Uso uma ansa de plástico descartável estéril para escolherem um recém repicagem c. glabrata colônias de 4-5 de aproximadamente 1 mm de diâmetro isolar na placa do SDA. Resuspenda em 3 mL de água destilada estéril. Misture bem pipetando suave para obter a suspensão uniforme.
  2. Ajuste a densidade de células de McFarland 0,5 que equivale a 1 x 106 a 5 x 106 células/mL, usando um densitômetro 8.
  3. Realizar testes de sensibilidade usando ensaio comercial (ver tabela de materiais e reagentes) em todos os c. glabrata isola seguindo as instruções do fabricante. Interpretar a susceptibilidade dos isolados com base em microfones resultantes de drogas antifúngicas de acordo com as diretrizes do CLSI e preparar o relatório (tabela 1)8.

3. genômica extração de DNA para sequenciação

  1. Resuspenda um loopful das colônias de uma placa SDA recém crescida em 300 µ l de 50 mM EDTA em um tubo de 1,5 mL.
  2. Adicione 40 µ l de zymolyase (10 mg/mL) para a suspensão e suavemente a pipeta 5 vezes até que a suspensão é uniforme.
  3. Incube a amostra a 37 ° C, durante 1-2 h digerir a parede celular. Esfriar em temperatura ambiente por 5 min.
  4. Centrifugar a suspensão de 14.000 × g por 2 min e remova cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Extrair DNA genômico, seguindo diretrizes de kit de extração de DNA (ver tabela de materiais).
  6. Ressuspender extraído pellet de DNA em 50 µ l de tampão Tris (pH 7,5-8,5) em vez de eluição buffer fornecido no kit de 10 mM.
  7. Verificar a pureza do DNA por medição da densidade óptica (d) no 260/280 nm25.

4. genomic quantificação de DNA

  1. Preparar um 1x Tris EDTA (TE) buffer fornecido no kit de ensaio com base nas orientações do fabricante para o ensaio de fluorescência (ver tabela de materiais).
  2. Dilua a amostra de DNA adicionando 2 µ l a 98 µ l de 1 x buffer de ensaio TE (volume final de 100 µ l, diluição fator 01:50) em uma placa de 96 bem descartável. Esta etapa de diluição pode ser executada ou manualmente usando uma pipeta multicanal ou pelo líquido automatizado, manipulação de estação de trabalho.
  3. Preparar a escala de padrões diluindo o ADN do lambda (100 µ g/mL) fornecido no kit de ensaio de fluorescência (tabela 2) e incluem para medição juntamente com amostras.
  4. Adicione 100 µ l do corante fluorescente a 100 µ l diluído amostras de DNA e padrões para a reação. Incube durante 5 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
  5. Medir a fluorescência das amostras com base nas orientações do fabricante.
  6. Traçar a curva padrão utilizando as leituras de fluorescência e calcular a concentração original das amostras de DNA.
  7. Determine o volume de DNA e 10 mM de tampão Tris (pH 8) a ser adicionado para ajustar a concentração de DNA de 0,2 ng / µ l.
  8. Execute as diluições de DNA usando líquido automatizado, manipulação de estação de trabalho. Esta etapa pode ser também conseguida pipetagem manual.

5. preparação de biblioteca de DNA

Nota: Preparação de biblioteca e sequenciamento foi realizada seguindo as orientações fornecidas pela empresa (Figura 1A) e protocolos do fabricante (ver tabela de materiais).

