Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Resumo

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Resumo

Clusterizado regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) é um sistema de imunidade adaptativa em procariontes que tem sido reaproveitado pelos cientistas para gerar nucleases RNA-guiada, tais como CRISPR-associado (Cas) 9 para site-specific do genoma eucariótico edição. Engenharia de genoma por Cas9 é usada eficientemente, facilmente e robustamente modificar genes endógenos em muitas linhas de células de mamíferos biomedically relevantes e organismos. Aqui mostramos um exemplo de como utilizar a metodologia CRISPR/Cas9 para entender a função biológica de mutações genéticas específicas. Usamos modelos calreticulin (CALR) mutações em murino interleucina-3 (3 mIL) dependentes pro-B (Ba/F3) células pela entrega de RNAs de guia única (sgRNAs) visando o locus Calr endógeno na região específica onde inserção e/ou exclusão (indel ) CALR mutações ocorrem em pacientes com Neoplasias mieloproliferativas (MPN), um tipo de câncer de sangue. Os sgRNAs criar quebras da cadeia dupla (DSBs) na região alvo que são reparadas por fim não-homóloga ingressar (NHEJ) para dar puntuais de vários tamanhos. Então, nós empregamos o ensaio de transformação celular Ba/F3 padrão para entender o efeito da expressão de nível fisiológico de Calr mutações na transformação celular hematopoiética. Esta abordagem pode ser aplicada a outros genes para estudar sua função biológica em várias linhas de células de mamíferos.

Introdução

CRISPR/Cas9 tecnologia recentemente revolucionou o genoma alvo edição nos organismos e células vivas. Tornou-se uma ferramenta extremamente poderosa para a investigação biomédica e atualmente está sendo utilizado como uma avenida de potencial para a terapia de doenças genéticas¹. A base para todas as ferramentas de edição de genoma baseia-se na criação de uma induzida por nuclease DNA encalhada interrupção dupla (DSB) no locus genômico a ser modificado. Os DSBs podem ser reparados pelo não-homóloga final-adesão (NHEJ) ou reparação de homologia-dirigido (HDR)^2,3. A vantagem da nuclease Cas9 sobre outro genoma engenharia nucleases, tais como as nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) é sua dependência de RNA para o direcionamento da nuclease para uma sequência de DNA desejada, em comparação para as interações proteína-ADN encontradas em ZFNs e TALENs^2,3.

Após a descoberta da via de nuclease CRISPR/Cas9 como um sistema imune adaptativo em células procarióticas^4,5, muito esforço tem ido para adaptar o caminho para o uso em linhas de células de mamíferos e de organismos modelo^{2, 3}. como uma ferramenta para edição de gene, via CRISPR/Cas9 utiliza dois componentes principais: o Streptococcus pyogenes (Sp) derivado Cas9 nuclease e sgRNAs como alvo o gene de interesse,^2,3. O sgRNA consiste de 20 nucleotídeos que Cas9 direto para um site específico sobre o genoma através de pares de base de RNA-DNA a complementaridade^2,3. O site de destino do sgRNA devera ser adjacente a um site de motivo adjacentes (PAM) protospacer sob a forma de 5' NGG, que é reconhecido pela nuclease SpCas9. Com estas ferramentas, Cas9 pode ser direcionado para qualquer sequência de DNA através da concepção de sgRNAs destino a região de interesse. Além da Sp derivada Cas9, existem variantes adicionais para Cas9 com características diferentes, dependendo da aplicação específica. Por exemplo, existem variantes de Cas9 com maior especificidade para edição no alvo ou capacidade de clivagem de single-strand DNA roubando^6,7. Além disso, recentemente foi desenvolvido Cas9 cataliticamente inactiva por regulamento transcriptional⁸. Cientistas agora têm usado o sistema CRISPR/Cas9 para uma variedade de aplicações, tais como gene batendo e nocaute para estudar as funções biológicas de genes⁹, da função de perda e ganho-de-função biblioteca telas¹⁰ e genética Engenharia de organismos modelo¹¹.

