JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Resumo

Trans-diferenciação do tipo de uma célula somática em outro tem um enorme potencial para modelar e tratar doenças humanas. Estudos anteriores mostraram esse rato embrionárias, fibroblastos dérmicos e cardíacos podem ser reprogramados em células-induzida-casos-como funcionais (iCMs) pela superexpressão de fatores de transcrição cardiogênico incluindo GATA4, Hand2, Mef2c, e Tbx5 tanto in vitro e in vivo. No entanto, esses estudos anteriores têm mostrado eficiência relativamente baixa. A fim de restaurar a função cardíaca após lesão, os mecanismos que regem a reprogramação cardíaca devem ser elucidados para aumentar a eficiência e a maturação de iCMs.

Demonstramos anteriormente que a inibição da sinalização pró-fibróticos dramaticamente aumenta a eficiência de reprogramação. Aqui, detalhamos os métodos para alcançar uma eficiência de reprogramação de até 60%. Além disso, descrevemos vários métodos, incluindo citometria de fluxo, imunofluorescência imagem e imagem latente de cálcio para quantificar a reprogramação eficiência e maturação dos fibroblastos reprogramadas. Usando o protocolo detalhado aqui, podem ser realizados estudos mecanicistas para determinar os reguladores positivos e negativos de reprogramação cardíaca. Estes estudos podem identificar caminhos de sinalização que podem ser direcionados para promover a reprogramação eficiência e maturação, o que poderia levar a terapias celulares novela para tratar a doença de coração humana.

Introdução

Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte no Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 americanos experimentam um primeiro ou recorrente do miocárdio (MI) por ano1. MI, na sequência da morte de cardiomyocytes (CMs) e Fibrose cardíaca, depositados por fibroblastos cardíacos registrados, afectar o coração função2,3. Progressão da insuficiência cardíaca após MI é em grande parte irreversível devido a pobre capacidade regenerativa do adulto CMs4,5. Enquanto atuais terapias clínicas retardar a progressão da doença e diminuem o risco de futuros eventos cardíacos6,7,8,9, sem terapias reverter a progressão da doença, devido à incapacidade de regenere o CMs pós-infarto10. Terapias celulares romance surgem para tratar pacientes seguindo mi decepcionante, ensaios clínicos, entregando as células-tronco para o coração após MI até agora mostraram-se inconclusivos regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas humanos-derivado (hiPSCs) de fibroblastos pela superexpressão de quatro fatores de transcrição, primeiramente demonstrado por Takahashi & Yamanaka, abriu as portas para novos avanços na terapia de célula19. Estas células podem se diferenciar em todas as três camadas germinativas19, e vários métodos altamente eficientes para gerar um grande número de CMs têm demonstrados anteriormente20,21. HiPSC-derivado CMs (quadris-CMs) oferece uma plataforma poderosa para estudar cardiomyogenesis e pode ter implicações importantes para reparar o coração após lesão. No entanto, quadris-CMs atualmente enfrentam obstáculos translacionais devido a preocupações de teratoma formação22, e sua natureza imatura pode ser pro-arrhythmogenic23. Reprogramação de fibroblastos em hiPSCs despertou interesse em diretamente reprogramação de fibroblastos em outros tipos de células. Ieda et al demonstraram que superexpressão de GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) em resultados de fibroblastos em reprogramação direta linhagem cardíaca, embora a baixa eficiência24. Reprogramação de eficiência foi melhorado com a adição de Hand2 (GHMT)25. Desde os primeiros estudos, muitas publicações têm demonstrado que, alterar o coquetel fator reprogramação com transcrição adicional fatores28,de27,26,29, cromatina modificadores30,31, microRNAs32,33ou34 leva à melhoria de moléculas pequenas reprogramação eficiência e/ou maturação das células de casos-como induzidas (iCMs ).

