Indução de síndrome nefrótica em camundongos por injeção Retrobulbar de doxorrubicina e na prevenção da retenção de Volume por liberação sustentada aprotinina

Resumo

Aqui, descrevemos a indução de síndrome nefrótica experimental em ratos 129S1/SvImJ por injeção retrobulbar rápida de doxorrubicina. Também tratamos nefrótico ratos com pelotas de liberação sustentada contendo aprotinina para inibir a atividade de protease de serina urinária e evitar a retenção de sódio.

Resumo

Síndrome nefrótica é a manifestação mais extrema da doença renal contraste e caracterizado por pesados proteinúria, hipoalbuminemia e edema devido à retenção de sódio e hiperlipidemia. Para estudar a fisiopatologia desta síndrome, desenvolveram-se modelos de roedores baseiam na injeção de substâncias tóxicas como doxorrubicina, causando danos podocyte. Em camundongos, apenas algumas cepas são suscetíveis a este modelo. Em sua 129S1/SvImJ ratos, a administração de doxorrubicina por injeção intravenosa rápida para o seio de retrobulbar induz a síndrome nefrótica experimental que apresenta todos os sintomas das doenças humanas, incluindo edema e retenção de sódio. Após o início da proteinúria, exposição de ratos aumentou a atividade de protease de serina urinária que leva à ativação do canal de sódio epitelial (ENaC) e retenção de sódio. Inibição farmacológica de proteases de serina urinária pelo tratamento com liberação sustentada aprotinina revoga ativação ENaC e evita a retenção de sódio. Este modelo é ideal para estudar a fisiopatologia da proteasuria, i. e., a excreção de ativo Serina proteases que causam ENaC ativação pela proteólise de sua subunidade γ-. Isto pode ser considerado como o principal mecanismo de ativação ENaC e retenção de sódio na doença renal de contraste.

Introdução

Síndrome nefrótica é caracterizada por hiperlipidemia, hipoalbuminemia, edema e proteinúria pesada e pode ser considerada como a manifestação mais extrema da doença renal de contraste. Em roedores, síndrome nefrótica experimental pode ser induzida por injeção única de antraciclinas ou puromicina que leva a danos podocyte e assemelha-se a doença humana mudança mínima e glomeruloesclerose segmentar (FSGS)¹. Após sua primeira descrição em 1955 por Frenk et al. ², nefrose de puromicina nucleosídeos (PAN) em ratos tornou-se um modelo padrão para investigar a fisiopatologia da síndrome nefrótica em numerosos estudos^3,4,5,6. Nos ratos, o modelo correspondente pode ser induzido pela doxorrubicina regime⁷. No entanto, há uma forte tensão-dependência que é geneticamente determinada pelo menos dois loci genéticos⁸. Além disso, existem diferenças na resposta de contraste e curso da síndrome nefrótica^9,10. Usando ratos 129S1/SvImJ e injeção intravenosa rápida de doxorrubicina através do seio retrobulbar, respostas proteinúria atingem valores que são suficientes para induzir as características típicas da síndrome nefrótica, particularmente de retenção de volume caracterizada por ascite e quase livre de sódio urina⁷. Retenção de sódio na síndrome nefrótica experimental tem sido presume-se que o resultado da ativação do canal de sódio epitelial (ENaC) no túbulo distal por proteases de serina aberrantly filtrado como plasmina causando proteólise de sua subunidade de γ-^{4 ,11,12}. Recentemente, este conceito foi comprovado em ratos nefrótico que estavam protegidos de ativação proteolítica do ENaC e retenção de sódio pelo tratamento com a aprotinina de inibidor de protease serina que foi igualmente eficaz como o bloqueador de ENaC amilorida¹³. Para garantir a entrega contínua para o túbulo distal, aprotinina foi administrada através de liberação sustentada por via subcutânea implantado Pelotas. Futuros estudos são necessários para identificar as proteases de serina que são responsáveis pela ativação proteolítica do ENaC em síndrome nefrótica que é pensado para a situação humana em paralelo. Para este efeito, síndrome nefrótica induzida por doxorrubicina é um modelo valioso que pode ser usado em ratos do selvagem-tipo ou expandido para camundongos geneticamente modificados. Suas vantagens incluem o baixo custo da droga, menor complexidade de gestão e de boa reprodutibilidade¹⁴.

