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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Uso in vitro de tenocytes degenerativa é essencial ao investigar a eficácia do tratamento romance na tendinopatia. No entanto, a maioria dos estudos de investigação usar apenas o modelo animal ou um tenocyte saudável. Propomos o seguinte protocolo para isolar tenocytes degenerativa humana durante a cirurgia.
Tendinopatia, uma condição dolorosa que se desenvolve em resposta à degeneração do tendão, está em ascensão no mundo desenvolvido devido ao aumento da atividade física e a esperança de vida. Apesar de sua crescente prevalência, a patogênese subjacente ainda permanece incerto, e o tratamento é geralmente sintomático. Recentemente, várias opções terapêuticas, incluindo fatores de crescimento, as células-tronco e terapia gênica, foram investigadas na esperança de aumentar a potência de cura do tendão degenerativa. No entanto, a maioria destes estudos de investigação foram realizada somente em modelos animais ou tenocytes humana saudável. Apesar de alguns estudos usando tenocytes patológico, para o melhor de nosso conhecimento não há atualmente nenhum protocolo descreve como obter tenocytes degenerativa humana. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, o tecido do tendão foi colhido de um paciente com epicondilite lateral durante a cirurgia. Em seguida, foram coletadas amostras de biópsia do extensor carpi radial brevis tendão correspondendo a mudanças estruturais observadas no momento da cirurgia. Todos os tendões colhidos apareceram para ser maçante, cinza, friável, e edematosa, que fez-los visualmente distintos daqueles saudáveis. Tenocytes foram cultivadas e usadas para experimentos. Entretanto, metade dos tecidos colhidos foram analisados histologicamente, e foi mostrado que partilhavam as mesmas características chaves da tendinopatia (angiofibroblástico displasia ou hiperplasia). Uma análise secundária por imunocitoquímica confirmou que as células cultivadas foram tenocytes com a maioria das células ter manchas positivas para proteínas mohawk e tenomodulin. As qualidades da natureza degenerativa de tenocytes foram então determinadas comparando-se as células com o controle saudável usando um ensaio de proliferação ou qRT-PCR. O tenocyte degenerativa exibido uma maior taxa de proliferação e padrões de expressão de gene semelhante de tendinopatia que combinasse os relatórios anteriores. Em geral, este novo protocolo poderá fornecer uma ferramenta útil para futuros estudos de tendinopatia.
Tendinopatia é uma condição de músculo-esquelética crônica degenerativa que se desenvolve em várias partes do corpo. Recentemente, o número de casos de tendinopatia aumentou consideravelmente no mundo desenvolvido devido à crescente participação em esportes recreativos e maior expectativa de vida1,2. A causa da tendinopatia é considerada multifatorial e essas causas incluem isquemia, lesões de radicais livres de oxigênio, um desequilíbrio entre inervações vasoconstritor e vasodilatador, micro-rasga interna e alterações neuro-Regulamento3 ,4,5,6,7,8. A maioria dos tratamentos para tendinopatia apenas aliviar seus sintomas. Além disso, tratamentos sem regeneração de tecidos requerem um longo tempo para reabilitação e alcançar uma resposta limitada de tendões lesionados, que impõe um desafio clínico para os médicos,9.
A incompetência de opções atuais do tratamento, juntamente com a falta de capacidade de degenerativa do tendão de auto-recuperação tem chumbo pesquisadores a ter interesse em explorar estratégias de tratamento alternativo. Recentemente, novos estudos relataram muitos resultados promissores para melhorar a eficácia de cura dos tendões tendinopatia usando fatores de crescimento, células-tronco com base em terapia e terapia de gene10,11,12.
Através de uma revisão de literatura, encontramos que os estudos envolvidos podem ser divididos em duas categorias com base em seus materiais de análise: animal modelos como um rato, um rato ou um coelho; e modelos humanos. No que se refere o modelo animal, atualmente, existem duas técnicas populares para gerar tendinopatia: indução química da lesão ou mecânico sobrecarregando o modelo. No entanto, cada modelo animal foi limitado em reproduzir o complexo humano tendinopatia patologia13,14.
A maioria dos jornais, usando amostras humanas foram analisados histologicamente ou realizado o em vitro experimento com base em um tenocyte humano saudável em vez de um tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. somente alguns jornais relataram que eles usaram um humano tenocyte degenerativa, mas eles não descrever em detalhe o protocolo usado para obter o tenocyte degenerativa do humano22,23. Neste contexto, note-se que resultados de sucesso do modelo animal ou o tecido saudável/tenocyte não podem necessariamente prever eficácia humana ou dosagem eficaz porque a degeneração do tendão é um processo complicado e a patogênese é Ainda não totalmente compreendidas.
Coletivamente, é necessário descrever o protocolo padrão para obter o tenocyte degenerativa do tecido humano sem causar efeitos adversos para o doador. Este artigo descreve um protocolo sobre como adquirir o tenocyte degenerativa humana. Para validar o protocolo, os tecidos colhidos foram analisados histologicamente. Em seguida, a célula culta foi confirmada como o tenocyte degenerativa usando imunocitoquímica (ICC), um quantitativo em tempo real-cadeia da polimerase (qRT-PCR) e um ensaio da viabilidade.
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O protocolo foi realizado em conformidade com a declaração de Helsínquia e o protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional no CHA Bundang Medical Center.
1. colheita de tecido degenerativas do tendão do paciente
2. histologia
3. Tenocyte cultura
4. imunocitoquímica (ICC)
5. proliferação ensaio
6. análise estatística
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Análise histológica revelou que o tecido colhido da epicondilite lateral teve as características de um tendão de tendinopathic. H & E seção de tendinopatia degenerativa do tendão revelou um bundle colágeno desorganizada com uma perda de polaridade e estruturas de fibra fina reta, fortemente embalado paralelo. Histológicas sinais sugestivos de degeneração, tais como maior celularidade e núcleos alargados sem a forma típica do eixo eram comuns nas amostras. Além disso, feixes ...
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Um número de estudos anteriores relataram como criar modelos animais tendinopathic crônica, utilizando diferentes procedimentos como colagenase ou injeção de kartogenin, esteira correndo e mais26,,27. Embora os estudos numerosos mostraram promissores efeitos terapêuticos baseados-se nestes modelos animais, experimentos utilizando o tenocyte degenerativa humana seria cruciais no campo da tendinopatia para reproduzir a eficácia do tratamento. Neste artigo, n?...
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Os autores não têm nada para divulgar.
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), que foi financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI16C1559).
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
Mini-blade | Beaver | 374769 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
PBS | Gibco | 14190250 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
BSA | Rdtech | C0082 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
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