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar iCMs de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) com alta eficiência. Anteriormente mostramos que o GHMT cocktail é significativamente melhorado com a adição de miR-1 e miR-133 (GHMT2m) e é melhorada quando pró-fibróticos inclusive transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização de vias de sinalização ou associadas a Rho vias de sinalização da proteína quinase (ROCK) são inibidas35. Usando este protocolo, mostramos que aproximadamente 60% das células express T de troponina cardíaca (miocardite), aproximadamente 50% express α-actinin, e um elevado número de células de batida pode ser observado logo em dia 11 transdução de reprogramação de fatores e o tratamento a seguir com o TGF-β tipo I inibidor do receptor A-83-01. Além disso, esses iCMs expressam proteínas de junção gap incluindo connexin 43 e apresentam contração espontânea e transientes de cálcio. Esta marcada melhoria na eficiência em comparação com estudos anteriores de reprogramação demonstra o potencial para regenerar CMs de populações de células endógeno que permanecem no infarto de pós coração.

Protocolo

Todas as experiências que exigem animais foram aprovadas pelo Comitê de uso no Campus médico da UC Denver Anschutz e institucional Cuidado Animal.

1. isolamento de MEFs

  1. Compra de ratos grávidas C57BL/6 no E13. Navio durante a noite.
  2. Eutanásia-a mãe de acordo com protocolos aprovados IACUC (ex: ~1.3 L/min de CO2 até animal aparece morto seguido por deslocamento cervical)
  3. Pulverizar a mãe com 70% de etanol e abrir a cavidade abdominal. Remover o corno uterino contendo embriões e coloque em um prato de 10 cm com PBS estéril.
  4. Fazer uma incisão no saco do embrião para liberar o embrião. Transferi o embrião para limpar o prato de 10 cm com PBS estéril. Enxague abundantemente.
  5. Corte o corpo abaixo do fígado e elimine a cabeça e parte superior do corpo. Remover os órgãos internos e descarte. Transferir o tecido remanescente para um prato limpo 10cm com PBS estéril e transferir a placa para um nível de biossegurança 1 ou 2 do armário. Combine os tecidos de todos os embriões em um prato limpo e seco de 10 cm e picar em pedaços bem.
  6. Adicione 6 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para embriões picados. Triture várias vezes com uma pipeta para romper o tecido. Incube durante 40 min a 37 ˚ c com 5% de CO2.
  7. Ressuspender as células em meio de crescimento (tabela 1). O volume de mídia é ajustado com base no número de embriões colhidos. Em geral, use uma proporção de aproximadamente meio de crescimento 25 mL por 1,2 embriões.
  8. Placa 25 mL de células ressuspensa em um prato de 15 cm. Após 24h, aspirar a mídia e adicionar 25 mL de meio de cultura fresco para cada placa.
  9. Depois de 72 h, adicione 2 mL de 0,25% tripsina/1 mM EDTA para cada prato de 15 cm. Quando células desanexe o prato de cultura, inativar tripsina com 15 mL de meio de crescimento e recolher pilhas em poliestireno tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar as células para 3 min a 160 x g , à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células em meio de crescimento e filtro através de um filtro de célula 70 µm poro.
  10. Contar as células usando um hemocytometer e congelar MEFs em alíquotas de 2 milhões de células em meio de congelamento (DMSO 10%, 25% FBS em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) / alta glicose) a-80 ° C. Transferência de células para nitrogênio líquido após 24h e loja até estar pronto para usar.
    Nota: A expressão gênica Global em MEFs foi perfilado isolado usando este protocolo por sequenciação do ARN (RNA-seq) para garantir a autenticação de célula. RNA-seq dados de células codificar MEF foram baixados do NIH Gene Expression Omnibus (GEO) com o número de adesão GSE93454. Dados da expressão do gene do RNA-seq para os MEFs usados por nós foram depositados no NIH GEO com número de adesão GSE71405. De acordo com símbolos comuns do gene, fundiram-se estes dois conjuntos de dados. Os dados de expressão foram então log-transformados e um gráfico de dispersão dos dados de expressão para nosso MEFs e ENCODE MEFs foram gerados e ajuste com uma linha de regressão linear (figura 1A). MEFs isolados usando este protocolo são molecularmente similares àqueles isolados por outros laboratórios.