Neste protocolo, aliamos a metodologia CRISPR/Cas9 com o ensaio de transformação celular Ba/F3 para entender a função biológica do CALR mutações. BA/F3 células são uma linha de células hematopoiéticas dependentes murino IL-3 que pode ser processada IL-3 independente sobre expressão de determinados oncogenes, como BCR-ABL¹². A fim de compreender se calreticulin mutante pode transformar células Ba/F3 para crescimento independente de citocina, nós alvo exon 9 do locus endógeno de Calr usando CRISPR/Cas9 para introduzir mutações indel e então IL-3 retirou as células para aplicar um pressão de seleção positiva, com o objetivo de recapitulando mutações de ganho-de-função CALR encontradas em pacientes do MPN. O protocolo inclui o projeto, a clonagem e a entrega de sgRNAs, o desenvolvimento de células expressando de estável Cas9 e triagem para CRISPR gene edição no alvo. Este protocolo pode ser aplicado a diferentes genes e várias linhas de célula dependente de citocinas de interesse e é especialmente valioso em modelagem e estudar a função biológica de genes envolvidos no câncer.

Protocolo

1. sgRNA projeto usando ferramentas on-line¹³

1. Projeto sgRNAs como alvo o gene de interesse usando ferramentas disponíveis gratuitamente on-line.
   1. Copie e cole a sequência de referência NCBI do gene de interesse para a ferramenta de web designer do Broad Institute sgRNA: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Nota: Esta ferramenta identifica sequências sgRNA com sítios de clivagem dentro exões e aqueles que abrangem a fronteira intron/exon mas ainda cleave dentro o exon.
   2. Download e abrir o arquivo de saída de texto no excel.
   3. Concentre-se nas colunas preenchidas com as sequências de sgRNA e as sequências de contexto sgRNA. Observe que as sequências de sgRNA não contêm o motivo de protospacer adjacentes (PAM), mas fazer as sequências de contexto.
   4. Observe que o resultado de eficácia no alvo listas o escore de eficiência clivagem previsto numa escala de 0 a 1, onde uma pontuação de 1 denota uma maior eficiência de clivagem.
   5. Uso a função de 'tipo' do excel também encomendar os alvos com o placar de eficácia ou pela localização dentro do gene do alvo através da coluna '% corte de destino'.
      Nota: Classificação por localização dentro do gene é útil para identificar sgRNAs que se destinam a um exão de interesse ou domínio específico.
   6. Selecione sgRNAs de 3-6 que se destinam a área de interesse com alta (> 0,6) golo de eficácia no alvo. Pode ser útil saber quais os tipos de mutações podem ser responsáveis para o fenótipo que é desejado (por favor consulte a Figura 1 explicando a estratégia de segmentação utilizada para calreticulin).
      Nota: sgRNAs abaixo do limiar de Pontuação sugerida 0,6 eficácia deve ser considerada quando existe uma falta de outros bons candidatos.
   7. Use a ferramenta de web análise de gRNA MIT a tela para fora do alvo os efeitos potenciais (http://crispr.mit.edu/). Para cada sgRNA selecionado, execute a sequência de destino (incluindo o PAM).
      Nota: A ferramenta de web designer do Broad Institute sgRNA também pode ser usada para a tela para fora do alvo efeitos (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Observe que a ferramenta de análise de sgRNA MIT pontua cada sgRNA em uma escala de 1-100 onde uma pontuação de 100 denota maior especificidade. Uma nota superior a 70 é ideal e representa um sgRNA com mínimos efeitos fora do alvo. Este site também gera uma lista de hits fora do alvo com sua localização dentro do genoma e quantos mismatches cada um deles tem com o guia do candidato.
         Nota: Sucessos fora do alvo com incompatibilidades de quatro ou mais são considerados seguros¹⁴. O alvo hits com incompatibilidades de menos de quatro podem ser problemáticos se eles caem dentro exões¹⁴.
   8. Escolha sgRNAs de 2-3 que visem locais distintos dentro da região de interesse para o gene alvo, e que têm as maiores pontuações de eficiência e o alvo de clivagem emparelhados (ver tabela 1 para sgRNA sequências alvo exon 9 de Calr).
      Nota: Dependendo das metas experimentais, maior ênfase pode ser colocada sobre os diferentes valores obtidos a partir das ferramentas mencionadas.

2. clonagem de Oligos sgRNA¹³

1. Gerar o oligo frente
   1. Crie uma lista de sequências de sgRNA sem o site de PAM.
   2. Adicionar um G à extremidade 5' da sequência se a extremidade 5' da sequência de sgRNA não é um G.
      Nota: Este G é necessário para maximizar o nível de transcrição sgRNA U6-conduzido. Adição de um G é necessária para sgRNA m1 (tabela 1).
   3. Adicionar a sequência "CACC" à extremidade 5' da sequência guia G-otimizado (sem PAM) (tabela 2), a fim de gerar as saliências necessárias para ligadura dos oligos recozidos em BsmBI digerido lentiGuide vetor (ver passo 3).
2. Gerar o oligo reverso
   1. Reversa complementar a sequência guia G-otimizado (sem PAM).
   2. Adicione a sequência "AAAC" à extremidade 5' da sequência inversa complementado guia G-otimizado (tabela 2).
   3. Ordem do oligos projetado de uma companhia de síntese da primeira demão.
3. Recoze e fosforilar oligos
   1. Adicionar 1 µ l de frente oligo (100 µM), 1 µ l de oligo reverso (100 µM), 1 µ l de T4 ligadura de 10x buffer, 0,5 µ l da quinase de polinucleotido T4 (PNK) e 6,5 µ l de H₂O para um tubo PCR (Total = 10 µ l).
   2. Execute o programa a seguir na thermocycler: 37 ˚ c por 30 min, 95 ˚ c por 5 min, rampa de 95 a 25 a 0.1 ° C/s.
   3. Diluir o produto de reação em 1: 250 em H₂O.

3. digestão de lentiGuide-Puro vetor¹³

1. Vetor de lentiGuide-Puro Digest
   1. Montar uma reação de digestão de 50 µ l com os seguintes componentes: 5 µ g de plasmídeo circular, 2 µ l (30 unidades) da enzima de restrição BsmBI, 5 µ l de tampão de enzima de restrição e até 50 µ l de H₂O.
   2. Executar a reação para h 2 a 55 ° C. Após a primeira hora, adicione mais 1 μL de enzima de restrição BsmBI.
2. Dephosphorylate a espinha dorsal corte
   1. Adicione 7 µ l de tampão de reação da fosfatase e 2 µ l da enzima fosfatase para o vetor digerido.
   2. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
3. PCR purify o corte e a espinha dorsal dephosphorylated usando um kit comercial.
   Nota: Substituto as colunas coloridas rosa fornecidas com o kit miniprep azul colunas coloridas desde que estas melhor podem acomodar tamanhos grandes do plasmídeo. O rendimento pode ser aumentado aquecendo o tampão de eluição em um bloco de calor de 90 ˚ c antes da eluição e por eluição do DNA da coluna duas vezes no final (executar o DNA eluted da primeira eluição volta através de uma segunda vez).

4. ligadura ofAnnealed Oligos em Backbone digerido¹³

1. Adicionar 50 ng do backbone digerido, 1 µ l de recozido oligo diluição, 1 µ l de T4 ligadura de 10x buffer, 1 µ l de T4 ligase e até 10 µ l de H₂O para um tubo PCR. Incubar durante 1 h em temperatura ambiente
2. Transforme células de Stbl3 com 2 µ l de reação da ligadura. Placa em uma placa de ágar de caldo (LB) lisogenia com ampicilina 100 de µ g/mL e incubar durante uma noite a 37 ° C.
3. Escolha 3 colônias e inocular em uma cultura de mini-preparação.
4. Validar a inserção correta oligo
   1. Execute um miniprep para cada cultura e sequência através do local de inserção do oligo a partir de um primer no promotor U6 usando um kit comercial.
   2. Execute um midi-prep ou uma maxipreparação da cultura sequência verificada.

