Preparação de amostras de larvas de Drosophila por cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)-com base em metabolómica

Resumo

Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.

Resumo

Recentes avanços no campo da metabolómica estabeleceram a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um poderoso modelo genético para estudar o metabolismo animal. Combinando a vasta gama de ferramentas genéticas drosófila com a capacidade de levantamento de grandes áreas de metabolismo intermediário, uma abordagem metabolomics pode revelar interações complexas entre dieta, genótipo, eventos de vida-história e Dicas ambientais. Além disso, estudos metabolomics podem descobrir novos mecanismos enzimáticos e descobrir conexões anteriormente desconhecidas entre vias metabólicas aparentemente díspares. Para facilitar o uso mais difundido dessa tecnologia entre a comunidade de Drosophila , aqui nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve como preparar amostras de larvas de Drosophila para cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)- com base em análise da metabolómica. Nosso protocolo inclui descrições de coleta de amostra larval, extração do metabólito, derivatização química e análise por CG-em. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os usuários medir a abundância relativa dos metabólitos polares pequenas, incluindo aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos envolvidos na glicólise e os ciclos TCA.

Introdução

Mosca da fruta Drosophila melanogaster emergiu como um sistema ideal para estudar o mecanismo molecular que regulam o metabolismo intermediário. Não só são a maioria das vias metabólicas conservadas entre Drosophila e seres humanos, mas chaves sensores de nutrientes e reguladores de crescimento, tais como a insulina, Tor e myc, também são ativos na mosca^1,2. Como resultado, a Drosophila pode ser usado para explorar a base metabólica de doenças humanas que variam de diabetes e obesidade a neurodegeneração e câncer. A este respeito, desenvolvimento larval de Drosophila fornece o quadro ideal para se estudar um programa metabólico conhecido como glicólise aeróbica, ou o efeito de Warburg. Assim como muitos tumores glicólise aeróbica para gerar biomassa de hidratos de carbono, então, para fazer a drosófila larvas ativam glicólise aeróbica para promover o crescimento do desenvolvimento^3,4,5. Essas semelhanças entre larval e metabolismo de tumor estabelecer drosófila como um modelo de chave para compreensão como aeróbio glicólise é regulamentado na vivo.

Apesar do fato que a mosca tem emergido como um modelo popular para estudar o metabolismo, a maioria dos estudos de Drosophila dependem de métodos que são projetados para medir metabólitos individual³, tais como a trealose, triglicérides ou ATP. Como um protocolo específico é necessária para medir cada metabólito, estudos baseados no ensaio são tendenciosas para aqueles compostos que podem ser medidos usando jogos comerciais, caro e trabalhoso. Uma solução para estas limitações emergiu do campo da metabolómica, que fornece um meio mais eficiente e imparcial de estudar o metabolismo de Drosophila . Ao contrário de um estudo baseado em ensaio, uma análise única metabolómica simultaneamente pode medir centenas de metabólitos de pequenas moléculas e fornecem uma compreensão abrangente de estado metabólico^{6,7 de um organismo}. Esta técnica expandiu-se significativamente o âmbito da drosófila estudos metabólicos e representa o futuro deste emergente campo⁸.

Metabolómica estudos são realizados principalmente utilizando três tecnologias: (i) ressonância magnética nuclear (NMR), (ii) líquida cromatografia / espectrometria de massa (LC-MS) e (iii) cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)⁹. Cada abordagem apresenta desvantagens e vantagens distintas, e todas essas tecnologias têm sido usadas para estudar com sucesso o metabolismo de Drosophila . Desde que a pesquisa conduzida em nosso laboratório está focada em metabolitos pequenos, polares, empregamos principalmente um método baseados em GC-MS. GC-MS fornece o usuário com um número de vantagens, incluindo a grande reprodutibilidade, pico resolução, sensibilidade, e a disponibilidade de uma espectral biblioteca de impacto (EI) de elétrons padrão, que permite a identificação rápida de descoberto metabólica características de^10,11. A preparação de amostras para GC-MS, no entanto, é um pouco complexa e exige uma cuidadosa atenção aos detalhes. Amostras devem ser coletadas, lavadas, pesava e congeladas em uma maneira que sacia rapidamente reações metabólicas. Além disso, a carcaça da mosca é resistente para protocolos padrão de homogeneização e requer um moinho do grânulo para garantir a extração de metabólito ideal. Finalmente, amostras analisadas por GC-MS devem se submeter a derivatização química antes da deteção¹². Enquanto os métodos publicados anteriormente descrevem todas estas etapas^3,13,14, um protocolo visual que permita que o usuário iniciante reproducibly gerar dados de alta qualidade ainda é necessária. Aqui vamos demonstrar como preparar amostras de larvas de Drosophila para análise metabolomics baseados em GC-MS. Este protocolo permite que o usuário reproducibly medir muitos dos pequenos metabólitos polares que compõem o metabolismo de carbono central.

Protocolo

1. ovo coleção

1. Colete os adultos machos e fêmeas virgens de genótipos desejados. Idade individualmente esses animais em um frasco de alimento com mídia de Bloomington padrão para 3-5 dias.
2. Configurar os acasalamentos adequados ao transferir 50 fêmeas virgens e 25 machos para um novo frasco de comida.
   Nota: Um mínimo de seis acasalamentos independentes deve ser configurado para cada genótipo. Será coletada apenas uma amostra de cada acasalamento (ou seja, seis amostras colhidas seis acasalamentos independentes).
3. Prepare-se tampas de postura de melaço.
   1. Misture 115 mL de melaço e 29 g de ágar com 700 mL de H₂O em um frasco de 2 L.
   2. Ferva o melaço mistura de ágar-ágar em um prato quente.
   3. Arrefecer a 70 ° C.
   4. Adicionar 25 mL de mistura ácida (20 mL de ácido fosfórico 85% e 209 mL ácido propiônico em 1 litro de H₂O; Armazenar em um frasco marrom) e 10 mL de éster metílico de ácido p-hidroxi-benzoico de 10% em etanol a 95%.
   5. Despeje o ágar de melaço na parte da tampa e o fundo de um prato de cultura de tecidos de² 35 x 10 mm.
      Nota: Antes de derramar o melaço placas de ágar, certifique-se que as tampas e/ou a base da placa de² 35 x 10 mm se encaixa snuggly na boca de uma garrafa de estoque de Drosophila (descrita no passo 1.6). Dependendo da marca de placas usado, a base pode não ser utilizável.
4. Fazer fermento fresco pasta adicionando água destilada para ativo fermento seco (5g fermento/7 mL de água) até que a mistura torna-se uma pasta que pode ser facilmente espalhada sobre uma superfície sólida (ou seja, a consistência da manteiga de amendoim).
5. Espalhe cerca de 1,5 g de fermento de colar na superfície de uma tampa de postura de melaço.
6. Abrir quatro buracos de ar em lados opostos de um plástico 6 oz garrafa de estoque de drosófila usando uma agulha 22g.
7. Transferi as moscas recentemente acasaladas de frasco de alimentos em frascos de cultura.
   Nota: As moscas podem ser transferidas por qualquer um usando o CO₂ como um anestésico temporário ou segurando a parte superior do frasco na boca da garrafa e agudamente tocando o fundo da garrafa contra uma bancada.
8. Rapidamente, coloque um boné de postura de melaço com pasta de fermento na superfície para a boca de uma garrafa de estoque de Drosophila . Use fita de laboratório para fixar a tampa de postura no lugar.
   Nota: Se moscas foram anestesiados antes da transferência, o frasco deve ser colocado horizontalmente sobre a bancada até que todas as moscas se recuperaram. Uma vez que as moscas são completamente móveis, coloca o frasco em uma incubadora com a tampa de postura de melaço na parte inferior da cultura.
9. Recoloque a tampa de postura de melaço pelo menos uma vez por dia durante os primeiros dois dias, invertendo o frasco de estoque, tocando o fundo da garrafa contra a bancada, removendo a tampa de ovo velho, e imediatamente, colocando uma nova tampa de ovo dentro da boca da garrafa. Descarte a tampa antiga postura.
   Nota: Este passo garante que as fêmeas não está segurando seus ovos e permite a coleta de populações sincronizadas.
10. Coloque uma tampa nova postura para o frasco de estoque após dia 3, substituir após 2 h e descarte. Remova e substitua a segunda postura cap depois de quatro horas. Rotule o fundo deste boné de postura com a data, hora e genótipo.
    Nota: Os ovos coletados durante esta janela de 4h serão usados para análise. Esta etapa de sincronização é crítica para analisar os estádios de desenvolvimento específicos. Os ovos podem ser coletados dessa maneira por vários dias.
11. Inserir as tampas de postura em uma placa de Petri 60 x 15 mm² e coloque em uma incubadora na temperatura e umidade.
12. Inspecione as tampas postura todos os dias por problemas com fome, densidade populacional ou contaminação.
    Nota: As larvas devem ter acesso à alimentação adequada para garantir o desenvolvimento contínuo. Se necessário, colar de fermento fresco pode ser espalhado em todos os tampões de postura que serão usados no experimento. Além disso, se a densidade de população larval é muito alta, larvas começará a vaguear fora a placa de cultura. Estas amostras não devem ser usadas para análise metabolómica porque a elevada densidade populacional e intermediários crises de fome vivida enquanto vagando irão resultar em dados inconsistentes. Uma densidade de ~ 80 – 100 médio segundo ínstar larvas (L2) por placa ou 40-50 médio terceiro instar as larvas (L3) por placa é recomendado. Amostras que são visivelmente contaminadas com bactérias ou fungos devem ser descartadas.

2. coleta de amostra larval

1. Larvas de idade até o ponto desejado. Se coletando larvas L3, sincronizar novamente as amostras na muda L2-L3. A ressincronização é comumente alcançada usando um método descrito anteriormente que usa os espiráculos anteriores como um marco no desenvolvimento de¹⁵. Alternativamente, meados-L3 larvas podem ser sincronizadas usando um de gene repórter sgs3 ¹⁶.
   Nota: a este respeito, encontramos larvas meados-L2 (~ 60 h após a postura de ovos) são ideais para a maioria das análises porque desenvolvimento larval é ainda relativamente síncrono, nesta fase, cuidadosamente coletadas amostras têm uma alimentação adequada para desenvolver para este Commit e os número de animais por amostra é gerenciável (veja abaixo). Um passo adicional de sincronização é necessário para as larvas L3 porque os numerosos pulsos de isoinokosterone que ocorrem durante o desenvolvimento de L3 têm efeitos dramáticos no metabolismo e irão gerar artefatos em populações não sincronizadas.
2. Use uma agulha de dissecação para levantar delicadamente a massa de levedura fora o ágar. Coloque o fermento para uma nova PAC de ágar de melaço.
   Nota: a maioria das larvas comerá na interface entre o ágar de melaço e o colar de levedura.
3. Use um pincel pequeno para coletar larvas de superfície recém exposta do ágar melaço. Coloque as larvas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL no gelo.
   Nota: As dimensões das amostras apropriadas para cada estágio do desenvolvimento são as seguintes: 50 primeiro ínstar larvas (L1); 25 larvas de meados-L2; 20 larvas L3 precoce; 15 meados-L3 ou tarde larvas L3.
4. Lave e congele amostras (etapas 2.3 através de 2.8) em pequenos lotes (quatro a seis amostras) ao coletar um conjunto de amostra grande. As amostras devem ser congeladas dentro de 20 min de colocação de larvas em tubos.
   Nota: Recomendamos usar tubos de Flex Eppendorf 1,5 mL porque outros tubos podem interferir com a transferência da amostra na etapa 3. As amostras devem ser colhidas em tubos de microcentrífuga. Não coletar amostras em tubos de grânulo descritos no passo 3.1. Grânulos cerâmicos retêm a solução de lavagem de NaCl, o que resulta em medidas de massa imprecisas e introduz contaminantes na amostra.
5. Adicione 1 mL de gelado 0,9% NaCl dentro do tubo, fechar a tampa e verticalmente da aleta do tubo para cuidadosamente para lavar as larvas.
6. Coloque o tubo de volta no gelo para ~ 30 s. Durante este tempo, as larvas vão afundar até o fundo do tubo, mas fermento permanecerão em suspensão. Uma vez que todas as larvas têm formado uma pelota solta, remova a solução de NaCl usando uma pipeta de 1 mL.
7. Repita etapas 2.4 e 2.5, duas vezes, ou até que a solução de lavagem final é claro.
   Nota: As etapas adicionais de lavagem podem ser necessárias se a amostra recolhida contém uma quantidade excessiva de levedura.
8. Centrifugar as amostras a 2.000 × g por 1 min a 4 ° C.
9. Remova todos os solução residual utilizando uma pipeta de 200 µ l.
10. Imediatamente, congele a amostra em nitrogênio líquido.
    Nota: O protocolo pode ser pausado para esta etapa. As amostras podem ser armazenadas por até 3 meses a-80 ° C.

3. transferência de amostras para tubos do grânulo

1. Cada amostra larval deve ser transferida do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um tubos de screwcap de 2 mL contendo esferas de cerâmica de 1,4 mm. Em preparação para esta etapa de transferência, use um marcador de etanol-prova para rotular o lado de um tubo de grânulo de screwcap 2 mL (marcações da tampa serão destruídas durante a etapa de 4.4).
2. A massa do tubo rotulado grânulo usando uma balança analítica capaz de medir com precisão 0,01 mg de Tara.
3. Se larval amostras foram armazenadas a-80 ° C, coloque os tubos de amostra no antes do nitrogênio líquido para transferência.
4. Use pinça longa para remover o tubo de amostra de 1,5 mL do nitrogênio líquido dewar.
5. Usando luvas de nitrilo, agarre o congelado do tubo, inverter e libra agudamente a tampa do tubo contra a bancada para desalojar o sedimento congelado. Imediatamente despeje a pelota em um tubo de grânulo de screwcap 2ml previamente tarada. Se o pellet não desalojar, retornar o tubo de nitrogênio líquido e repita.
   Nota: Pelotas Larval não desalojará de todos os tubos de microcentrífuga. Se usar um tubo diferente da recomendada, determine se pelotas larvas podem ser desalojadas antes da colheita de amostras para análise.
6. Rapidamente medir a massa combinada do tubo da pelota e o grânulo larval. Imediatamente, coloque o tubo de amostra em nitrogénio líquido. A pelota larval massa será usada para normalizar os dados da metabolómica.
   Nota: O protocolo pode ser pausado para esta etapa. As amostras podem ser armazenadas por até 3 meses a-80 ° C.

4. extração da amostra

1. Coloque os tubos de amostra em uma bancada de-20 ° C mais frio.
2. Adicione 0,8 mL de metanol a 90% prechilled (-20 ° C) contendo 2 µ g/mL de ácido succínico-d4 em cada tubo. Retorne a amostra para a bancada de-20 ° C mais frio.
   Nota: O ácido succínico-d4 serve como padrão interno. Só uso HPLC grau H₂O e metanol. Desde que o metanol e outros solventes orgânicos são voláteis e difíceis de medir com precisão usando pipetas de deslocamento de ar, recomendamos o uso de pipetas volumétricas para esta etapa e todas as etapas seguintes.
3. Configurar um controle negativo adicionando 0,8 mL de metanol a 90% prechilled (-20 ° C) contendo 2 µ g/mL de ácido succínico-d4 num tubo vazio do grânulo.
4. Homogeneizar as amostras por 30 segundo a 6,45 m/s usando um homogeneizador de moinho do grânulo localizado em uma sala de controle de temperatura de 4 ° C.
   Nota: Falha para rapidamente e completamente homogeneizar a pelota larval é uma fonte comum de variabilidade na análise da metabolómica. Só use Homogeneizadores que são capazes de destruir congelado larvas tecidos dentro de 30 s.
5. Retornar os tubos de amostras homogeneizadas para a bancada de-20 ° C mais frio e incube-os no congelador-20 ° C pelo menos 1 h.
6. Centrifuga os tubos em 20.000 × g ou o máximo de velocidade por 5 min a 4 ° C para remover o precipitado resultante.
7. Transferi 600 µ l do sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Não perturbe o precipitado. Se o pellet precipitado torna-se deslocado ao pipetar o sobrenadante, retornar todos os sobrenadante no tubo e repita a etapa 4.6.
8. Coloque os tubos de amostra em uma centrífuga a vácuo. Certifique-se de que todos os tubos estão abertos antes de selar o centrifugador. Secar as amostras à temperatura ambiente até que todo solvente é removido (esta etapa geralmente leva ~ 16 h para completar).
   Nota: Se necessário, o protocolo pode ser pausado para esta etapa. Amostra seca pode ser armazenada a-80 ° C.

5. química derivatização

1. Se as amostras secas foram armazenadas a-80 ° C, coloque os tubos de amostra fechada em uma centrífuga a vácuo e secar por 30 min. Esta etapa deve ser executada antes de abrir o tubo de amostra.
   Nota: Este passo remove a condensação que se acumula na parte externa do tubo de microcentrífuga quando retirados do congelador. Esta parte do protocolo é extremamente sensível a H₂O e precaução extra deve ser tomada para manter todos os reagentes tão seco quanto possível.
2. Prepare uma solução de cloridrato de methoxylamine de 40 mg/mL (MOX) em piridina anidra. Apenas use a piridina anidra. Loja MOX e piridina num exsicador e preparar a solução MOX diariamente.
   Cuidado: MOX e piridina são tóxicos. Prepare esta solução na coifa.
   1. Use um soprador de ar quente para secar uma seringa de vidro de 1 mL.
   2. Insira a agulha da seringa para o frasco de piridina anidra. Retire 1 mL de piridina e adicionar a um tubo de microcentrífuga contendo 40mg de MOX.
   3. Lave a garrafa de piridina anidra com argônio. Tapar o frasco e retornar para o exsicador.
   4. Dissolva o MOX na piridina incubando o tubo em um misturador térmico a 35 ° C por 10 min a 600 rpm.
3. Adicione 40 µ l de MOX de 40 mg/mL em solução de piridina anidra para a amostra seca.
4. Vórtice de 10 s e brevemente centrífuga (10.000 x g por 20 s).
5. Incube a 30 ° C, durante 1 h a 600 rpm em um misturador térmico.
6. Centrifugar a 20.000 × g ou velocidade máxima por 5 min remover o problema de partículas.
7. Transferi 25 µ l do sobrenadante para um tubo de mostruário com uma inserção de microvolume de vidro de 250 µ l desativado.
8. Adicionar 40 µ l de N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) contendo 1% TMCS.
   Atenção: MSTFA é tóxico. Execute esta etapa na coifa.
   Nota: Se estiver disponível, esta etapa pode ser concluída por um mostruário de Gerstel.
9. Coloque uma tampa no frasco do mostruário e selar usando uma ferramenta de frisador.
10. Incube a amostra a 37 ° C durante 1 hora com agitação (250 rpm).
11. Prepare uma solução ácido graxo metil éster padrão (FAMES) como anteriormente desceribed³. Adicione 3 µ l de FAMES no frasco de mostruário automático usando um mostruário automático robótico imediatamente antes da injeção.
    Nota: Famas são usadas para calibrar o deslocamento do tempo de retenção e verificar o desempenho do instrumento. Se nenhum mostruário automático robótico está disponível, FAMEs podem ser adicionados durante a etapa de 5,8.

6. deteção de GC-MS

Nota: Na maioria dos casos, o usuário irá realizar essa etapa com o auxílio de uma instalação de núcleo de espectroscopia de massa. Este protocolo é projetado para ser usado com um 30 m, coluna GC com uma coluna de guarda de 5m.

1. Randomize a ordem da amostra.
2. Prepare o GC-MS.
   1. Conjunto, a taxa de fluxo de gás portador Hélio a 1 mL/min.
   2. Definir a temperatura de entrada de 250 ° C.
   3. Programa o GC para executar o gradiente de temperatura a seguir:
      1. Temperatura inicial para 95 ° C, com uma espera de 1 min.
      2. Aumente a temperatura de 110 ° C, à taxa de 40 ° C/min com uma espera de 2 min.
      3. Aumentar para 250 ° C por rampa de 5° C/min.
      4. Aumentar a 330 ° C, à taxa de 25 ° C/min com uma preensão final de 4 min.
   4. Definir o atraso de solvente para 3,5 min.
      Nota: O tempo pode ser alterado de acordo com o sistema de GC-MS. A finalidade desta etapa é evitar MSTFA e MOX de danificar o detector.
3. Injete 1 µ l da amostra pyrazole o GC-MS (dividir a proporção de 10:1).
   Nota: Injete 2 µ l da amostra se a intensidade dos picos é muito baixa. A ordem de injeção de amostras deve ser aleatórios.
4. Operar o espectrômetro de massa no modo de varredura completa sobre uma escala em massa de 50 – 500 m/z.

7. análise de dados

1. Analise dados metabolómica usando tanto uma abordagem não segmentada ou alvo. Alvo de análise é focado em medir a abundância de um conjunto definido de metabólitos, tais como as medições de lactato que descrevemos abaixo. Em contraste, a análise não segmentado usa uma abordagem imparcial para identificar qualquer característica metabólica que mudou significativamente entre dois conjuntos de amostra.
   Nota: Nosso laboratório usa primeiramente o programas livres MetAlign¹⁷ e^18,de MetaboAnalyst¹⁹ para análise de dados. Desde que uma descrição adequada tanto o controle de qualidade, normalização e etapas de processamento de dados estão além do escopo deste manuscrito, referimos o usuário protocolos mais detalhados que são dedicados ao processamento de dados^{20,21, 22}. Além disso, um fluxograma descrevendo as etapas necessárias para essa análise podem ser encontrado em outro lugar⁸.

Resultados

Lactato desidrogenase (dLDH) mutantes, desprovidas de atividade dLDH⁴e geneticamente-controles foram coletados como larvas de meados-L2 e processada de acordo com o protocolo descrito acima. Quando comparados com controles, larvas mutantes exibem alterações significativas no lactato, piruvato e L-2-Hidroxiglutarato⁴. Espectros foram adquiridos com um sistema de Agilent GC6890-5973i MS. Um exemplo dos espectros de GC-MS gerar com n...

Discussão

Metabolomics oferece uma oportunidade sem precedentes para analisar as reações metabólicas que compõem o metabolismo intermediário. A sensibilidade desta tecnologia, no entanto, processa dados suscetíveis a base genética, pistas do desenvolvimento e uma variedade de estresses ambientais, incluindo temperatura, umidade, densidade populacional e disponibilidade de nutrientes. Portanto, uma alta qualidade e reprodutíveis metabolomics análise exige que as amostras sejam cobrados em condições altamente controladas....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unsulfured blackstrap molasses	Good Food, INC
Drosophila Agar Type II	Genesee Scientific	66-103
Pyridine	EMD Millipore	PX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX)	MP Biomedicals, LLC	155405
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane	Sigma	69478
Fleischmann’s Active dry yeast	AB Mauri Food Inc	2192
6oz Drosophila stock bottle	Genesee Scientific	32-130
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)	Omni International	SKU:19-627
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet	Agilent	5181-8872
Succinic acid-2,2,3,3-d4	Sigma	293075
SpeedVac	Thermo	SC210A
o-Phosphoric acid	Fisher Scientific	A242-1
Propionic acid	Sigma	P5561
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester	Genesee Scientific	20-258
Bead Ruptor	Omni International	SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000012
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block	Benchmark Scientific	H5000
Methanol	Sigma	34860
1.5 mL centrifuge tube	Eppendorf	22364111
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish	Corning Incorporated	353001
GC column	Phenomex	ZB-5MSi