2. produção de retrovírus e transdução de MEFs

Nota: Todas as etapas desta seção devem ser efectuadas em um armário de 2 do nível de biossegurança. Desde que este protocolo utiliza a transdução retroviral, certifique-se que sejam tomadas precauções, incluindo tratamento de que todos os resíduos contendo mídia viral com 10% de lixívia pelo menos 20 min. consulte a figura 1B para um cronograma para reprogramação a segurança.

  1. Produção de retrovírus usando a linha de celular de platina E (PE)
    1. Manter disponíveis comercialmente células PE PE médio (tabela 1) contendo blasticidin e puromicina seleção marcadores para garantir a expressão de amordaçar-pol e env genes para a produção eficiente de partículas retroviral36 . Células de passagem a 1:4 ou 1:5 em dois dias. Tome cuidado para evitar a superlotação das células, pois isto pode reduzir rendimentos de produção retroviral.
    2. No dia -1, semente aproximadamente 5 x 106 células por prato de 10cm no meio de crescimento (tabela 1), 16-20 h antes do transfection (ver tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão). Delicadamente rock pratos e para trás várias vezes e coloque cuidadosamente em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora para assegurar mesmo distribuição de chapeamento (ver Figura 1 para chapeamento ideal de densidade antes do transfection).
      Nota: tenha cuidado para células de PE placa no meio livre de marcadores de seleção antes de Transfeccao para garantir meio contendo partículas retrovirais geradas não mata MEFs.
    3. No dia 0, prepare DNA para transfeccao. Para transfeccao de prato 10cm, adicionar 2 µ g de cada fator reprogramação — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) — para um tubo de 1,5 mL.
      Nota: Consulte a tabela 2 para dimensionar a quantidade de DNA necessária para transfect outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão.
    4. Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 360 µ l soro reduzida mídia. Em seguida, adicione 36 reagente de transfeccao µ l diretamente para a mídia de soro reduzida. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
      Nota: Para evitar a eficiência reduzida do transfection, adicione cuidadosamente reagente de transfeccao diretamente para a mídia de soro reduzida.
    5. Adicione mistura de reagente de transfeccao/mídia de soro e reduzida ao DNA GHMT2m cocktail. Delicadamente, agite o tubo e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Fazer não o vórtice.
    6. Adicione a mistura de reação gota a gota para células de PE, suavemente redemoinho mídia para 10-15 s e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
      Nota: De acordo com o fabricante, células PE geram uma concentração média de 106 107 infecciosas unidades/ml. Este protocolo gera aproximadamente 2 x 106 infecções unidades/mL por 24 h e 6 x 106 infecções unidades/mL por 48 h para uma média de 4 "moi". Transfecção de GFP/DsRed também pode ser utilizada como um substituto para eficiência de transfeccao/transdução se desejado; eficiência de transfeccao deverá ultrapassar 90% por 48 h (Figura 1).
  2. Transdução de MEFs
    1. No dia 0, casaco pratos com colágeno e coloque em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora pelo menos 2 h.
    2. Remova MEFs de degelo e nitrogênio líquido. Placa de 0,2 x 106 células por prato de 60 mm no meio de crescimento. Delicadamente placas de pedra para garantir até mesmo a distribuição de chapeamento e colocar na incubadora (ver Figura 1 para densidade ideal do chapeamento e tabela 2 para chapeamento densidades para outros tamanhos de prato de cultura de célula padrão).
      Nota: Estas densidades de chapeamento foram testadas ao longo de vários lotes de MEFs isolados; a menos que a exibição de MEFs significativamente comprometida viabilidade, ajustar a célula densidades de semeadura não é necessário.
    3. No dia 1, pós-transfecção 24 h, use uma seringa de 30 mL para coletar retroviral médio gerado pelas células de PE. Passe o meio através de um filtro de tamanho de poro 0,45 µm para um tubo cónico de 50 mL. Adicione o reagente de Transfeccao de brometo de hexadimethrine para uma concentração final de 6 µ g/mL. Cuidadosamente, adicione 10 mL de meio de crescimento fresco às células de PE pela mídia pipetagem das buchas do prato cultura para evitar o deslocamento das células.
    4. Aspire o meio de MEFs e adicionar 4 mL de meio de retroviral recém-colhidas para cada prato. Retorno MEFs para a incubadora. Adicione água sanitária 10% para todos os materiais em contacto com o meio viral para neutralizar partículas retrovirais.
    5. No dia 2, pós-transfecção 48 h, repita os passos 2.2.2 e 2.2.3. Células de PE são descartadas após a coleção 2nd do meio retroviral.
      Nota: Adicione 10% de lixívia para células de PE descartadas pelo menos 20 min neutralizar o retrovírus indesejados.
    6. No dia 3, Aspire o meio de MEFs e reabasteça com 4 mL de meio de iCM (tabela 1) contendo 0,5 µM A-83-01 uma TGF-β tipo I inibidor do receptor. Reabastecer o iCM médio contendo A-83-01 a cada 2 dias.
      Nota: Se utilizar as boas práticas agrícolas como um controle de transdução, a expressão deverá ultrapassar 90% por esse ponto do tempo (Figura 1).

3. citometria de fluxo para marcadores cardíacos

  1. Aspirado médio de 9 dia reprogramado MEFs e lavagem (1x) com PBS 1x para remover detritos e células mortas.
  2. Adicione 1 mL 0,25% tripsina/EDTA por 5 min em 37 ˚ c. Verifique as células usando um microscópio de luz e agitar o prato; Se as células continuam a ser anexadas, incube mais 5min em 37 ˚ c até células desanexar.
  3. Lavam-se células em 1X PBS contendo 5% FBS e filtrar através de um filtro de célula 70 µm poro.
  4. Centrifugar a 160 x g por 3 min em temperatura ambiente e aspirar líquido da pelota.
    Nota: Para aumentar o rendimento da célula, deixe o líquido de cerca de 50 µ l acima o centrifugado.
  5. Lavam-se células com 500 µ l 1X PBS contendo 1% de BSA.
  6. Solução de fixação por 20 min Fix células com 0,2 mL 1 milhão de células no gelo.
  7. Adicione 1 mL de tampão de perm/lavagem gelada de 1x.
    Nota: A solução do fabricante é de 10x.
  8. Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C e aspire o sobrenadante.
  9. Repita as etapas de 3.7 e 3.8 um tempo adicional. Após a lavagem de 2nd , prossiga diretamente para a próxima etapa ou manter células a 4 ° C durante a noite.
  10. Bloco com 100 µ l de soro de cabra de 5% e soro de burro em 1x tampão de perm/lavagem por 30 min à temperatura ambiente.
  11. Adicione 100 µ l de anticorpo primário diluído.
    Nota: Para o presente protocolo, as células foram rotuladas com mouse troponina T (1: 200) e rato α-actinin (1: 200) para quantificar a porcentagem de células positivas para componentes-chave do sarcômero cardíaco. Incube o anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.
  12. Centrifugar as células a 160 x g durante 5 m a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.
  13. Adicione 100 µ l de anticorpo secundário diluído.
    Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com anti-rato 647 nm anticorpo secundário (1: 200). Incube o anticorpo secundário por 45 min à temperatura ambiente em um rotador extremidade-sobre-extremidade do tubo. Protege as células de luz envolvendo tubos em folha.
  14. Centrifugar as células a 160 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e lavar 2x com tampão de perm/lavagem gelada.
  15. Adicionar 1 mL de 1% de BSA em PBS e executar FACS imediatamente.
    Nota: Gere um avanço vs lado dispersão de dispersão para portão células viáveis primeiro ao executar FACS. Alternativamente, use uma mancha comercialmente disponível ao vivo/morto célula antes da fixação de células para identificar ao vivo e morto populações de células.

