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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Resumo

O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.

Introdução

Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.

Ativar o 'perigo' sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .

Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.

Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.

Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.

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Protocolo

Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.

1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs)

  1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
  2. Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Impostos especiais de consumo ossos tíbia-fíbula e fêmur usando uma tesoura cirúrgica e colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 10 cm.
  3. Use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o tecido fora tanto quanto possível na tampa do cm 10 cultura prato e isolar tíbias e fêmures de colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 6 cm.
  4. Use lâminas cirúrgicas para ambas as extremidades de tíbias e fêmures. Use 3 mL de PBS em seringa de 3 ml com agulha 23G para liberar o conteúdo da medula de uma extremidade dos ossos para um tubo cônico contendo 12 ml de PBS. Repita este passo 3 x para cada extremidade dos ossos.
  5. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise de 1ml ACK para 5 minutos para remover células vermelhas do sangue.
  7. Adicione 9 ml de PBS para diluir o tampão de Lise ACK e centrifugar 300 x g por 5 min.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender com 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% não-essenciais aminoácidos (x 100), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoetanol e 5% de penicilina/estreptomicina).
    Nota: O nível de endotoxinas tem que ser menos de 0.1 EU/ml no FBS.
  9. Passar a suspensão de células através de um filtro de célula 40 μm e levar 20 µ l de suspensão de células e misture com 80 µ l de trypan azul para contar o número de células vivas usando citômetro.
  10. Ajuste o número de células a 1 x 106 células/ml com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml.
  11. 3 ml de 1 x 106 células/ml em cada poço da placa de 6 a placa e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: As células da medula óssea de um rato é em torno de 3-5 x 107 células, indicando que pode ser colocada de 2 para 3 placas de 6 boas.
  12. No dia 3, remova todos os 3 ml de meio de cultura de cada poço, adicionar 2 ml PBS fresca em cada poço, e em seguida agite suavemente a placa para garantir a remoção de todas as células não-aderentes.
  13. Substitua 3 ml de meio de cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 em cada poço de 10 ng/ml. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
  14. No dia 5, diretamente Adicione outro 3 ml meio cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml em cada poço. Incube as celulas em 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: O volume total em cada poço agora é 6 ml.
  15. No dia 7, coloque o prato inteiro no gelo por 10 minutos. Pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar o frouxamente aderentes BMDCs como os iDCs em suspensão.
    Nota: Os macrófagos aderentes ainda estão conectados à placa. Procedimentos e suavemente a baixa temperatura são a chave para evitar a ativação de DC para afetar ainda mais experiências.
  16. Centrifugar a suspensão celular de 300 x g, durante 5 minutos e ressuspender com meio de cultura fresco para novas experiências.
    Nota: BMDCs podem ser identificadas com fluorescência-etiquetada CD11c anticorpo por citometria de fluxo e mostramos nossa estratégia associada de BMDCs para novas experiências na Figura 1.

2. caracterizar o Gene TolDC e perfil de proteína

  1. Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: CDDO-DFPA, um sintético triterpenoides, é um fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 indutor de fator (Nrf2) e inibidor de fator nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a outros agentes para indução de TolDCs de iDCs, tais como IL-10, vitamina D3, dexametasona ou Baía 11-7085 e modificar esta etapa para uma condição ideal para cada agente.
  2. Adicione 10 ou 100 ng/ml de LPS pela incubação 4-24 hrs para induzir mDCs (tempo de incubação é diferente devido a medição do mRNA ou proteína).
  3. Delicadamente, pipetar o meio de cultura em cada poço e colher a suspensão de células usando uma pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g, durante 5 minutos para coletar as células e o sobrenadante, respectivamente.
  4. Analisar as superfície ligantes de Pelotas o celular por citometria de fluxo, tais como ligantes estimulatórios: CD40, CD80 e CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligantes inibitórios: PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
  5. Isolar o RNA de Pelotas a célula e analisar o RNA e o sobrenadante amostras para os níveis de citocinas perfil e gene e proteína por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e ELISA, respectivamente.
    Nota: por exemplo, citocinas inflamatórias: TNF-α, relato, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL-23 ou anti-inflamatórios citocinas: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.

