Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Resumo

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Resumo

FM de corantes são usados para estudar o ciclo da vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfifílicos têm uma cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, tornando-os solúveis em água, com a capacidade reversível, entrar e sair bilayers do lipid da membrana. Estes corantes styryl são relativamente não-fluorescente em meio aquoso, mas causa a inserção no folheto externo da membrana plasmática um > 40 X aumento da fluorescência. Nas sinapses neuronais, FM corantes são internalizados durante a endocitose SV, traficada dentro e entre pools de SV e liberada com exocitose SV, fornecendo uma ferramenta poderosa para visualizar pré-sináptica estágios da neurotransmissão. Um modelo genético primário de glutamatérgico sinapse desenvolvimento e função é a Drosophila junção neuromuscular (JNM), onde FM tingir de imagem tem sido amplamente utilizada para quantificar a dinâmica do SV em uma ampla gama de condições mutantes. O terminal sináptico Nicotínico é facilmente acessível, com uma bela matriz de boutons sinápticas grandes ideais para aplicativos de imagem. Aqui, podemos comparar e contrastar as três maneiras de estimular a drosófila MNJ dirigir atividade dependente FM1-43 tintura absorção/liberação: aplicativo 1) banho de alta [K⁺] para despolarizar tecidos neuromusculares, 2) nervo motor do eletrodo de sucção estimulação para despolarizar o nervo pré-sináptica terminal e 3) alvo transgénico expressão de variantes de channelrhodopsin para controle de luz-estimulada, espacial de despolarização. Cada um desses métodos tem vantagens e desvantagens para o estudo dos efeitos de mutação genética sobre o ciclo SV na drosófila MNJ. Discutiremos essas vantagens e desvantagens para ajudar a seleção da abordagem de estimulação, juntamente com as metodologias específicas para cada estratégia. Além de imagens fluorescentes, corantes de FM podem ser photoconverted aos sinais de elétron-densa visualizado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para estudar mecanismos de ciclo SV a nível ultraestrutural. Nós fornecemos as comparações de confocal e microscopia eletrônica de imagens de diferentes métodos de estimulação de Drosophila JNM, para ajudar a guiar a seleção dos futuras paradigmas experimentais.

Introdução

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas¹. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas². Essas vesículas ancorar na membrana pré-sináptica de plasma fusão local ativo zonas (AZs), onde a exocitose Medeia a liberação do neurotransmissor glutamato para trans-comunicação sináptica. Posteriormente, as SVs são recuperadas da membrana plasmática através do beijo e executar reciclagem ou endocitose mediada por Clatrina (CME) por ciclos repetidos de exo/endocitose. A Drosophila Nicotínico é facilmente acessível e adequado para isolar e caracterizar os mutantes de ciclo SV. Usando telas de genéticas para a frente, mutações romance conduziram à identificação de novos genes críticos para o ciclo SV³. Além disso, abordagens de genéticas reversos começando com genes já conhecidos conduziram para a elucidação de novos mecanismos de ciclo SV através a cuidadosa descrição do mutante ciclismo fenótipos⁴. A Drosophila Nicotínico é quase ideal como uma preparação experimental sináptica para dissecar os mecanismos de endocitose e exocitose SV via métodos de opticamente vesículas de pista de ciclismo durante a neurotransmissão.

Uma gama de marcadores fluorescentes permitem rastreamento visual das vesículas durante a ciclagem dinâmica, mas o mais versátil é análogos de tintura de FM que é sintetizado pela primeira vez Mao, F., et al. ⁵. estruturalmente, FM corantes contêm uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectado através de um anel aromático, com uma região central, conferindo Propriedades espectrais. Estes styryl corantes particionar reversível em membranas, não 'perder um combate' entre membrana folhetos e nunca são tão livre no citosol e são muito mais fluorescente em membranas de água⁵. Inserção reversível em uma bicamada lipídica provoca um 40-fold aumento na fluorescência⁶. Em sinapses neuronais, clássico FM tintura etiquetando as experiências consistem em banhar a preparação sináptica com o corante durante despolarizantes estimulação para carregar corante através de endocitose SV. Tintura externa é então lavada e o ciclo SV é preso em uma solução de ringer livre de cálcio a imagem carregada sinapses⁷. Uma segunda ronda de estimulação em um banho sem corantes provoca a liberação de FM por exocitose, um processo que pode ser seguido por medição a diminuição de intensidade de fluorescência. Populações de SV de uma única vesícula para piscinas contendo centenas de vesículas podem ser monitorada quantitativamente^6,7. Corantes de FM têm sido utilizados para dissecar dependente da atividade de mobilização das piscinas SV funcionalmente distintas e para comparar beijo e executar vs CME ciclismo^8,9. O método foi modificado para separadamente do ensaio evocado, espontânea e miniatura sináptica ciclo de atividades (com equipamento altamente sensível para detectar alterações de fluorescência muito pequenas e reduzir fotobranqueamento)¹⁰. Ensaios podem ser estendidos ao nível ultraestrutural por photoconverting o sinal de FM fluorescente em um rótulo de elétron-densa para transmissão microscopia eletrônica^11,12,13,14 .