Neste artigo, demonstramos a indução de síndrome nefrótica experimental por injecção intravenosa rápida de doxorrubicina para o seio de retrobulbar e implantação de pellets de liberação sustentada contendo aprotinina para inibir urinária serina protease atividade, medida com um ensaio cromogênico.

Protocolo

Todos os métodos foram conduzidos de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e a lei alemã para o bem-estar dos animais, e que foram aprovadas pelas autoridades locais (Regierungspräsidium Tübingen).

1. indução de síndrome nefrótica Experimental por injeção de doxorrubicina para o seio de Retrobulbar

1. Prepare uma seringa de 0,5 mL, com uma cânula de 30g montado, marcando a posição de parada do pistão.
2. Calcule o volume de injeção de doxorrubicina para macho (7,25 µ l/g peso corporal (PC) igual a doxorrubicina de bw 14,5 µ g/g) e ratos fêmeas (6,9 µ l/g bw igual a doxorrubicina de bw 13,8 µ g/g), de acordo com o peso do corpo de manhã.
   Nota: A dose dada é adequada para indução de síndrome nefrótica. Pequenas alterações na dosagem originar um curso diferente crucial de nefropatia renal aguda falha (15,4 µ g/g bw a doxorrubicina)^{7, alcançando de doença renal crônica leve, com apenas pequenas mudanças na taxa de filtração glomerular (doxorrubicina de bw 12.6 µ g/g) 15}.
3. Aquecer a quantidade calculada de solução de doxorrubicina (2 µ g / µ l) em uma câmara quente de 37 ° C.
   Cuidado: Doxorrubicina é prejudicial se ingerido e pode causar câncer. Sempre use luvas se trabalhando com doxorrubicina e evitar qualquer contacto com a pele.
4. Prefill a seringa com a solução de doxorrubicina, até o ponto de marcação e defina o saldo zero. Encha a seringa com o volume de injeção e verificar o volume por pesagem da seringa.
5. Narcotize profundamente o mouse com 5 vol % isoflurano usando um vaporizador e o fluxo de oxigênio de 2 L/min.
   1. Não use pomada sobre os olhos antes da injeção. O operador precisa de uma visão clara da cavidade orbital para a realização de uma injeção retrobulbar segura e bem sucedida.
   2. Avaliar o nível de anestesia por reflexo pedal e ajustar anestésica entrega se necessário antes de iniciar a injeção.
6. Posicione o mouse em uma prostração lateral direita com o dorso voltado para o corpo do operador e sua cabeça virada para mão de injeção do operador.
   Nota: O procedimento é descrito por uma pessoa destra, para pessoas canhotas, realizando a injeção com a mão esquerda é mais fácil fazer a posição e injeção invertida direita para esquerda.
7. Cuidadosamente se projetam globo ocular esquerdo do mouse, da tomada de olho aplicando uma pressão suave para a pele, dorsal e ventral ao olho.
8. Punção do seio esquerdo retrobulbar do ângulo interno do olho (comissura palpebral medial). Evite qualquer contacto com o globo ocular mouse´s.
9. Ligeiramente, incline a seringa e injetar o volume inteiro de uma só vez. Certifique-se que o volume é injetado sem qualquer resistência e sem quaisquer sinais de extravasamento como exopthalmus ou escapamento do local da injeção.
10. Desde que a doxorrubicina é uma substância altamente tóxica, verifique bem estar pelo menos uma vez por dia usando uma folha de Pontuação de acordo com a Morton e Griffiths et al . ¹⁶ e pagar atenção especial para o local da injeção. Se há sinais de extravasamento como exopthalmus, fechamento da pálpebra prejudicada ou sinais de necrose como occure de lesões de pele ou inchaço após a injeção ou nos dias seguintes, o rato deve ser sacrificado.