  1. Tagmentation e PCR amplificação
    1. Rotule uma nova placa de parede fina rígida de 96 poços.
    2. Adicionar 5 µ l de DNA de entrada de quantificados em 0,2 ng / µ l (1 ng no total) para cada amostra bem da placa.
    3. Adicionar 10 µ l de tampão de tagmentation e 5 µ l de tampão de amplificação para cada bem contendo DNA e pipetar delicadamente para misturar. A placa do selo com um selo de placa adesiva.
    4. Coloque a placa em um termociclador e execute o seguinte programa PCR: 55 ° C por 5 min e segure a 10 ° C. Quando a amostra chega a 10 ° C, proceda imediatamente para neutralizar.
    5. Adicionar 5 µ l de tampão de neutralização para a placa para neutralizar a reação de amplicons, e pipetar suavemente a mistura. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
    6. Adicione 15 µ l de indexação PCR mastermix para as amostras.
    7. Use uma caixa de tubos de cartilha de índice disponíveis para uma configuração de formato da placa de 96 poços, para que cada amostra Obtém uma combinação única de índices com base em modelo de índice (tabela 3).
    8. Organizar os tubos de cartilha de índice na cremalheira de placa do índice (Figura 1B) usando a ordem fornecida no modelo na tabela 3 e gravar a posição dos índices no modelo.
    9. Coloque a placa de tagmentation com adicionado PCR mastermix sobre a cremalheira de placa do índice com os tubos de índice em ordem.
    10. Pôr tubos de cartilha 1 índice em arranjo vertical, índice primário 2 tubos e arranjo horizontal sobre o rack do índice. Usando uma pipeta multicanal, cuidadosamente Adicione 5 µ l de primers de índice para cada amostra.
    11. Substitua o velhas tampas dos tubos de índice com tampões novos para evitar contaminação cruzada entre os índices.
    12. Selar a placa usando aferidores de placa de 96 poços claros e executar a segunda PCR como segue: 95 ° C por 30 s, 12 ciclos de 95 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s e 72 ° C por 5 min.
  2. Limpeza do PCR
    1. Transferir o produto PCR para a limpeza do PCR, da placa de tagmentation para uma placa de fundo (ver tabela de materiais).
    2. Vórtice a solução comercial grânulos magnético (ver tabela de materiais) com base nas instruções do fabricante e adicionar 30 µ l de grânulos para cada produto do PCR da placa de fundo.
    3. Agitar a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente sem tremer por 5 min.
    4. Coloque a placa em um carrinho magnético por 2 min até que o sobrenadante se dissipou.
    5. Desprezar o sobrenadante cuidadosamente com a placa ainda no stand magnético.
    6. Adicione 200 µ l de etanol a 80% acabadas com a placa sobre o suporte magnético.
    7. Incubar a placa magnética depor por 30 s e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
    8. Repetir a etapa de lavagem e permitem que os grânulos secar ao ar por 15 min. remover excesso etanol, se for o caso.
    9. Retire a placa do suporte magnético e adicionar 52,5 µ l de tampão de ressuspensão de grânulos.
    10. Agitar a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente por 2 min sem tremer.
    11. Colocar a placa sobre o suporte magnético e permitir que o sobrenadante limpar.
    12. Usando uma pipeta multicanal, cuidadosamente transferi 50 µ l do sobrenadante da placa de limpeza para uma nova placa rígida.
  3. Normalização de biblioteca
    1. Descongele os reagentes de normalização de biblioteca de acordo com as orientações do fabricante (ver tabela de materiais).
    2. Transferi 20 µ l do sobrenadante da placa de limpeza para uma nova placa de fundo.
    3. Adicionar 45 µ l de suspensão magnética do grânulo e a placa com um aferidor de placa do selo.