5. geração de linhas de célula estàvel expressando SpCas9

Nota: Este protocolo envolve a entrega de pLX_TRC311-Cas9 plasmídeo por infecção Lentivirus. Este protocolo é descrito em detalhes para murino interleucina-3 (3 mIL) dependentes pro-B (Ba/F3) células, uma linhagem de células de suspensão e pode ser adaptado para outros tipos de célula usando as condições de cultura preferencial para cada tipo de célula. O meio de cultura para células F3/Ba consiste em RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina/L-glutamina e 10 ng/mL de murino interleucina 3.

1. Transfect células HEK-293T
   1. Sementes de 3 x 10⁶ HEK-293T células por placa de cultura de tecido de 10 cm. Manter células semeadas durante a noite antes do transfection.
      Nota: As células HEK-293T são uma linhagem de células aderentes e são rotineiramente utilizadas para a produção de vírus. As células são mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina/L-glutamina. Células devem ser 80% confluente ao tempo do transfection.
   2. Pré-aquecimento reduzido soro media (Opti-MEM) e meio de crescimento.
   3. Adicionar 500 µ l de mídia soro reduzida, 7 µ g de pLX_TRC311-Cas9 construção, 4 µ g de shRNA particulas de Lentivirus embalagens pCMV-VSV-G e 4 µ g de plasmídeo de Lentivirus de empacotamento de psPAX2 a um tubo
      Nota: O DNA Total por prato de 10cm de células 293T é 15 µ g.
   4. Misture o DNA bem e adicionar 45 µ l de reagente de transfeccao. Misture delicadamente e deixe por 20 min.
      Nota: É importante usar mídia de soro reduzida porque o soro vai inibir a formação de complexa entre o reagente de transfeccao e plasmídeo.
   5. Aspire o meio velho na placa 293T e adicionar 5 mL de meio de crescimento novo.
   6. Adicione a mistura de reagente DNA e transfecção de forma sábia de soltar a placa 293T. Agitar suavemente o frasco e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ por 24 h.
   7. Colheita sobrenadantes virais em 24 e 48 h post do transfection. Passe por um 0,22 µm filtro e alíquota em um tubo de cryovial (1,6 mL/tubo e 1,5 mL vai ser usado para infecção).
   8. Loja de sobrenadante viral a-80 ° C.
      Nota: Lentivirus sobrenadante pode ser usado dentro de 6 meses. Se possível, transductions de spinfection devem ser realizadas com vírus fresco).
2. Particulas de Lentivirus infecção das células F3/Ba
   1. Descongele o sobrenadante viral no gelo, se congelado.
   2. Centrifugar as células em 300 x g, durante 4 min.
   3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma concentração de 3 x 10⁶ células/mL.
   4. Adicionar 500 µ l de células ressuspensa, 1,5 mL de sobrenadante viral, 4 µ l de polybrene (estoque: 2 mg/mL) e 10 ng/mL de m-IL3 em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Certifique-se de incluir um não infectados com 1,5 mL de mídia em vez de sobrenadante viral como um controle.
      Nota: A quantidade de sobrenadante viral adicionado deve corresponder a uma multiplicidade de infecção (MOI) < 1.
   5. Centrifugue a placa a 440 x g para 120 min a 37 ° C.
   6. Levar o prato fora o centrifugador e coloque em 37 ° C e 5% CO₂ incubadora e permitir a crescer durante a noite.
   7. Gire para baixo as células após 24 h e ressuspender com 5 mL de mídia quente fresca em uma placa de 6.
3. Seleção de células Cas9 infectado
   1. Gire para baixo as células e ressuspender com fresca mídia quente suplementada com 5 µ g/mL de blasticidin, 48 h post spinfection.
   2. Selecione as células por 9 dias com blasticidin ou até células não infectadas controle (negativo) estão mortas.
   3. Uma vez concluída a seleção, transferi as células resistentes ao meio com menor concentração de blasticidin.