Historicamente, banho preparações sináptica em uma alta concentração de potássio (doravante referida como "alta [K⁺]") tem sido o método de escolha para despolarizar a estimulação para induzir SV ciclismo; que vão desde o sapo colinérgico Nicotínico⁵, a culta neurônios hippocampal cérebro de roedor¹⁵, para a Drosophila glutamatérgico MNJ modelo^16,17. Esta abordagem de [K⁺] alta é simples, exige nenhum equipamento especializado e, portanto, é acessível para a maioria dos laboratórios, mas tem limitações para aplicação e interpretação dos dados. Um método muito mais fisiologicamente apropriado é usar sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo^4,5,12. Essa abordagem conduz a propagação do potencial de ação para estimulação direta do nervo pré-sináptica terminal, e os resultados podem ser directamente comparados a ensaios eletrofisiológicos de neurotransmissão função^{13,14, 15}, mas requer equipamento especializado e é tecnicamente muito mais desafiador. Com o advento da optogenetics, o uso da estimulação neuronal channelrhodopsin tem vantagens adicionais, incluindo controle spatiotemporal apertado de expressão de canal usando o binário Gal4/UAS sistema²⁰. Esta abordagem é tecnicamente muito mais fácil do que a estimulação de sucção eletrodo e requer nada mais do que uma fonte de luz LED muito barata. Aqui, nós empregamos imagem de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibrometo de piridínio) tanto a comparar e contrastar esses três métodos diferentes de estimulação para a Drosophila MNJ: alta simples [K⁺ ], desafiando channelrhodopsin elétricos e novas abordagens.

Protocolo

1. larval cola dissecação

1. Misture bem 10 partes de elastómero de silicone base com 1 parte de elastômero de silicone, agente do kit de elastômero (Tabela de materiais) de cura.
2. Revestir as lamelas de vidro de 22 x 22 mm com o elastômero e cura em um prato quente em 75 ˚ c durante várias horas (até já não pegajoso ao toque).
3. Coloque uma lamela de vidro revestido de elastômero único na câmara de dissecação de vidro plexi sob medida (Figura 1, inferior) em preparação para a dissecação larval.
4. Prepare as pipetas de cola de vidro de borosilicato capilar usando um extrator de microeletrodos padrão para obter o ângulo desejado e tamanho de ponta.
5. Suavemente, quebrar a ponta da micropipeta e a outra extremidade, anexar 2 pés de tubo de plástico flexível (1/32" diâmetro interior, ID; 3/32" diâmetro, OD externo; 1/32" parede; Tabela de materiais) com boca de encaixe (ponta da pipeta P2).
6. Encha um pequeno recipiente (tampão de tubo de Eppendorf de 0,6 mL) com um pequeno volume (~ 20 µ l) de cola (Tabela de materiais), em preparação para a dissecação larval.
7. Encha a câmara com solução salina (em mM): NaCl 128, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarose e pH ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) 7.2.
8. Adicionar rabanete de anti-cavalo peroxidase (HRP) anticorpo conjugado com Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluir 01:10 de um estoque de 1 mg/mL) para rotular o MNJ pré-sináptica terminal durante a dissecação^21,22.
9. Usando um pincel fino (tamanho 2), retire um errante terceiro instar o frasco de comida e coloque sobre o vidro de tampa revestida de elastômero.
10. Encha a ponta de micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola usando pressão de ar negativa gerada pela boca com acessório (passo 1.5).
11. Posição larva dorsal para cima com fórceps e cola a cabeça para a lamela de elastómero revestida com uma pequena gota de cola usando pressão de ar pela boca.
12. Repita este procedimento com a extremidade posterior da larva, certificando-se de que o animal é esticado esticado entre os dois acessórios de colagem.
13. Usando a tesoura (lâminas 3 mm; Tabela de materiais), fazer um corte horizontal (~ 1 mm) na parte posterior e um corte vertical ao longo da linha mediana dorsal.
14. Usando a pinça fina (n º 5, Tabela de materiais), gentilmente remover a traqueia dorsal, intestino, gordura corporal e outros órgãos internos cobrindo a musculatura.
15. Repita o procedimento de colagem para as quatro abas de parede corporal, certificando-se de esticar suavemente a parede do corpo, tanto horizontal como verticalmente.
16. Levante o cabo ventral do nervo (VNC) usando fórceps, corte com cuidado os nervos motores com a tesoura e então remover completamente o VNC.
17. Substitua o soro fisiológico dissecação Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (mesmo que o soro de dissecação acima sem o CaCl₂) parar SV ciclismo.