4. imunocoloração de MEFs reprogramadas

  1. Meio, aspirado por dia 14 reprogramado MEFs e lavagem (1x) com 1 mL 1 x PBS gelado.
    Nota: Para imunocoloração, reprogramação foi realizada em 12 placas bem para minimizar o volume de solução de anticorpos. 24 placas bem também podem ser utilizadas; simplesmente metade de todos os volumes a seguir.
  2. Aspire e reparar células com paraformaldeído de 2% 500 µ l para 10 min à temperatura ambiente.
  3. Aspirar e lavar as células 3 vezes com PBS 1x de 1 mL (5 min por lavagem à temperatura ambiente).
  4. Permeabilize células com 500 µ l 0,2% permeabilização reagente em PBS por 15 min à temperatura ambiente.
  5. Aspire e blocos em 500 µ l soro 10% cavalo em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
  6. Aspire e incubar com 500 µ l do anticorpo primário diluído por 1h à temperatura ambiente.
    Nota: Para este protocolo, células foram rotuladas com mouse troponina T ou α-actinin (cada 1: 400) e co rotuladas com Connexin 43 (1: 400) ou troponina eu (1: 400).
  7. Aspire o anticorpo primário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente).
  8. Aspire e incubar com anticorpo secundário diluído de 500 µ l por 1 hora em temperatura ambiente.
    Nota: Para este protocolo, as células foram rotuladas com o anti-rato 555 nm anticorpo secundário (1:800) para reconhecer a troponina T ou α-actinin e anticoelho 488 nm anticorpo secundário (1:800) reconhecer Connexin 43 ou troponina I. Além disso, núcleos foram corados com Hoechst (01:10, 000). Protege as células de luz incubando no escuro.
  9. Aspirar o anticorpo secundário e lavar três vezes com 1 mL 1X PBS (5 min por lavagem à temperatura ambiente). Enrole a placa com papel de alumínio para proteger células de luz e armazenar a 4 ° C.
  10. Imagem usando microscopia de epifluorescência de três canais.

5. cálcio Imaging

Nota: Se de imagem com ampliação de 10x, pratos e pratos de cultura de célula padrão são adequados para a imagem latente de cálcio. Imaging na maior ampliação exige que células ser banhado em lamelas de vidro ou pratos de fundo de vidro.

  1. Aspire médio e adicionar 2 mL (para uma 6 placa bem) modificado solução de Tyrode (140 mM de NaCl, KCl, 1.8 mM CaCl2, de 5 mM 1 mM MgCl2, glicose 10 mM, 10 mM HEPES, 0,1% BSA e 1% de piruvato, pH 7,4) contendo 5 µM Fura-2 estou e 0,1% Pluronic F-127 para bater (D14 t o D20) iCMs. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
    Nota: Protege células de luz para evitar a têmpera do indicador fluorescente.
  2. Lavam-se células em solução de Tyrode 2 mL por 30 min à temperatura ambiente para permitir que a esterificação de Fura-2 AM.
  3. Imagem com fiação microscopia confocal disco a 340 nm e 380 nm, utilizando Slidebook 5.5 Ca2 + software de imagem. Execute a imagem à temperatura ambiente.
  4. Transientes de cálcio são calculados usando a relação de intensidade de fluorescência a 340 nm sobre a intensidade de fluorescência em 380 nm.
  5. Se desejado, tratar de iCMs com 1 ou 2 µM isoproterenol ou 10 µM nifedipina para manipular cálcio manipulação após a imagem transientes de cálcio de linha de base. Adicione compostos localmente para as células e imagem.

Resultados

Usando a estratégia de reprogramação descrita acima e na figura 1B, geramos iCMs com aproximadamente 70% das células expressando T de troponina cardíaca e aproximadamente 55% das células expressando cardíaca α-actinin, quantificada por citometria de fluxo no dia 9 transdução de GHMT2m a seguir (Figura 2A e B). Além disso, a maioria das células express cardíaca troponina T, troponina e α-actinin card...

