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Resumo

Este manuscrito descreve o romance de configuração e funcionamento interno de um fotoacústico microscopia e sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada de coerência óptica para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo de animais maiores, tais como coelhos.

Resumo

Imagem de ocular fotoacústico é um emergente oftálmica tecnologia que canaliza pode visualizar o tecido ocular, convertendo energia luminosa em ondas sonoras e está atualmente sob investigação intensiva de imagem. No entanto, a maioria relatou que trabalho até à data é focado sobre a imagem do segmento posterior dos olhos de pequenos animais, como ratos e camundongos, o que coloca desafios clínico tradução humana devido a tamanhos pequeno globo ocular. Este manuscrito descreve um romance fotoacústico microscopia (PAM) e o sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada (OCT) de coerência óptica para a imagem latente de segmento posterior dos olhos de animais maiores, tais como coelhos. A configuração do sistema, alinhamento de sistema, preparação de animais e dual-modalidade protocolos experimentais para vivo em, não invasivo, livre de rótulo choriorétiniennes imagem em coelhos são detalhados. A eficácia do método é demonstrada através de resultados experimentais representativos, incluindo a vasculatura da retina e da coroide, obtida pelo OCT e PAM. Este manuscrito fornece um guia prático para reproduzir os resultados de imagem em coelhos e avançando fotoacústico imagem ocular em animais maiores.

Introdução

Últimas décadas têm testemunhado o desenvolvimento explosivo do campo da biomédica fotoacústico imagem1,2,3,4,5,6,7 ,8. Baseia-se a conversão de energia da luz, em som, a imagem de fotoacústico emergentes pode Visualizar amostras biológicas em escalas de organelas, células, tecidos e órgãos para pequenos animais de corpo inteiro e pode revelar sua anatômica, funcional, molecular, genética, e informações metabólicas1,2,9,10,11,12. Imagem latente fotoacústico encontrou aplicações únicas em uma variedade de campos biomédicos, como célula biologia13,14, biologia vascular15,16,,Neurologia1718 , oncologia19,20,21,22, Dermatologia23, farmacologia,24e25,de hematologia26. Sua aplicação em oftalmologia, ou seja, fotoacústico ocular imaging, tem atraído interesse substancial de cientistas e clínicos e é atualmente sob investigação.

Em contraste com a usada rotineiramente ocular de imagem tecnologias27, tais como a angiografia fluoresceína (FA) e angiografia indocianina verde (ICGA) (baseado no contraste de fluorescência), tomografia de coerência óptica (OCT) (baseado no contraste de dispersão óptica) e seus derivada angiografia de OCT (baseado no contraste do movimento das células vermelhas do sangue), ocular fotoacústico absorção óptica de usos como o mecanismo de contraste de imagem. Isto é diferente do convencionais oculares tecnologias de imagem e fornece uma única ferramenta para o estudo das propriedades de absorção óptica do olho, que são normalmente associadas com o estado fisiopatológico do tecido ocular28. Até à data, significativa excelente trabalho tem sido feito em fotoacústico ocular de imagem29,30,31,32,33,34,35, 36,37, mas estes estudos enfocam o segmento posterior dos olhos de pequenos animais, como ratos e camundongos. Os estudos pioneiros bem demonstraram a viabilidade da imagem latente fotoacústico em oftalmologia, mas ainda há um longo caminho a percorrer no sentido clínica tradução da tecnologia desde tamanhos de globo ocular de ratos e camundongos são muito menor (menos de um terço) do que de seres humanos. Devido a propagação de ondas de ultra-som uma significativamente longas distâncias, qualidade de imagem e a intensidade do sinal pode sofrer muito quando a técnica é usada para imagens de segmento posterior de olhos maiores.

Para este objetivo, nós recentemente relatou o não-invasiva, imagem latente de choriorétiniennes livre de rótulo em coelhos vivos usando integrado fotoacústico microscopia (PAM) e o domínio espectral OCT (SD-OCT)38. O sistema tem excelente desempenho e pode visualizar a retina e a coroide dos olhos de animais maiores, com base na absorção endógena e contraste de espalhamento de tecido ocular. Os resultados preliminares em coelhos mostram que o PAM canaliza poderia distinguir individuais vasos sanguíneos da retina e da coroide usando uma dose de exposição do laser (~ 80 nJ) significativamente abaixo do limite de segurança de American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) no 570 nm,39; e a OCT claramente poderia resolver diferentes camadas da retina, coroide e a esclera. É a primeira demonstração da imagem latente de segmento posterior de animais maiores usando PAM e pode ser um passo importante para a tradução clínica da tecnologia considerando-se que o tamanho do globo ocular de coelhos (18,1 mm)40 é quase 80% do comprimento axial do seres humanos (23,9 mm).

Neste trabalho, nós fornecemos uma descrição detalhada do sistema de imagem dual-modalidade e protocolos experimentais utilizados para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo em coelhos vivos e demonstrar o desempenho do sistema através de representante da retina e resultados de imagem da coroide.

Protocolo

Os coelhos são que um departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA) coberto de espécies. Sua utilização na investigação biomédica precisa de seguir rigorosamente. Todos os experimentos de coelho foram realizados em conformidade com a instrução de ARVO (Associação para pesquisa em visão e Oftalmologia) para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research, após a aprovação do protocolo de animais de laboratório pela Universidade Comité sobre utilização e cuidados a animais (UCUCA) da Universidade de Michigan (protocolo PRO00006486, PI Yannis Paulus).

1. configuração do sistema

  1. Fotoacústico microscopia (PAM)
    1. Uso do laser óptico oscilador paramétrico (OPO) bombeado por um laser de estado sólido diodo-bombeado como a fonte de luz das Pam Select adequada as especificações técnicas, tais como taxa de repetição de pulso 1kHz, ns pulso duração 3-6 e comprimentos de onda sintonizável 405-2600 nm.
    2. Refletir o feixe emanando do laser a 570 nm por dois espelhos (M1 e M2), em seguida, passá-lo através de um placa de meia onda atenuador montado em um filtro de fase de rotação e, finalmente, foco, motorizado e Desbloqueem isso por um colimador de feixe (Figura 1). Otimize o design do colimador feixe. Um exemplo de configuração do colimador feixe inclui uma lente de focalização L1 (distância focal de 250 mm), uma pinhole (diâmetro de 50 µm) e uma lente collimating L2 (distância focal 30 mm).
    3. Divida o feixe colimado por um divisor de feixe (BS1) com uma relação de divisão de 90/10 (reflexão/transmissão). Grave a parte transmitida por um fotodíodo para monitoramento de energia de pulso-de-pulso do laser. Sucessivamente deflexionar a porção refletida por um espelho (M3) e um espelho dicroico (DM) e raster-digitalização usando um galvanômetro bidimensional. O galvanômetro é um componente compartilhado com o domínio espectral (SD)-sistema de OCT (descrito abaixo).
    4. Entregar o feixe digitalizado através de um telescópio é composto por uma lente de varredura (comprimento focal 36 mm) e uma lente oftálmica (OL, comprimento focal 10 mm) e finalmente concentrá-la sobre o fundo pela óptica do olho de coelho.
    5. Selecione um transdutor ultra-sônico em forma de agulha, com especificações técnicas adequadas, por exemplo, a frequência central 27 MHz, bidirecional − 6 dB de largura de banda 60%. Coloque-o em contato com a conjuntiva fora do eixo visual central para capturar o sinal fotoacústico animado.
    6. Amplificar o sinal usando um amplificador ultra-sônico (por exemplo, 57 dB de ganho), filtrá-la por um filtro passa-baixa (por exemplo, frequência de corte 32 MHz) e digitalizá-lo por um digitalizador de alta velocidade a uma taxa de amostragem de 200 MS/s.
    7. Lugar um medidor de energia acima do olho e mede a energia de pulso de laser sobre a córnea do coelho para mantê-lo abaixo a segurança ANSI do coelho limitar 160 nJ em 570 nm38. Bloquear o feixe para evitar a superexposição do laser, usando um obturador do laser controlado a partir do Matlab através de uma electrónica de sincronização.
    8. Sincronize o laser, o galvanômetro e digitalizador através de uma placa de aquisição (DAQ) de dados. Programa do software de sistema controle e aquisição de dados em Matlab.
  2. Tomografia de coerência óptica espectral-domínio (SD-OCT)
    1. Adapte o sistema SD-OCT baseado em um sistema comercialmente disponível adicionando uma lentes oftálmicas (OL) após a verificação de lente (SL) e um pedaço de vidro de compensação de dispersão (DCG) no braço de referência (Figura 1). A modificação permite que o sistema OCT pode a imagem do segmento posterior do olho de coelho.
    2. Use um tubo de habitação de zoom para ajustar o comprimento do braço para garantir sua partida com o comprimento do percurso óptico do braço amostra referência. Use uma íris para controlar a intensidade da luz de referência retrô-refletidos para garantir sua partida com intensidade de luz dispersa de volta desde o fundo do coelho para conseguir contraste máximo da imagem.
    3. Emprega uma dispositivo de carga acoplada (CCD) câmera encapsulada na cabeça digitalização para visualização em tempo real do fundo do olho de coelho com uma luz de iluminação emitida por diodo (LED) como fonte de iluminação externa.

2. alinhamento de sistema

  1. Inicializar a posição do galvanômetro e alinhar o sistema OCT ajustando os parafusos de montagem do colimador da fibra e o cubo de refletores.
    Nota: Os procedimentos passo a passo estão disponíveis no manual do sistema OCT adquirido comercialmente e não serão cobertos aqui. Este passo é principalmente para garantir o correto alinhamento do colimador de fibra, o braço de referência e a lente de varredura para maximizar o desempenho do sistema OCT.
  2. Ajuste a posição x, ye z do pinhole ao redor do foco da lente com foco espacialmente filtrar o feixe de laser e màxima transmitir energia de laser. Verifique as alturas do raio laser antes e após o pinhole usando uma ferramenta de medição de altura para garantir que eles são os mesmos.
  3. Ajuste a inclinação, decenter e a posição de z da lente collimating L2 para Desbloqueem o feixe filtrado. Certifique-se de que o feixe tem aproximadamente o mesmo tamanho e altura quando observado no campo próximo e campo distante.
  4. Co-axial, combine o feixe de laser de PAM e o feixe de luz OCT ajustando o inclina-se do espelho e o DM. Após esta etapa, o PAM laser e luz OCT devem ser totalmente coincidentes e digitalização regiões sobre o fundo de coelho são os mesmos.
  5. Ajuste a inclinação e decenter da lente OL para alinhá-lo corretamente no caminho óptico. Uma vez feito, o sistema de duplo-modalidade está pronto para a imagem latente.
    Nota: Um pode usar o método de autocolimação para alcançar este objectivo, ou seja, verificando a luz refletida de volta pela superfície de lente OL para certificar-se que remonta ao longo da mesma forma que a luz incidente.

3. preparação de coelho

  1. Pegue um coelho Nova Zelândia branco da facilidade de animais e informações do registro individuais, tais como o número de animais e o peso do corpo.
  2. Monte as plataformas de coelho, incluindo o apoio do corpo e o apoio de cabeça em cima da mesa óptica abaixo o sistema da imagem latente. Pus um cobertor de circulação hidráulica com o apoio do corpo e a temperatura da água circulante a 38 ° C, para ajudar a manter a temperatura do corpo do coelho quente para a duração do experimento e recuperação.
  3. Gravar os sinais vitais pré-procedimentos, incluindo o estado geral animal, membrana mucosa cor, frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura retal. Anestesiar o coelho com uma mistura de cetamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), através de injeção intramuscular (IM) e gravar o uso da cetamina (substância controlada de programação III). Confirme o nível de anestesia, verificando a sua frequência cardíaca, frequência respiratória e estado geral.
  4. Dilate as pupilas de coelho, usando uma gota de tropicamida 1% oftálmica e cloridrato de fenilefrina 2,5% oftálmica.
  5. Use um espéculo para manter as pálpebras do caminho e aplicar uma gota de lubrificante do olho para umedecer a córnea. Instilar uma gota de tetracaína tópica 0,5% nos olhos antes do procedimento da imagem latente.
    Nota: Para mais procedimentos ou com possível desconforto para o animal, dar uma injeção subcutânea de meloxicam antes do experimento para garantir o conforto animal o coelho.

4. imagem SD-OCT

  1. O coelho para a plataforma de imagem de uma câmera de fundus clínicos e tiraremos grau 50 imagens de fundo, vermelho grátis e autofluorescência antes da OCT sessão de imagem. Isso ajuda a verificar a transparência óptica do olho e reconhecer a morfologia do vaso do fundo e marcos históricos, como o nervo óptico e a vasculatura da retina raio medular.
  2. Transferir o coelho para a plataforma do sistema OCT e ajustar sua postura para aproximadamente posicionar um dos olhos sob o OL. Ilumine o olho usando o diodo emissor de luz.
    Nota: Para facilitar a tradução clínica da técnica, os olhos de coelho não são estabilizados usando quaisquer outros métodos, e a cabeça de coelho é só colocar sobre o apoio de cabeça sem qualquer fixação.
  3. Abra o software da OCT e verifique primeiro a imagem de câmera do CCD do fundo. Finamente ajuste a altura e o ângulo do suporte da cabeça, se necessário para garantir a região de interesse (ROIs), tais como os vasos da coroide e da retina, vasos, estão dentro do campo de visão (FOV) da câmera.
    Nota: Se o coelho está sob um nível bom de anestesia, uma sessão de imagens sequencial pode durar tanto quanto 10 min sem a necessidade de re-ajustar a cabeça do coelho.
  4. Desenhe uma linha reta para representar o OCT B-scan de interesse e iniciar a digitalização. Ajuste o comprimento do braço de referência para visualizar a imagem da OCT e otimizar o fator de compensação de dispersão em software OCT para obter as imagens mais nítidas.
    Nota: Ao ajustar o comprimento do braço de referência, duas imagens espelhadas de OCT aparecerá um após o outro. A imagem correta poderia ser distinguida com base no conhecimento prévio da anatomia do fundo.
  5. Definir parâmetros de aquisição de dados, tais como o número de pixels e médias e salvar imagens.
  6. Observar a frequência respiratória e cardíaca do coelho para estimar o nível de anestesia e o animal conforto. Para mais sessões, uma dose de um terço de ketamina suplementar ou inalado isoflurano pode ser considerada com intubação endotraqueal, um V-gel ou uma máscara facial para manter o avião de anestesia quando necessário.
  7. Enxágue a córnea de coelho com colírio a cada 2 min durante o experimento, para evitar desidratação superficial da córnea e da córnea superficial punctate ceratopatia epitelial. Monitorar e gravar animais sinais vitais a cada 15 min.

5. PAM de imagem

  1. Use óculos de segurança adequado do laser e ligue o laser OPO.
  2. Inicie o software de controle de PAM, ajustar o comprimento de onda do laser, a um dos picos de absorção do cromóforo alvo (por exemplo, 570 nm para hemoglobina), inicializar a posição do galvanômetro e monitor de energia de laser antes da córnea de coelho para garantir que está abaixo do limite de segurança ANSI.
  3. Montar o transdutor ultra-sônico num palco tridimensional (3D) Tradução e posicione a ponta do transdutor em contato com a conjuntiva coelho apontando para o fundo. Use uma gota de lubrificante do olho para casal melhor a conjuntiva de coelho e ponta do transdutor.
  4. Acender a luz de iluminação de LED e visualizar o fundo coelho através do software Matlab.
  5. Conjunto o ROI de digitalização (vasos da retina ou vasos da coroide), incluindo o centro e o tamanho físico. Abrir o obturador do laser e iniciar B-varredura do feixe. Por mais ou menos alinhar o transdutor, um deve ser capaz de ver fotoacústico detectado sinal no osciloscópio. Se não, ligeiramente, ajustar a posição do olho para digitalizar uma região diferente da córnea ou alternar para o outro olho e repita os processos acima.
  6. Observe o fotoacústico detectado sinal no osciloscópio e finamente ajustar a posição do transdutor para maximizar a intensidade de sinal ao longo de toda o B-scan.
    Nota: Devido a largura de feixe limitado, transdutor ultra-sônico geralmente tem um pequeno FOV41. Esta etapa determina a modulação de fundo de imagens finais do PAM. Desalinhamento vai levar a imagens de PAM com fundo heterogêneo e degradar a qualidade da imagem muito.
  7. Definir parâmetros de aquisição de dados. Isto inclui o número de pixels (EG., 256 × 256 pixels), taxa de amostragem (ex., 200 MS/s) e demora tempo. Inicie a aquisição de dados. O software Matlab será aberto automaticamente o obturador para passar o feixe de laser quando começou e fechar o obturador para bloquear o feixe quando terminar para evitar a superexposição do laser.
    Nota: Limitada pela taxa de repetição de pulso (1 kHz) do laser, demora cerca de 1 minuto para concluir a aquisição de dados de uma imagem com 256 × 256 pixels.
  8. Processar os dados brutos e visualizar a imagem de PAM em duas dimensões (2D), a intensidade máxima de projeção (MIP)13 ou em 3D através de de renderização volumétrica38.
  9. Desmontar o transdutor ultra-sônico, enxágue a ponta usando água deionizada e colocá-lo de volta para a caixa de armazenamento.
  10. Transferir o coelho para a câmera de fundus e re-examinar o fundo do olho. Essa etapa ajuda a verificar se existem quaisquer alterações morfológicas de fundo após a sessão de imagens.
  11. Enxágue a córnea de coelho com colírio cada dois min durante o experimento para evitar Bulhosa e desidratação de superfície corneal. Monitorar e gravar animais sinais vitais a cada 15 min.
    Nota: O PAM, OCT e sessões de imagem de fundo levar cerca de 1 h.

6. post imagem

  1. Depois de re-exame do fundo usando a câmera de fundus, desconecte o V-gel se conectado. Lave o olho usando colírio, aplicar flurbiprofeno oftálmico e sulfato de polimixina B e neomicina, pomada oftálmica de dexametasona e fechar o olho.
  2. Transferi o coelho com o cobertor de circulação hidráulica para uma câmara de recuperação. Proteger a caixa de luz e espere até que o coelho acorda naturalmente. Durante este período, monitorar sinais vitais de animais cada 15 min e manter o registro e retornar uma cópia para instalação de animais para manutenção de registros.
  3. Uma vez que o coelho acorda e é ativo, alerta e andar normalmente, transportá-lo volta para as instalações de animais. Se um experimento agudo é planejado, abater o animal usando solução de eutanásia (EG., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, injeção intravenosa na veia marginal da orelha) e elimine-o da carcaça.
  4. Desative o software e o laser. Limpe o banco ótico.

Resultados

O sistema de duplo-modalidade de imagem e protocolo experimental foram testados com sucesso em laboratório dos autores usando quatro coelhos Nova Zelândia branco. A seguir apresenta alguns resultados representativos.

A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do PAM e SD-OCT dual-modalidade de imagem sistema. Ele é composto dos seguintes módulos: fotoacústico luz fonte, atenuador variável do la...

Discussão

Um filme de lágrima intacta e regular é essencial para imagens de alta qualidade do fundo. Filmes um desgaste irregular e se deteriorou significativamente podem degradar a imagem qualidade42. Para preservar a integridade do filme lacrimal e evitar corneal superficial punctate bulhosa, é essencial para lubrificar a córnea usando colírio muito frequentemente, aproximadamente a cada 2 min. Se houver qualquer preocupação em relação a opacidade do olho, use uma lâmpada de fenda e fluoresceín...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado com o apoio generoso de 4K12EY022299 o National Eye Institute (YMP), luta para a GIA16002 do FFS de fundação pesquisa de Retinal visão-International (YMP), irrestrito apoio departamental da investigação para evitar cegueira e o Universidade de Michigan no departamento de Oftalmologia e Ciências visuais. Este trabalho utilizou o núcleo centro para visão investigação financiada pela P30 EY007003 do Instituto Nacional do olho.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Dual-modality imaging system
OPO laserEkspla (Vilnius, Lithuania)NT-242
Beam attenuatorThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)AHWP10M-600
Motorized rotation stageThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)PRM1/MZ8
Motorized rotation stage controllerThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)TDC001
Focusing lensThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)AC254-250-B
PinholeThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)P50S
Collimating lensThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)AC127-030-B
PhotodiodeThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)PDA36A 
Laser shutterVincent Associates Inc. (Toronto, Canada)LS6S2T0
Laser shutter driverVincent Associates Inc. (Toronto, Canada)VCM-D1
Dichroic mirrorSemrock, Inc. (Rochester, NY, USA)Di03-R785-t3-25×36
Scan lensThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)OCT-LK3-BB
Ophthalmic lensThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)AC080-010-B-ML
Ultrasonic transducerOptosonic Inc. (Arcadia, CA, USA)Custom
AmplifierL3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA)AU-1647
Band-pass filterMini-Circuits (Brooklyn, NY, USA)BLP-30+
DigitizerDynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA)PX1500-4 
Synchronization electronicsNational Instruments Corporation (Austin, TX, USA)USB-6353
OCT moduleThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)Ganymede-II-HR
Dispersion compensation glassThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)LSM03DC
Illumination LED lightThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)MCWHF2 
Power meterThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)S121C 
Power meter interfaceThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)PM100USB 
Height measurement tool Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)BHM1
Fundus cameraTopcon Corporation (Tokyo, Japan) TRC 50EX
MatlabMathWorks (Natick, MA, USA)2017a
OscilloscopeTeledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA)WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanketStryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA)TP-700
Ketamine hydrochloride injectionPar pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA)NDC code 42023-115-10
Xylazine hydrochlorideVetOne (Boise, ID, USA)NDC code 13985-704-10
Tropicamide ophthalmicAkorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA)NDC code 17478-102-12
Phenylephrine hydrochloride ophthalmicParagon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA)NDC code 42702-102-15
Eye lubricantHub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA)NDC code 17238-610-15
EyewashAltaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA)NDC code 59390-175-18
Tetracaine hydrochloride ophthalmic solutionBausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)NDC code 24208-920-64
Flurbiprofen sodium ophthalmic solutionBausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)NDC code 24208-314-25
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic OintmentBausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)NDC code 24208-795-35
Meloxicam injectionHenry Schein Inc. (Queens, NY, USA)NDC code 11695-6925-1

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