2. opção 1: Carregamento de tintura FM alta [K⁺]

1. De uma solução stock de FM1-43 (4mm), adicione 1 µ l a 1 mL de solução de KCl (alta [K⁺] em solução salina de dissecação) para uma concentração final de 4 µM de 90 mM.
2. Utilizando uma pipeta, substituir o Ca^{2 +}-soro livre na câmara de imagens com a solução de corante [K⁺] FM alta para incentivar a adopção de tintura SV endocitose.
3. Imediatamente iniciar um timer digital para a duração pré-determinada da alta [K⁺] despolarizantes período de estimulação (ex., 5 min; A Figura 2).
4. Para confirmar uma preparação larval saudável, observe as fortes contrações da musculatura para a duração do período de despolarização de alta [K⁺].
5. Quando terminar o período de temporizador, rapidamente remover a solução de corante [K⁺] FM alta e substitua por Ca^{2 +}-livre solução salina para parar SV ciclismo.
6. Lavar em rápida sucessão com o Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de corante [K⁺] FM alta é completamente removida.
7. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.

3. imagem latente: Microscopia Confocal

1. Use um microscópio confocal vertical com um 40 X objetivo de imersão de água de imagem MNJ tintura da fluorescência (outros microscópios podem ser usados).
2. Imagem 4 MNJ dos segmentos abdominais (outros NMJs podem ser fotografadas) 2-4 do músculo e coletar imagens usando o software apropriado (Tabela de materiais).
3. Com aqui vai 633 nm laser para excitar HRP:647 (com filtro passa-long > 635 nm) e um laser de argônio 488 nm para excitar FM1-43 (com bandpass filtro 530-600 nm).
4. Operacionalmente, determine ganho ideal e o deslocamento para ambos os canais.
   Nota: Essas configurações permanecerá constantes durante todo o resto do experimento.
5. Pegue uma pilha-Z confocal através o MNJ selecionado inteiro da parte superior de HRP-marcado para baixo do terminal sináptico.
6. Tome nota cuidadosa o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o excesso para a exata mesma MNJ depois FM tingir a descarga.

4. alta [K⁺] estimulação: FM tintura descarga

1. Substitua Ca^{2 +}-livre solução salina com a alta [K⁺] soro fisiológico (sem tintura FM1-43) a despolarização da unidade, liberação de exocitose e tintura SV.
2. Imediatamente, iniciar um timer digital para o período pré-determinado de [K⁺] alta estimulação (ex., 2 min; A Figura 2).
3. Quando terminar o período de temporizador, imediatamente remover o soro [K⁺] alto e substitua por Ca^{2 +}-livre solução salina para parar SV ciclismo.
4. Lavar em rápida sucessão com Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a alta solução salina [K⁺] é completamente removida.
5. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
6. É certo que a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

5. opção 2: Estimulação elétrica FM corante carregamento

1. Prepare uma pipeta de sucção usando o extrator de microeletrodos (Tabela de materiais) para obter o atarraxamento requerido e dica de tamanho.
2. Fogo-polonês a ponta de microeletrodos com um micro-forge até um único nervo motor pode ser aspirado com um ajuste apertado.
3. Deslize a pipeta de sucção para o eléctrodo em um micromanipulador e anexar para o tubo longo e flexível de plástico e uma seringa.
4. Definir parâmetros de estimulador (EG., 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2) ou 1 min (Figura 3)).
5. Substituir o Ca^{2 +}-livre solução salina na preparação larval com acima FM1-43 solução salina (4 µM; 1 mM CaCl₂) na plataforma eletrofisiologia.
6. A preparação no palco microscópio e levantar o palco até que a larva e pipeta de sucção estão em foco (objetiva de imersão de água X 40).
7. Aspira-se um ciclo de corte de nervos motores que inervam o selecionado hemisegment com pressão de ar negativa gerado pela seringa para o eletrodo de sucção.
8. Teste a função do eletrodo de sucção com uma descarga curta de estimulação enquanto monitora visualmente para a contração muscular no hemisegment selecionado.
9. Estimule o nervo motor usando parâmetros selecionados (passo 5.4) para conduzir a endocitose SV e absorção de corante FM1-43 (Figura 2).
10. Lavar em rápida sucessão com Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de corante FM1-43 é completamente removida.
11. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para imediata de imagem usando o protocolo da imagem latente confocal de cima.
12. Tome cuidadosa nota o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso para a exata mesma MNJ após descarregamento de tintura de FM.