6. repórter ensaio para Cas9 atividade¹⁵

1. Transduce células parentais e celulas que expressam estàvel Cas9 com pXPR-011 por infecção Lentivirus (ver etapas 5.1-5.2).
   Nota: Este vetor contém GFP e um guia direcionamento de GFP. Células contendo Cas9 ativo irão resultar em uma redução de GFP (Figura 2).
2. Selecione as células para 3 dias com 2 µ g/mL de puromicina, 48 h post spinfection.
3. Analise as amostras para expressão de GFP por citometria de fluxo.
   Nota: Redução de 50% ou mais GFP representa ideal Cas9 atividade. Uma maior concentração de blasticidin seleção poderia ser usada para aumentar a atividade Cas9 se menos do que uma redução de 50% é observada. Nem todas as linhagens celulares podem tolerar blasticidin seleção. Neste caso, o uso de vetores Cas9 com outras fitas de seleção pode ser necessário. Além disso, nem todas as linhagens celulares podem tolerar a expressao de Cas9. Neste caso, transfection transiente de Cas9 pode ser usado.

7. Spinfection de sgRNAs em células expressando-Cas9

1. Siga os passos 5.1-5.2 para infecção Lentivirus de sgRNAs em células de interesse.
   Nota: No passo 5.1.3, substitua pLX_TRC311-Cas9 construção construção de lentiGuide-Puro validada da seção 4.
2. 48 h post spinfection, selecione as células para 3 dias com 2 µ g/mL de puromicina.
3. Transferir as células resistentes ao meio com menor concentração de antibiótico e continuar a seleção por mais 4 dias permitir a edição suficientes.

8. Ba/F3 transformação celular e selecção positiva usando m-IL3 retirada

Nota: Este ensaio é descrito para as células dependentes de mIL-3 Ba/F3, mas poderia ser aplicado a qualquer linha de célula dependente de citocinas.

1. Spin para baixo crescimento exponencial Ba/F3 células expressando ectopically Cas9 e o sgRNA de interesse.
2. Aspire o sobrenadante e lavar as células com 5 mL de fosfato tamponado salino (PBS).
3. Gire para baixo as células e repetir a etapa de lavagem em 8.2 quatro vezes (esta etapa garante que a mídia está livre de IL-3).
4. Aspirar a PBS e ressuspender as células em 5 mL de meio fresco sem IL-3.
5. Conte as células usando um hemocytometer ou um analisador de viabilidade celular.
6. As células em triplicado em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em uma concentração de 1 x 10⁵ células/mL em um volume total de 2 mL de meio fresco sem IL-3 de sementes.
7. Monitorar e contar as células para um total de 8 dias a cada 2 dias.
   Nota: Células de Ba/F3 falta IL-3 normalmente morrem 2 dias post fome IL-3. É importante incluir um controle negativo no ensaio (tipicamente um direcionamento-guia é usado como um controle).

9. triagem para CRISPR no alvo edição

1. Projeto CRISPR triagem primeiras demão a montante e a jusante do local de clivagem da sgRNA
   Nota: use primers pelo menos 100 bp do site clivagem previsto para assegurar a deteção não iria ser impactada por uma grande inserção e/ou exclusão (indel) no local de destino de sgRNA.
2. Isole o DNA genômico (gDNA) de células transformadas (no final da curva de crescimento) e da retirada de células pre-citocinas.
   Nota: Sempre incluem células superexpressão o guia não-alvo como um controle de edição de gene. Antes e depois transformação irá identificar clones que foram selecionadas positivamente para e ter uma vantagem proliferativa, isolando gDNA de células.
3. Montar um 50 µ l do PCR com os seguintes componentes: 25 µ l de mistura de x PCR 2 de 1 µ l de cartilha para a frente (10 µM), 1 µ l de primer reverso (10 µM), 50-100 ng de gDNA e H₂O até 50 µ l.
   Nota: Numerosos polimerases de alta-fidelidade podem ser usadas no passo 9.3.
4. Executar amostras em um thermocycler usando os seguintes parâmetros: 95° C por 1 min, 30 ciclos de (94 ° C por 1 min, 52 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) e 72 ° C por 10 min. Este PCR é otimizado para as primeiras demão Calr listadas na tabela 3. Otimize as condições PCR para o par de primer desenhado na etapa 9.1 baseado em testá-lo em gDNA.
5. Execute 5 µ l das amostras em um gel de agarose 2% a 10 V/cm usando 1 tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) de x. Examinar as amostras para a presença / ausência de uma banda amplificada correspondente em tamanho para o gene de interesse.
6. Use o resto da reação de PCR (45 µ l) para realizar uma purificação de PCR.
7. Clone o amplicons com um PCR kit de clonagem em um vetor do plasmídeo. Por exemplo, vetores pGEM T-easy são normalmente utilizados.
8. Transforme o plasmídeo em células Stbl3 ou outras células compatíveis e placa em placas de ágar LB com o antibiótico relevante. Selecionar colônias de 10-20, mini-preparação cada um e submeter cada clone a Sanger sequenciamento para caracterizar o puntuais criado a partir de CRISPR/Cas9 edição.
   Nota: Se desejar, única célula célula de fluorescência ativada que classificação (FACS) pode ser executada na maior edição população para isolar um clone com uma específica indel. Além disso, a próxima geração (NGS) métodos de sequenciamento pode ser usada para quantificar mais robustamente no alvo de edição usando o sequenciamento profundo de PCR amplicons, abrangendo a região de destino sgRNA. Por exemplo, rastreamento de puntuais por decomposição ou maré pode ser usado em vez de subcloning para determinar precisamente o espectro e a frequência de mutações específicas geradas em um pool de células (https://tide.nki.nl/#about)¹⁶.

Resultados

Usando o método descrito aqui, o objetivo deste experimento é estudar os efeitos funcionais da introduzir mutações indel para o locus Calr endógena na transformação de células hematopoiéticas. O sistema CRISPR/Cas9 é usado como uma ferramenta para criar endógena Calr mutações em células F3/Ba. Dois sgRNAs foram escolhidos para alvo exon 9 de Calr (Figura 1), na região onde inserções e/ou mutações de exclusão (ind...

Discussão

Aqui vamos mostrar o uso de gene de CRISPR/Cas9 edição para estudar a função biológica de CALR mutações em células hematopoiéticas. O sucesso do presente protocolo é altamente dependente de múltiplos fatores. Em primeiro lugar, é importante saber quais os tipos de mutações podem ser responsáveis para o fenótipo desejado. Neste protocolo, a leitura é a transformação de células Ba/F3 para mIL-3 independência e os tipos de mutações são puntuais no exon 9 de CALR. No entanto, se a mu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsmBI	New England Biolabs	R0580L
Blasticidin	Sigma Aldrich	15025
Puromycin	Life Technologies	A1113803
Stbl3 cells	Life Technologies	C737303
TransIT-LT1	Thermo Fisher Scientific	MIR2300
Opti-MEM	Life Technologies	51985034
RPMI	Thermo Fisher Scientific	MT10040CV
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Omega Scientific	FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Life Technologies	10378016
mIL-3	Peprotech	213-13
psPAX2	Addgene	N/A
pCMV-VSV-G	Addgene	N/A
pLX_TRC311-Cas9	Addgene	N/A
polybrene	Sigma Aldrich	H9268
pXPR-011	Addgene	N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Genessee Scientific	25-507
TAE buffer	Thermo Fisher Scientific	FERB49
LentiGuide-Puro	Addgene	Plasmid #52963
PNK	New England Biolabs	M0201S
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104