2. a implantação de Pellets de liberação sustentada contendo aprotinina

1. Ordem de pelotas com a dose desejada por dia e lançamento duração antecipadamente. Em caso de aprotinina, escolha uma dose de 1 mg por dia para ser lançado durante 10 dias.
   Nota: Neste estudo, as pelotas de aprotinina contém uma dose de 10 mg.
   1. Armazenar as pelotas sob condições de seca e evitar qualquer exposição à umidade.
2. Prepare os itens necessários para a cirurgia, incluindo um par de tesouras de cabelo, um par de tesouras de preparação de pele, um bisturi, uma pinça cirúrgica, dois pares de pinças de tecido, um porta-agulha e 15 cm monofile sutura não absorvível.
   1. Esterilizar os instrumentos usando um esterilizador calor por 5 min a 240 ° C. Antes de utilizar os instrumentos, espere por 5 min até atingirem a temperatura ambiente.
      1. Evite qualquer contato de dicas de instrumento esterilizado para superfícies não estéreis.
      2. Evite queimadura da pele por instrumentos quentes.
3. Narcotize rato com isoflurano vol 5% seguido por 1,5% vol, usando um fluxo de 2 L/min vaporizador e oxigênio.
4. Coloque o mouse em posição em um dispositivo de aquecimento, coberto com uma camada de gaze para evitar lesões térmicas para o mouse. Temperatura da superfície é de cerca de 37 ° C.
5. Protege os olhos com pomada.
6. Remover o cabelo no meio, em uma área de aproximadamente 0,5 cm² usando uma tesoura ou um aparador de pelos e desinfectar a pele sem pelos com um desinfectante adequado para desinfecção da pele. Remova como menos cabelo possível, então fica mais difícil para o mouse atingir a ferida e thread termina mais tarde e para manter a temperatura do corpo.
7. Faça uma incisão na pele sem pelos com um bisturi em direção cranio-caudal de um comprimento de aproximadamente 5 mm. Prepare uma bolsa lateral esquerda de cerca de 1 cm de profundidade no tecido conjuntivo subcutâneo utilizando uma preparação sem corte.
   1. Avaliar o nível de anestesia por reflexo pedal e ajustar anestésica entrega se necessário antes de iniciar a cirurgia.
8. Insira uma pelota de lançamento de 10 dias a bolsa lateral esquerda preparada usando uma pinça estéril de tecido. Deixe o sedimento no fundo da bolsa em posição plana.
   1. Evite qualquer contato da pelota, para líquido e umidade até colocado na bolsa do preparado.
9. Feche a pele com suturas de 2-3. Só deixe pontas de fio muito curto para torná-lo mais difícil para o mouse abrir as suturas roendo.
10. Coloque os ratos individualmente para reduzir o desconforto pós-operatório e impedir a abertura das suturas roendo. Manter o mouse no modo de exibição até que recuperou a consciência suficiente após a narcose.
    Nota: Não há nenhuma necessidade para dor pós-operatória desde que esta intervenção é bem tolerada sem quaisquer sinais de desconforto ou dor. Alternativamente recomendamos analgésicos tópicos, por exemplo, uma gota de bupivacaína na incisão antes da sutura que forneceria até 8 h de analgesia.

3. avaliação pelo modelo de indução, sinais de síndrome nefrótica e bem-estar

1. Colete urina da manhã (08:00) em um copo de reação (1,5 mL) todos os dias a partir do dia da injeção por massageando a bexiga.
   1. Medir a proteinúria por meio de ensaio da proteína de Bradford e normalizar a creatinina.
      Nota: Para indução de síndrome nefrótica, proteinúria deve atingir um limiar de creatinina 120 mg/mg, entre 7 e 10 dia após a injeção de doxorrubicina.
2. Olhe para o desenvolvimento de ascite. Seleção para aumento da circunferência abdominal ou pendendo sobre os flancos.
3. Pese o mouse, as pelotas de alimento e o frasco bebendo de manhã (08:00) todos os dias.
4. Verifique bem estar pelo menos uma vez por dia, usando uma folha de Pontuação de acordo com a Morton e Griffiths et al. ¹⁶

4. medida da Protease de serina urinária com um ensaio cromogênico

1. Prepare a solução de substrato trabalho adicionando-se 15 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) para um frasco de 25 mg de liofilizado substrato cromogênico S-2251, produzindo uma concentração de 2 mM. Dissolva a aprotinina em PBS para obter uma solução de aprotinina com uma concentração de 2 mg/mL.
   1. Loja preparada soluções a-20 ° C. Isto retarda significativamente a autodegradação de S-2251. Não utilize soluções velhas com um tom forte de amarelo.
2. Usar a solução de trabalho de substrato recém preparada ou descongeladas e aquecê-lo em uma câmara de calor de 37 ° C.
3. Descongele as amostras de urina à temperatura ambiente.
   1. Prevenir a degradação de protease por evitar repetidos congelamentos e descongelamentos. Amostras de urina de armazenamento-20 ° c.
4. Use uma placa de 96 micropoços adequada para medição fotométrica. Adicionar 3 µ l de urina não diluída em cada um dos dois poços e adicionar 50 µ l de solução de trabalho de substrato com 3 µ l de solução de PBS ou aprotinina nos poços. Cubra o prato com um aferidor de placa.
5. Incube a placa coberta de microplacas por 60 min em uma câmara de calor de 37 ° C.
6. Medir a densidade óptica de cada poço a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.
7. Tome a diferença entre o OD sem aprotinina e com aprotinina como atividade de urinária sensíveis à aprotinina serina protease.
   Nota: Medição de uma amostra emparelhada com e sem aprotinina aumenta a especificidade do ensaio desde que o substrato também pode ser clivado por outras proteases que não desempenham um papel fisiopatológico.

Resultados

Após a indução de isoflurano narcose, doxorrubicina rapidamente foi injetada através do seio esquerdo retrobulbar. Todo o volume de 7,25 µ l/g bw foi injetado sem qualquer resistência e extravasamento provando corrigir localização venosa da cânula. O mouse recuperou de narcose rapidamente e não tinha nenhuma imparidade naquele dia e depois disso. Particularmente, não havia nenhum sinal de danos no olho esquerdo. Depois de doxorrubicina injeção, comida e líquido consumo caiu ...

Discussão

Aqui, demonstramos que a injeção de doxorrubicina através da injeção de sinus retrobulbar induz síndrome nefrótica experimental em ratos 129S1/SvImJ com proteinúria, retenção de sódio, hypoalbumenia e hiperlipidemia. No entanto, existem dois problemas críticos que devem ser levadas em conta ao usar este modelo. Em primeiro lugar, a indução de modelo estritamente é dose dependente e desvios da dose de doxorrubicina tão pequena quanto 0,3 µ g/g afetam a resposta dos ratos¹⁵. Quando ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
supplies
BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm)	BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany	PZN: 07468060	syring
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm)	Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany)	EH7823H	suture
Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg)	LOXO, Heidelberg, Germany	CAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und Nasensalbe	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	PZN: 1578681	ointment
Chromogenix S-2251	HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany	82 0332 39	chromogenic substrate
doxorubicin (2.0 µg/µL)	Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany	CAS 25316-40-9	doxorubicin
isofluran CP (1 mL/mL)	CP-Pharma, Burgdorf, Germany	CAS 26675-46-7	isofluran
pellets with matrix-driven sustained release (custom-made)	Innovative Research of America, Sarasota, FL	X-999	pellet
Name	Company	Catalog Number	Comments
equipment
ELx808 Absorbance Mikroplate Reader	BioTek, Bad Friedrichshall, Germany	ELx808	microplate reader
MICROSTERIL - 436	B.M.S., Trescore Balneario, Italy	GAL/436	sterilizer
Hybridization oven/shaker	GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK	RPN 2511	heat chamber
Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile	Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany	61201	mouse warming device