6. eletroestimulação: FM tintura descarga

1. Substituir o Ca^{2 +}-livre de solução salina com soro fisiológico normal (sem tintura FM1-43) e coloque a preparação na fase de equipamento de eletrofisiologia.
2. Definir os parâmetros de estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2) ou 20 s (Figura 3)).
3. Sugar o nervo motor mesmo para o eletrodo mesmo como acima e em seguida estimular para ativar a exocitose SV e liberação do corante FM1-43.
4. Lavar em rápida sucessão com Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir o corante externo é completamente removido.
5. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
6. Certifique-se para a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

7. opção 3: Channelrhodopsin estimulação FM corante carregamento

1. Levante as larvas ChR2-expressando sobre os alimentos que contêm o ChR2 retinal todo-trans co-fator (dissolvido em etanol; concentração final de 100 µM).
2. Coloque a preparação larval na câmara do plexiglás num palco de dissecação microscópio equipado com uma porta da câmara.
3. Anexar um LED azul (470 nm; Tabela de materiais) para um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmara.
4. Focar o feixe de luz de LED azul para a função larval dissecado usando a função de zoom microscópio.
5. Substituir o Ca^{2 +}-soro livre sobre a preparação larval com acima FM1-43 salina (4 µM; 1 mM CaCl₂) na fase de optogenetic.
6. Defina os parâmetros do LED utilizando o estimulador (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2)).
7. Começar a estimulação de luz e controlar com um timer para o período pré-determinado de estimulação a optogenetic (por exemplo, 5 min; A Figura 2).
8. Quando o temporizador para, rapidamente remover a solução de tintura de FM e substitua por Ca^{2 +}-livre solução salina para parar o SV ciclismo.
9. Lavar em rápida sucessão com o Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de tintura de FM é completamente removida.
10. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal usando protocolo de imagem de cima.
11. Tome cuidadosa nota o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso para a exata mesma MNJ após descarregamento de tintura de FM.

8. Channelrhodopsin estimulação: tintura de FM descarga

1. Substituir o Ca^{2 +}-livre solução salina com soro fisiológico normal (sem tintura FM1-43) na fase de microscópio de dissecação com porta câmera LED centrou-se a larva.
2. Defina os parâmetros de estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2)).
3. Começar a estimulação de luz e controlar com um timer para o período pré-determinado de estimulação optogenetic (e.g., 2 min; A Figura 2).
4. Quando terminar o período de temporizador, rapidamente remover a solução de tintura de FM e substitua por Ca^{2 +}-livre solução salina para parar o SV ciclismo.
5. Lavar em rápida sucessão com Ca^{2 +}-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir o corante externo é completamente removido.
6. Manter a preparação larval no fresco Ca^{2 +}-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
7. Certifique-se para a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

9. fluorescência quantificação

1. Carregar a imagem no Image J (NIH aberto fonte) e criar uma projeção de intensidade máxima, clicando em imagem | Pilhas | Projeto Z.
2. Usando o anti-HRP:647 canal, vá em Image | Ajustar | Limiar e deslize a barra de ferramentas superior, até que só o MNJ é realçado.
3. Usando a ferramenta varinha, clique sobre o MNJ. Se o MNJ é descontínua, mantenha o botão Shift e selecione todas as partes.
4. Altere a imagem para o canal de tintura FM1-43 e ir para analisar | Medida para obter a medição de fluorescência.
5. Repita as etapas de 9.1-9.4 para a imagem "descarregada" do MNJ mesmo (segmento identificado, lado e músculo).
6. Para obter a porcentagem de tinta que foi descarregada, tome a relação entre as intensidades de fluorescência carregado/descarregado.
   Nota: Este procedimento pode ser modificado para analisar a fluorescência em uma base de bouton-por-bouton, utilizando também as ferramentas de seleção "oval" ou "freehand". Fluorescência de fundo pode ser subtraída por amostragem, a fluorescência de músculo. Agentes também podem ser adicionados para reduzir este pano de fundo.

Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a tintura de FM de atividade dependente da imagem latente do protocolo. O experimento começa sempre com a mesma dissecação cola larval, independentemente do método de estimulação usado posteriormente. Figura 1a é um diagrama esquemático de uma larva dissecado, mostrando o cordão nervoso ventral (VNC), irradiando nervos e repetidas hemisegmental muscular padrão. O VNC é removid...

Discussão

Estímulo despolarizante salino de alta [K⁺] é de longe a mais simples das três opções para tintura de FM de atividade-dependente ciclismo, mas provavelmente o menos fisiológicas²⁹. Este método simples depolarizes cada célula acessível em todo animal e assim não permite estudos direcionados. Pode ser possível aplicar localmente alta [K⁺] soro fisiológico com uma micropipeta, mas isto ainda vai despolarizar células pré/pós-sináptica e provável glia sinapse-asso...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity