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Resumo

Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

Resumo

Engenharia de superfície celular pode proteger implantado as células de ataque imune do hospedeiro. Ela também pode remodelar a paisagem celular para melhorar a função do enxerto e pós-transplante de sobrevivência. Este protocolo pretende atingir a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula ultrafinos starPEG heparina-incorporada (Hep-PEG). Para gerar a nanocápsula Hep-PEG para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas, succinato de grufo de heparina (heparina-NHS) foi sintetizado pela primeira vez modificação dos seus grupos carboxilato usando N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etil carbodiimida cloridrato de (EDC) e N- Hidroxisuccinimida (NHS). A mistura de Hep-PEG formou-se então por reticulação do starPEG de oito-armados de final-acrescida de amino (starPEG-(NH2)8) e heparina-NHS. Para o revestimento de superfície ilhéu, ilhotas de rato foram isoladas através de digestão de colagenase e purificação gradiente usando Histopaque. Ilhotas isoladas, em seguida, foram tratadas com solução fria de Hep-PEG gelo durante 10 minutos permitir a ligação covalente entre o SNS e os grupos amina da membrana celular de ilhéu. Nanocápsula com o Hep-PEG incorre mínima alteração do tamanho do Ilhéu e volume e heparinização dos ilhéus com Hep-PEG podem também reduzir instantânea reação inflamatória mediada por sangue durante o transplante de ilhotas. Esta abordagem "fácil-para-adotar" é ameno o suficiente para a engenharia de superfície de células vivas sem comprometer a viabilidade celular. Considerando que a heparina demonstrou afinidade de ligação para várias citocinas, a nanocápsula Hep-PEG também fornece uma plataforma aberta que permite a incorporação de mediadores biológicos funcionais ilimitados e superfícies multi-camadas para viver superfície celular bioengenharia.

Introdução

O efeito terapêutico de terapias baseadas em células é limitado pela célula baixa retenção e sobrevivência pobre1,2. A fim de melhorar o resultado das terapias celulares, celular engenharia de superfície através de manipulação enzimática, conjugação de peptídeo, opaco química e físico encapsulamento com biomateriais tem sido explorado3,4, 5,6,7,8,9,10. O protocolo atual pretende atingir engenharia de superfície das células vivas, usando um método de "fácil-para-adotar" aplicando uma nanocápsula ultrafinos heparina-incorporada starPEG (heparina-PEG) à superfície da célula. Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas foi apresentada aqui como um exemplo devido a heterogeneidade das ilhotas de Langerhans e os resultados depreciativos da transplantação de ilhéu clínica atual.

Com efeito, ilhéu clínica transplante é atualmente realizado por injecção directa de ilhotas isoladas para a veia porta hepática e este procedimento só está disponível para pacientes seletivos por causa da escassez de materiais do doador e baixa eficácia terapêutica 11. convencionalmente, alginato tem sido o biomaterial mais comumente usado para o encapsulamento de ilhéu e modificação da superfície, embora seja menos que o ideal devido à instabilidade química do alginato e fibrose inflamatória relacionados12, 13. Além disso, em comparação com o tamanho natural de Ilhéus que varia entre 100 a 200 µm, as microcápsulas de alginato-ilhéu são maiores, variando entre 400 e 800 µm, que excedam a distância de difusão fisiológica de oxigênio. Encapsulamento de conformal ilhéu, ou seja., encapsulando ilhotas sem alteração significativa do volume de ilhota, foi então desenvolvido. Assim, a deposição de nanomembranes composto de PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicone ou nanocápsula multi-camadas (também conhecido como a técnica de "camada por camada" [LBL]) tem sido relatada, resultando em sobrevivência melhorada em vitro ilhéu14 ,15,16,17,18, embora a LBL abordagem muitas vezes requer ilhotas extensas período entregando para deposição de várias camadas, o que pode comprometer a viabilidade do Ilhéu . Além disso, a instabilidade do nanomembranes que se baseia em eletrostáticas ou covalentes interações entre camadas biomembrane ou interações hidrofóbicas entre nanomembranes e a superfície da ilha também gera preocupações9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.

Outro fator limitante que dificulta o resultado terapêutico do transplante de ilhotas intraportal é a instant mediada por sangue reação inflamatória (IBMIR) causada por contato direto de ilhotas implantados com sangue, resultando em agregação plaquetária, coagulação e efeito adverso imune ou ativação celular indesejadas9. Para resolver esses problemas, uma nanocápsula ultra fina composta de glicol de polietileno em forma de estrela (starPEG) foi preparada pela sua biocompatibilidade estabelecida e versatilidade como ilhéu material da carcaça. Heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatada, também foi incorporada na nanocápsula starPEG por suas propriedades anti-inflamatórias, anticoagulantes e capacidade de facilitar a vascularização através do recrutamento de fatores de crescimento angiogênico pro22, 23.

Protocolo

1. fabricação de heparina-incorporada Starpeg nanocápsula

  1. Síntese de succinato de grufo de heparina (heparina-NHS)
    1. Pesar 0,69 g de heparina e dissolver em 2,0 mL de água destilada gelada.
    2. Pesar 0,23 g de NHS e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.
    3. Pesar 0,77 g de EDC e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.
    4. Misture as soluções NHS e EDC num balão de fundo redondo. Deixe a solução mista no banco na temperatura ambiente por 30 min à temperatura ambiente.
    5. Centrifugue a mistura de EDC NHS no 5.031 x g durante 10 minutos remover o excesso de EDC e NHS.
    6. Adicione 30 mL de álcool etílico frio para a mistura solução e centrifugar 5.031 x g por 10 min.
      1. Repita duas vezes.
  2. Preparação de nanocápsula starPEG-heparina
    1. Adicione 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 para um balão de fundo redondo.
    2. Adicione 0,67 mL de heparina de 10% (p/v)-NHS no mesmo balão de fundo redondo.
    3. Coloque a solução mista de starPEG-(NH2)8 e heparina-NHS na incubadora a 25 ° C por 20 min obter uma solução clara com viscosidade.
      Nota: Para experimentos em que se exigia fluorescente etiquetada heparina (FAM-heparina), o processo de fabricação é o mesmo exceto que a estrela de (NH2) - PEG -8 foi dissolvido em água desionizada, suplementada com 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidil éster 0.1% (razão molar) de starPEG-(NH2)8. )
  3. Caracterização de heparina-PEG nanocápsula por Fourier Transform espectroscopia no infravermelho (FT-IR)
    1. Antes de começar, lave o dispositivo de almofariz, pilão e granulação de ágata (pequenos discos com diâmetro de 13 mm) com acetona e água deionizada. Seque o vidro em um forno antes do uso.
    2. Amostra de heparina-PEG Mix aproximadamente 0,1 – 1% com 200 – 250 mg de pó fino de KBr.
    3. Coloque a mistura de KBr e heparina-PEG o almofariz de ágata e pulverizar finamente em pequenas pelotas com diâmetros de 2 µm.
    4. Transfira a mistura para um dispositivo de granulação. Aplica força de compressão elevada (8 T/cm2) em um vácuo por 1 – 2 min formar pelotas transparentes.
    5. Puxe gentilmente as pelotas de amostra longe o dispositivo de granulação. Tenha cuidado para não puxar demais para não se incorrer em rachaduras.
    6. Transferi as pelotas de amostra com muito cuidado para um Fourier Transform Infrared espectroscópio para determinar a estrutura química de amostra.
  4. Exame das estruturas internas porosas de heparina-PEG nanocápsula por microscopia eletrônica de varredura (SEM)
    1. Para os procedimentos a seguir, prepare-se pipetas e placa de cultura de células de 48-bem padrão.
    2. Pipete a solução de copolímero de heparina-PEG para os poços de uma placa de cultura de 48-bem.
    3. Congele a placa a-80 ° C por 24 h.
    4. Lypophilize as amostras a-50 ° C, em ambiente de vácuo (0,1 Pa) por 24 h.
    5. Espalhe as amostras através da superfície pegajosa de um esboço de alumínio.
    6. Revestir as amostras com ouro e observar sob o microscópio de elétron digitalizado para observar estruturas porosas internas.
  5. Exame da superfície de nanocápsula de heparina-PEG por microscopia de força atômica (AFM)
    1. Limpar as lâminas de vidro de sílica com solução de piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C por 40 min.
    2. Proceda à sonicação os slides em metanol por 10min e depois em tolueno por 10 min.
    3. Seca as lâminas por secagem a vácuo.
    4. Lave os slides com abundância solução 3-aminopropil-triethoxysilane (2% em tolueno), agite.
    5. Proceda à sonicação os slides em metanol por 10 min depois em tolueno por 10 min.
    6. Lugar de 100 µ l de solução de heparina-PEG 3% em toda a superfície dos slides usando uma pipeta padrão.
    7. Examinar a superfície de heparina-PEG sob um microscópio de força atômica (uma frequência ressonante de 50 a 80 kHz, força constante de 0.350 N m 21, raio de ponta de 600 nm).

2. Mouse ilhéu engenharia de superfície com heparina-PEG nanocápsula

  1. Revestimento de superfície do mouse ilhéu com heparina-PEG nanocápsula
    1. Extrato de ilhotas do mouse pelo colagenase digestão e histopaque gradiente purificação como anteriormente relatada em JoVE19.
    2. Escolher 200 ilhotas sob um microscópio de dissecação de um tubo de 1,5 mL.
    3. Adicione 500 µ l de PBS para os ilhéus e centrifugar 503 x g por 1 min.
    4. Tire o sobrenadante e adicionar 250 µ l da solução de heparina-PEG e manter a mistura no gelo durante 10 min. pipeta acima e para baixo para permitir que os ilhéus misturar bem com a solução de heparina-PEG.
    5. Centrifugar 503 x g por 1 min.
    6. Remover o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.
    7. Centrifugar a 503 x g por 1 min e remover o sobrenadante e manter os ilhéus para utilização posterior. Para exame de ilhotas do mouse revestido com heparina-PEG, FAM-heparina-PEG foi usado para o revestimento de ilhéu seguindo estas etapas.
  2. Exame das ilhotas do mouse revestido com a nanocápsula FAM-heparina-PEG
    1. Adicionar 1 a 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal para os ilhéus revestidos e transferir estas ilhotas em um prato de cultura bacteriana estéril não carregada.
    2. Observe os sinais de FAM-heparina-PEG revestido nanocápsula Ilhéus sob um microscópio de fluorescência invertido morfologia e fluorescência.

3. função de heparina-PEG revestido Mouse ilhotas comparadas com ilhotas não revestidos

  1. Viabilidade de heparina-PEG revestido ilhotas de rato
    1. Escolher a 20 dos ilhéus rato heparina-PEG revestido e colocá-los em um poço de uma placa de cultura de células 96 poços.
    2. Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de rato de heparina-PEG revestido para cada poço.
    3. Escolher 20 das ilhotas de noncoated controle e colocá-los em um poço da placa de cultura de células 96 poços mesmo.
    4. Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de noncoated de controle para cada poço.
    5. Colocar 200 µ l de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino em cada poço da placa de 96 poços que contém ilhotas e manter em cultura, durante 14 dias.
    6. Substitua o ilhéu de meios de cultura em 2 dias.
    7. Trate os ilhéus com um vivo/morto kit de coloração no final de 14 dias em cultura e observada sob um microscópio de fluorescência invertido.
    8. Contar células de PI+ (vermelho) dentro de cada ilhota debaixo de um microscópio de fluorescência invertido.
  2. Revascularização de heparina-PEG revestido de ilhotas de rato em vitro
    1. Pré-fixe todos os plásticos experimentais incluindo placa de cultura e pontas da pipeta pelo menos 12 h antes da utilização.
    2. Coloque um lugar 24-bem uma ventoinha. Adicionar 250 µ l de gelo frio Matrigel reduzida de fator de crescimento em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Coloque a placa de 24 poços revestida a 4 ° C, durante pelo menos 30 min.
    3. Enquanto a solução de matriz é pôr na geladeira, trypsinize rato ilhota pancreatic milha Sven 1 (MS1) células endoteliais.
      1. Remova o frasco de cultura de tecidos, todos os meios de cultura. Lave o balão com 5 mL de PBS.
      2. Remover a PBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Incube a 37 ° C por 3 min em uma incubadora padrão.
      3. Bata levemente o fundo do frasco para separar as células e adicionar 5 mL de soro-completada a mídia.
    4. Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.
    5. Tire o sobrenadante e adicionar 5 mL de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.
    6. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
    7. Adicionar mídia DMEM soro-completados no tubo e semear 50.000 células em cada poço da placa de 24 poços matriz-solução-revestido.
    8. Adicione 5 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de noncoated de controle para cada poço.
    9. Adicione mídia DMEM soro-completada em cada poço para um total de 500 µ l por bem.
    10. Observe a formação do tubo após 4h e 24 h de incubação sob um microscópio de luz.
  3. Secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas de heparina-PEG revestido
    Nota: Para avaliar se a nanocápsula afetaria a função das ilhotas de rato, foi avaliada a secreção de insulina glicose-estimulada de heparina-PEG revestido e ilhotas de noncoated.
    1. Escolher 30 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de controle noncoated em um tubo de 1,5 mL. Prepare um total de 10 tubos para revestido ilhotas e Ilhéus noncoated cada.
    2. Adicionar 1 mL de solução salina fisiológica, suplementada com 2 mmol/L glicose20 e incubar a 37 ° C por 2 h.
      Nota: Para a receita da solução salina fisiológica, por favor consulte a tabela 1. Mantenha a tampa dos tubos soltos durante a incubação na incubadora.
    3. Remova a solução tanto quanto possível.
    4. Estimula a Ilhéus, adicionando 600 µ l de solução salina fisiológica suplementado com 20 glicose mmol/L a 37 ° C por 30 min.
    5. Colete 200 µ l do sobrenadante de cada tubo para quantificação de ELISA usando uma insulina comercial ELISA kit de insulina.

Resultados

A nanocápsula de heparina-PEG foi sintetizada pela conjugação de starPEG-(NH2)8 e heparina usando EDC e NHS como acoplamento agentes (Figura 1). Estrutura química da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por FT-IR e como mostrado na Figura 2, Picos característicos de heparina podem ser observados em 3.300 – 3.600 cm-1, correspondente aos grupos hidroxila de heparina (Figura 2 vermelho). A diminuição da amplitude do pico em 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 azul) representa a conjugação entre a starPEG-(NH2)8 grupos amida e grupo carbonila de heparina. Amplitude de pico 1.650 cm-1 corresponde a amida carbonila vibrações de alongamento também foi reduzida, indicando a reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com succinato de grufo e amina de starPEG-(NH2) 8. estrutura de superfície da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por microscopia de força atômica e é mostrado de Lou et al, a nanocápsula era aproximadamente 30 nm de altura e 2 µm de largura com pequenas características porosas (manchas escuras) que vão entre 100 a 200 nm em diâmetro10. Dados obtidos de microscopia eletrônica de varredura também confirmam a estrutura porosa altamente interconectada da cavilha de heparina (Figura 3), sugerindo que poderia ser apropriado para a sobrevivência da pilha durante a entrega em vivo.

Revestimento de superfície de ilhotas isoladas de rato foi examinado e conforme apresentado na Figura 4, uma camada fina de nanocápsula, mostrada por fluorescência verde foi depositada uniformemente através da superfície de ilhotas revestidas sem causar alterações evidentes na ilhota tamanho/volume. Durante o revestimento, é recomendável manter as ilhotas no gelo para manter a sua viabilidade. Da mesma forma, o período de revestimento, 10 min neste caso, foi também otimizado para permitir a manutenção da viabilidade de Ilhéus. É interessante notar que para melhor observação da nanocápsula, microscopia de elétron que examina as secções transversais de ilhotas revestidas como relatado anteriormente9,16 seria mais adequada, embora os dados seria gerados de ilhotas fixas e incorporadas em vez de viver ilhotas na cultura.

Relativamente à sobrevivência e função das ilhotas revestidas, revascularização ilhéu e funções em foram avaliados in vitro. Considerando as propriedades benéficas da heparina, functionalization de heparina para a superfície da ilha poderia facilitar a revascularização ilhéu da cultura e, consequentemente, a sua sobrevivência. Temos observado que os ilhéus de rato de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto na cultura (Figura 5). Significativamente mais avançado formação vascular era também evidente a partir de células endoteliais ilhéu (MS1) que co foram cultivadas com heparina-PEG revestido ilhotas, indicadas por estruturas microvessel alongadas e rede-como estruturas vasculares (Figura 6 ).

O processo de nanocápsula incorridos sem capacidade de secretoras de insulina glicose-estimulada com efeito dos ilhéus heparina-PEG revestido. Baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando ilhéus foram perfundidos com solução salina fisiológica, suplementada com sub-stimulatory nível de glicose (2 mmol/L; A Figura 7). Quando ilhéus foram estimulados com um nível suprafisiológica da glicose (glicose de 20 mmol/L), observou-se aumento da secreção de insulina em todos os grupos de tratamento.

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Figura 1: Estrutura química da Hep-PEG nanocápsula para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas. Revestimento de ilhéu foi conseguido através da reticulação ligações covalente entre o NHS de heparina e aminas primárias dentro da membrana celular e estrela - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina possui vários grupos carboxila, que foram modificados para ter um grupo de NHS cada. Os grupos carboxila NHS-ativado irão reagir com aminas primárias de proteína para ligações amida de formulário, através do qual é estabilizada nanocápsula de Hep-PEG e ilhotas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 : Espectro infravermelho da estrela - PEG-(NH2)8, heparina e Hep-PEG nanocápsula em seco estado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de Hep-PEG no estado seco digitalizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagens representativas de heparina-PEG revestido Ilhéus sob microscópio de fluorescência.
Heparina foi previamente rotulada com FAM (mostrado em verde). Imagens são representativos de 100 ilhotas. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Ilhotas de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto. (A) dados apresentados como média erro-padrão do meio, n = 50 ilhotas por grupo. (B) as células vivas foram mostradas em células e inoperante em vermelho. Barra de escala = 100 µm. imagens são representante de 50 ilhotas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Heparina-PEG nanocápsula facilita intrailhéu revascularisation. Formação de tubo Matrigel de células MS1 co cultivadas com heparina-PEG revestido Ilhéus e ilhotas de noncoated controle. Imagens foram tiradas do bar 4 e 24 h. escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Heparina-PEG nanocápsula incorre em nenhuma mudança na função de secreção de insulina ilhéu. Heparina-PEG revestido de Ilhéus e ilhotas noncoated controle (30 cada) foram expostas a 2 mmol/L (barra branca) ou 20 glicose mmol/L (barra preta) por 30 min. a secreção de insulina em resposta a 20 glicose mmol/L foi comparável entre o revestido e ilhotas de controle. Dados são mostrados como média ± erro padrão de meios, n = 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste artigo, demonstramos uma abordagem "fácil-para-adotar" para viver uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula de engenharia de superfície celular e a grupos amina da membrana de superfície de ilhotas pancreáticas. De facto, os grupos aminoácidos dentro das membranas celulares são altamente reativos e como consequência, estudos anteriores relataram interações entre grupos aminoácidos primários com registrados N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster sob condições fisiológicas14 ,16,21. Além disso, extensa pesquisa tem relatado que incorporação de heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatado e importante componente da matriz extracelular, durante o encapsulamento do Ilhéu, poderia levar a reforçada pós-transplante revascularização do miocárdio e redução IBMIR22,23. Considerando a biocompatibilidade de PEG e multivalentes Propriedades de heparina, usamos 8-armado PEG para heparina máxima de carregamento durante a fabricação da nanocápsula. Heparina foi modificada com -NHS, que posteriormente reagiria com os grupos de2 -NH na membrana celular de ilhéu. Permitindo a formação de ligação covalente entre -NH2 (membrana celular) e -NHS de Hep-PEG, os ilhéus iria ser prontamente "revestidos" pelo PEG heparina-incorporada, formando assim uma camada fina nano (nanocápsula) sobre a superfície externa do pâncreas Ilhéus.

A presente abordagem é diferente de métodos anteriormente publicados que também selecionou PEG como polímero principal para microencapsulação ilhéu nisso Chemistry de pseudo-opaco entre o -SNS (da nanocápsula) e -NH2 da célula ilhéu utilizou-se a membrana. Considerando que a estabilidade da ilha/célula revestimento, especialmente em um ambiente complexo como o plasma, é crucial para revascularização pós-transplante e sobrevivência, a formação entre -NHS e -NH2 seria mais estável em relação ao interação hidrofóbica entre a PEG e membrana celular24, interações eletrostáticas9,15,24,25,26 ou ligação biológica entre a biotina streptavidin14.

Além disso, em contraste com o ilhéu do revestimento que se baseia na abordagem LBL com período de tratamento estendido ilhéu para deposição de várias camadas14,16,25, a técnica presente também requer mínima processamento e muito curto período de revestimento dos ilhéus isolados. Ambos esses fatores são essenciais para a sobrevivência do Ilhéu pós-transplante desde viabilidade de ilhotas é frequentemente já comprometido isolamento ilhéu seguintes devido ao ECM danificado durante a digestão enzimática. No entanto, uma limitação da abordagem actual é que, ao contrário da LBL, através do qual a espessura do revestimento exterior podia ser controlada aumentando ou reduzindo o número de deposição de camada, espessura de nanocápsula o Hep-PEG não pode ser adaptada para o momento.

Além disso, devido à condição suave, onde a reação química entre o NHS - e -NH2 tem lugar, a abordagem actual é aplicável para a célula viva superfície engenharia não limitada de ilhotas pancreáticas, mas a maioria de terapia celular. Além disso, Considerando que a heparina é conhecida por interagir com uma variedade de citocinas e moléculas biologicamente ativas, a nanocápsula Hep-PEG também apresenta uma plataforma aberta que tem o potencial para a incorporação de mediadores biológicos ilimitadas, bem como interfaces para célula mais complexa engenharia de superfície.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio financeiro do fundos nacionais de ciências naturais da China (31770968) e a Tianjin pesquisa programa de Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
PBSHycloneAAJ207798
StreptozototinSigmaS0130
HistopaqueSigma10831
RPMI 1640GIBCO, by Life Technologies31800022
Fetal Bovine SerumGIBCO, by Life Technologies16000-044
Penicillin StreptomycinGIBCO, by Life Technologies15140
Cell Dissociation SolutionGIBCO, by Life Technologies13150-016
DMEMGIBCO, by Life Technologies12800017
D-(+)-Glucose solutionSigmaG8644
488 phalloidinSigmaA12379
CFSESigma21888-25mg-F
Annexin V/PI apoptosis kitDojindoAD10
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Collagenase from Clostridium, Type XISigmaC7657
HeparinSigma-AldrichH3149
NHSSigma-Aldrich56480
EDCSigma-Aldrich3449
8-armed PEGJ&K Scientific Ltd1685176
FAMSigma-AldrichM041100
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl esterSigma-Aldrich21888
KBrJ&K Scientific Ltd32036
3-aminopropyl-triethoxysilane Sigma-AldrichA3648
tolueneJ&K Scientific LtdS-15497-20X
Live/dead staining kitBiovision, USK501
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reducedBD Bioscience354230
Sodium chloride, 99.5%J&K Scientific Ltd105864
Potassium chloride, 99%, extra pureJ&K Scientific Ltd991468
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagentJ&K Scientific Ltd988639
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagentJ&K Scientific Ltd182158
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pureJ&K Scientific Ltd128839
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysisJ&K Scientific Ltd119370
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2J&K Scientific Ltd21114
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichV900933
Rat/Mouse Insulin ELISA kitMillipore-lincoEZRMI-13K

Referências

  1. Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
  2. Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
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