    4. Agite a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 30 min. Este tempo de incubação é crítico e não deve ser excedido.
    5. Colocar a placa em um carrinho magnético por 2 min e confirmar que o sobrenadante liberou (Figura 1B).
    6. Remover e descartar o sobrenadante em um recipiente adequado de resíduos perigosos com a placa ainda no stand magnético.
    7. Retire a placa do suporte magnético e lave os grânulos com tampão de lavagem 45 µ l.
    8. Agite a placa com o tampão de lavagem num agitador microplacas a 1800 rpm por 5 min.
    9. Coloque a placa magnética depor por 2 min e descarte sobrenadante quando verifica-se clara.
    10. Retire a placa do suporte magnético e repetir a lavagem com tampão de lavagem.
    11. Retire a placa do suporte magnético e adicione 30 µ l de 0,1 N de NaOH.
    12. Agitar a placa com 0,1 N de NaOH num agitador microplacas a 1800 rpm por 5 min e coloque a placa sobre o carrinho magnético por 2 min ou até que o líquido é claro.
    13. Adicione 30 µ l de tampão de eluição para cada poço de uma nova placa de 96 poços rígida parede fina final biblioteca normalizado.
    14. Transferi 30 µ l do sobrenadante da placa de normalização para placa final biblioteca normalizado para fazer volume final 60 µ l. As bibliotecas são agora prontas a ser sequenciado.
  4. Determinação da concentração de biblioteca de DNA por qPCR
    1. Descongele o mastermix, iniciadores e padrões fornecidos no kit de qPCR de acordo com as orientações do fabricante (ver tabela de materiais).
    2. Combinar o PCR mastermix de reagente e primer fornecidos no kit de qPCR seguindo as instruções do fabricante e alíquotas podem ser armazenadas a-20 ° C.
    3. Para determinar a concentração de biblioteca de DNA, fazer uma diluição de 1/8000 das bibliotecas de DNA usando 10 mM de tampão Tris (pH 8) através da realização de uma diluição de 1: 100 (1,5 µ l DNA biblioteca para 148,5 tampão Tris de µ l) seguido por uma diluição de 1:80 (2 µ l de 1: 100 para 158 tampão Tris de µ l).
    4. Agitar a placa de diluição a 700 rpm pelo menos 1 min e em seguida centrifugar a 14000 × g por 1 min.
    5. Prepare 20 µ l de reação de PCR final misturando 4 µ l de biblioteca de DNA diluída ou padrões de DNA e 16 µ l de mastermix.
    6. Realizar a PCR, seguindo as configurações do fabricante em thermocycler: 95 ° C por 5 min, 35 ciclos de 95 ° C por 30 s e 60 ° C durante 45 s e final 65 ° C e 95 ° C, para análise de curva de derreter.
    7. Obter os valores de Ct das bibliotecas de DNA de amostra e padrões do thermocycler qPCR.
    8. Gera uma curva padrão de valor Ct dos padrões (Figura 2). Defina o intervalo superior e inferior do QC ± 3 ciclos da média. Por exemplo, se o valor de Ct médio é de 13 ciclos faixa QC é entre 10 e 16 ciclos.
    9. Determine as concentrações de biblioteca individual e média (ALC) da curva padrão e valores de Ct.
    10. Determine o volume de bibliotecas em pool totais (PAL) para ser usado com base no cálculo dado abaixo para sequenciamento final, Considerando que a concentração de biblioteca de destino é entre 1,4-13:08.
      Nota: Média de concentração de biblioteca Obtida de qPCR = ALC; Total de bibliotecas em pool (PAL) = ALC / 2; Desnaturado PAL (DAL) = PAL * 0.666
      Dependendo do volume do DAL misturada com buffer, é a concentração da biblioteca a ser adicionado para a célula de fluxo. Por exemplo, se 65 µ l de biblioteca é adicionado a 835 µ l de tampão, depois desta diluição (Dil 1) 195 é adicionado a um volume total de 1300 µ l: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = concentração Final (deve ser entre 1,4-13:08)

6. Biblioteca pool e iniciar sequenciamento em sequenciador Benchtop

  1. Cartucho de reagente de degelo de acordo com as orientações do fabricante. Tirar uma nova célula de fluxo da embalagem de armazenamento de 4 ° C e trazer a temperatura atleast 30 min antes de sequenciamento. Tirar o cartucho do amortecedor e sequenciamento prechill buffer antes do uso (ver tabela de materiais).
  2. Prepare uma biblioteca de controle pela mistura de 5 µ l de biblioteca (1 nM) e 5 µ l de 0,2 N de NaOH. Vórtice brevemente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar a biblioteca de controle em cadeias simples.
  3. Adicione 5 µ l de 200 mM Tris-HCl, pH 7 e vortex. Juntar 235 µ l de tampão de sequenciamento prechilled e misture delicadamente. O volume total é de 250 µ l, com concentração final de controle biblioteca em 20 pM.
  4. Bibliotecas de DNA de piscina através da transferência de 5 µ l de cada biblioteca de amostra a ser sequenciado da placa final biblioteca normalizado em um tubo único vincular baixa 1,5 mL.
  5. Adicione 30 µ l de biblioteca em pool e 30 µ l de 0,2 N NaOH para desnaturar as bibliotecas em outro tubo de ligação de baixa.
  6. Vórtice o bind-baixa do tubo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas em cadeias simples.
  7. Adicione 30 µ l de 200 mM Tris-HCl, pH 7 ao tubo com bibliotecas desnaturados para neutralizar a reação.
  8. Adicione 65 µ l de suspensão de bibliotecas desnaturado neutralizados e 835 µ l de tampão de sequenciamento pre-refrigerados e vórtice para misturar bem.
  9. Em um tubo de ligação baixa final combinar o seguinte: 195 µ l de bibliotecas desnaturadas neutralizadas, 1,30 µ l de biblioteca de controle e 1103.70 µ l de tampão de sequenciamento. Misture corretamente.
  10. Carrega a mistura final biblioteca (1300 µ l) para o local designado no cartucho de reagente.
  11. Set-up o sequenciamento execute inserindo detalhes do projeto e amostra no Sequencer designado site seguindo as diretrizes.
  12. Iniciar sequência seguindo orientações. Carregar a pilha de fluxo, reagente cartucho com bibliotecas e cartucho de reserva no sequencer de bancada.
  13. Gravar números de lote, de todos os kits de reagentes e cartuchos usados no sequenciamento.

7. dados baixar do site de sequenciamento

  1. Baixe arquivos FASTQ, seguindo as instruções do fabricante, fornecidas no site.
  2. Para uma boa qualidade, verificar que a percentagem de Q30 é ≥ 75% e cluster de densidade é entre 170-280 K/mm2 com ideal em 200-210 K/mm2 (tabela 4).

8. análise de dados de sequenciamento de

  1. Importar arquivos FASTQ de amostras sequenciadas no pacote de software integrado de análise de dados (consulte a tabela de materiais).
  2. Criar um fluxo de trabalho de sequenciamento em software, adicionando recursos de lista ou seja aparar, mapeamento de referência (referência selecione genoma), realinhamento local e análise variante (Figura 3A) usando as configurações listadas na tabela 5.
  3. Executar o fluxo de trabalho, selecionando uma única amostra ou um lote de amostra FASTQ arquivos e salvar arquivos de saída nas pastas exemplo designado.
  4. Gere relatório para profundidade de cobertura de sequência, regiões mapeadas e lista de variantes estruturais no genoma (Figura 3B).
  5. Use a lista de variantes estruturais para procurar polimorfismos não sinônimos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes que conferem resistência e virulência.
  6. Prepare o relatório listando SNP localização, gene e número de isolados resistentes ou suscetíveis (quadro 6).

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Resultados

Treze c. glabrata , compreendendo isolados de c. glabrata ATCC 90030 e 12 do laboratório de referência de micologia clínica (isola CMRL1 para CMRL12), Hospital Westmead, Sydney foram estudados (tabela 1). Estes incluíram três pares de isolados CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 obtidos antes e após a terapia antifúngica com sem ligações epidemiológicas entre eles 24 (tabela 1).

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Discussão

Este estudo determinou a viabilidade, cronogramas aproximadas e precisão de detecção WGS-interativa de resistência às drogas em c. glabrata. O tempo de retorno (TAT) para a preparação de biblioteca e sequenciamento foi quatro dias e emissão de relatórios de dias de a dois resultados analisados. Isso se compara pelo menos uma quantidade similar TAT para ensaios de suscetibilidade de placas de cultura e Sanger sequenciamento significativamente maior número de amostras. Ao redor 30-90 c. glabrata...

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Divulgações

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes e não há conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo centro de doenças infecciosas e Microbiologia, saúde pública. Os autores não receberam qualquer outro financiamento para este estudo. Os autores Obrigado Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann e Ranjeeta Menon para seus conselhos de especialistas e assistência com o experimento de sequenciamento do genoma inteiro.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

Referências

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  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
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