3. avaliar a função de TolDCs In Vitro e In Vivo

  1. Ensaio de Syngeneic de proliferação de células T
    1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
    2. Prepare o buffer de MACS usando 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA em 500 ml de PBS. Esterilize o buffer por filtragem através de um filtro de 0,2 µm.
      Nota: Mantenha o buffer no gelo durante o experimento a seguir.
    3. Para obter o CD4+ T células, eutanásia em ratos transgénicos do OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica.
    4. Colocar o baço com 2 ml de PBS em um prato de cultura de 6 cm e usar a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o baço, passando um filtro de célula 40 μm.
    5. Recolha a suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min.
    6. Ressuspender as células em 400 μl de tampão de MACS.
    7. Adicionar 100 μl de CD4+ T Cell biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 5 minutos.
      Nota: O anticorpo cocktail vincula em outros tipos de célula, exceto CD4+ T células, tais como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.
    8. Adicione 300 μl de tampão de MACS e 200 μl de antigrânulos biotina (Tabela de materiais) a 4° C por 10 minutos.
    9. Lugar da coluna composta de esferas ferromagnéticas (Tabela de materiais) e filtro de pré-separação juntos no magnético campo e enxaguá-lo com 3 ml de tampão de MACS.
    10. Adicione 9 ml de tampão de MACS nas células e centrifugar 300 x g por 5 min.
    11. Ressuspender as células em 3 ml de tampão de MACS e aplique na coluna. Coleta de passagem contendo CD4+ T células.
    12. Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS e também coletar o escoamento.
    13. Para obter o pan esplênica DCs, eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica. Coloque o baço em um prato de cultura de 6cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (colagenase 2 mg/ml D dissolvido em HBSS contendo cálcio, magnésio).
    14. Injecte 1 ml da solução de colagenase D o baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Corte o baço em pequenos pedaços com uma tesoura pequena.
    15. Agitar e incubar a temperatura ambiente por 25 minutos.
    16. Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M à temperatura ambiente por 5 minutos.
      Nota: Os passos de 3.1.13-3.1.14 são essenciais para aumentar o rendimento do DCs.
    17. Agora use a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o chorume do baço, passando um filtro de célula 40 μm e coletar a suspensão de células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos.
    18. Ressuspender as células em 350 μl de tampão MACS, 50 µ l de reagente de bloqueio de FcR e 100 μl de Pan células dendríticas biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 10 minutos.
      Nota: O anticorpo cocktail contra antígenos que não são expressas por DCs.
    19. Lave as células pela adição de 9 ml de tampão de MACS e centrifugar a 300 x g por 5 minutos.
    20. Ressuspender as células em 800 μl de tampão de MACS e adicionar 200 μl de antigrânulos biotina a 4 ° C por 10 minutos.
    21. Repita as etapas de 3.1.9-3.1.11 para coletar DCs.
    22. Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS duas vezes e também coletar o escoamento.
    23. Tratar a 2 x 105 DCs/ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C para 1 hr separadamente, rótulo o CD4+ T células (1 x 107/ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajustar o volume para obter a concentração final de 2 x 106 T células/ml.
    24. Em seguida, em uma placa de 96 poços, co cultura 100 μl de células dendríticas tratadas com o mesmo volume de CD4 CFSE-rotulado+ T cells, ambos colhidos os passos acima para obter 01:10 proporção. Agora adicione 100 ng/mL ovalbumina (OVA) peptídeo 323-329 por bem e medir a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação.
      Nota: O número de células e a relação de DCs e T células foram otimizadas de nossa anterior trabalho37.
  2. Induzir o passivo EAE injetando BMDCs pulsada com mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) (35-55)
    1. Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 hr.
    2. Adicionar 10 ng/ml de LPS para incubação 24 hrs.
    3. Adicionar 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubação 4 hrs.
    4. A suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min. da colheita.
    5. Ressuspender as células com PBS e contar as células.
    6. Por via subcutânea injete 200 μl de 2 x 106 células de camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas de idade (100 μl em cada pata traseira).
    7. No dia da injeção de BMDC e 48 hrs. mais tarde, injetar 200 ng de toxina pertussis (PTX) em cada rato.
    8. Repita etapas 3.2.6-3.2.7 uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
    9. Avalie os sintomas clínicos da EAE diariamente usando critérios padrão37 (0.5-manco cauda final, cauda 1-manco, fraqueza do membro posterior de 2-moderado, 3-grave membro posterior fraqueza, paralisia dos membros posteriores de 4-completo, estado 5-quadriplegia ou moribundo, morte-6).

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Resultados

A diferenciação e seleção de BMDCs:

Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de for...

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Discussão

Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalme...

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Divulgações

Nenhum

Agradecimentos

Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house synthesisCell culture
Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC differentiation
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Cell culture
β-mercaptoethanolSigma Aldrich Inc.516732Cell culture
Pertussis toxin (PTX)R&D systems3097EAE induction
MOG (35–55) peptide21stCentury Biochemicalsin house synthesisEAE induction
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamineThermoFisher Scientific11875-093Cell culture
Non-essential amino acid (100X)ThermoFisher Scientific11140050Cell culture
HEPESThermoFisher Scientific15630080Cell culture
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140122Cell culture
40 μm cell strainerCorning352340Cell isolation
PE-conjugated CD80BD Biosciences557227Flow cytometry
PE-conjugated CD86BD Biosciences555665Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1BioLegend124307Flow cytometry
APC-conjugated MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Flow cytometry
APC-conjugated CD11cBD Biosciences340544Flow cytometry
Isotype matched PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Flow cytometry
Isotype matched APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Flow cytometry
CFSEBioLegend423801T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T cell proliferation assay
ACK lysing bufferThermoFisher ScientificA1049201BMDC differentiation
1 ml syringeBD Biosciences309626T cell proliferation assay
3 ml syringeBD Biosciences309588BMDC differentiation
25G needleBD Biosciences309626T cell proliferation assay
23G needleBD Biosciences309588BMDC differentiation
BSASigma Aldrich Inc.A2058T cell proliferation assay
EDTAThermoFisher Scientific15575020T cell proliferation assay
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T cell proliferation assay
Pre-Separation FilterMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T cell proliferation assay
collagenase DSigma Aldrich Inc.11088858001T cell proliferation assay
HBSSThermoFisher Scientific14025076T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329Sigma Aldrich Inc.O1641T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR&D systemsDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D systemsMTA00BELISA
IL-6 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR&D systemsM6000BELISA
IL-23a TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR&D systemsDY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan probeThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibodyAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actin antibodyAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometry

Referências

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
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