Discussão

O presente estudo descreve uma estratégia de alta eficiência para reprogramar diretamente fibroblastos em iCMs funcional através de entrega de GHMT2m fatores combinados com a supressão das vias de sinalização pró-fibróticos de reprogramação. Utilizando citometria de fluxo, imagem latente de imunofluorescência, cálcio imaging e bater a contagem de células, vamos mostrar a maioria das células no presente protocolo submetido a reprogramação bem sucedida e adotar o destino de linhagem CM. Mostramos anteriorme...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por fundos da Fundação Boettcher Webb-Waring biomédica pesquisa programa, americano coração Associação cientista desenvolvimento Grant (13SDG17400031), Universidade do Colorado departamento medicina pendentes do início de carreira Programa acadêmico, Universidade de Colorado divisão de Cardiologia Barlow Nyle doação e NIH R01HL133230 (para Klein). A.S.R foi apoiada pelo NIH/NCATS Colorado CTSA Grant número TL1TR001081 e uma bolsa doutorandos do consórcio Universidade do Colorado para pesquisa de fibrose & tradução (CFReT). Esta pesquisa foi apoiada também pela concessão de apoio do centro de câncer (P30CA046934), a concessão de núcleos de investigação de doenças pele (P30AR057212) e o núcleo de citometria de fluxo no Campus Anschutz-médica da Universidade do Colorado.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 MiceCharles River's Laboratory027For MEF isolation
Platinum E (PE) CellsCell Biolabs, INCRV-101For retrovirus production
DMEM High GlucoseGibcoSH30022.FSComponent of iCM, PE, and Growth media
Medium 199Life Technologies11150-059Component of iCM media
Fetal Bovine SerumGemini100106Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse SerumGemini100508 500Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50XLife Technologies11130051Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100XLife Technologies11360070Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100XLife Technologies11140050Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100XLife Technologies11120-052Component of iCM media
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045Component of iCM media
B27Gibco17504-044Component of iCM media
Penicilin-StreptomycinGibco15140-122Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)Gibco35050-061Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03Component of PE media
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-056For detaching cells from culture dishes
A-83-01R&D Systems - Tocris2939/10Treat cells to inhibit TGF-β signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSOThermo Scientific85190For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoatCellutronSC-9035For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2692Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco11058-021Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2cPlasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFPPlasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268-5GFor viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores)Nalgene 569-0020 For filtering media
SyringesBd Vacutainer Labware 309654For viral filtration
0.45 µm FiltersCelltreat229749For viral filtration
70 µm cell strainersFalcon 352350For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer BD554723For washing cells for flow cytometry
DPBS 1XGibco14190-250For washing cells
Bovine Serum AlbuminVWR0332-100gFor flow cytometry and calcium imaging
Goat SerumSigma G9023For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey SerumSigmaD9663-10mgFor blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Rabbit Troponin IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488, rabbitLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555, mouseLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647, mouseLife TechnologiesA-315711:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer Bio-RADFor FACS
ParaformaldehydesigmaP6148-500mgFor fixing cells for IF
Triton X-100PromegaH5142For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging SystemThermo ScientificAMEFC4300For IF
NaClRPIS23020-5000For calcium imaging
KClVWR395For calcium imaging
CaCl2FisherC614-500For calcium imaging
MgCl2VWR97061-352For calcium imaging
glucosesigmaG7528-250gFor calcium imaging
HEPESsigmaH4034-500gFor calcium imaging
Fura-2 AMLife TechnologiesF1221For calcium imaging
Fluronic F-127SigmaP2443-250gFor calcium imaging
NifedipineSigmaN7634-1GFor disruption calcium transients in iCMs - use at 10 µM
IsoproterenolsigmaI6504-1gFor increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope3iFor calcium imaging
ethanolDecon Laboratories2801
bleachClorox
50 mL conical tubesGREINER BIO-ONE227261
15 mL conical tubesGREINER BIO-ONE188271
15 cm cell culture dishesFalcon353025
10 cm cell culture dishesFalcon353003
60 mm cell culture dishesGREINER BIO-ONE628160
6 well cell culture platesGREINER BIO-ONE657160 
12 well cell culture platesGREINER BIO-ONE665180 
24 well cell culture platesGREINER BIO-ONE662160 

Referências

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Do desenvolvimento card aco de biologiaquest o 136reprograma ofatores de transcri omicroRNAspr fibr ticos sinaliza ocompostoinibidor de receptor 1 do TGF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados