Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Resumo

Espectrometria de massa de pulverizador de folha é uma técnica de análise química direta que minimiza a preparação da amostra e elimina a cromatografia, permitindo a detecção rápida de pequenas moléculas de tecidos vegetais.

Resumo

As plantas produzem milhares de pequenas moléculas que são diversas em suas propriedades químicas. Espectrometria de massa (MS) é uma técnica poderosa para a análise de metabólitos da planta porque ele fornece pesos moleculares com alta sensibilidade e especificidade. Spray de folha MS é uma técnica de ionização ambiente onde o tecido de planta é usado para análise química direta via electrospray, eliminando a cromatografia do processo. Esta abordagem de metabólitos de amostragem permite uma grande variedade de classes químicas para ser detectado simultaneamente de tecidos vegetais intactos, minimizando a quantidade de preparação de amostra necessária. Quando usado com uma MS em massa de alta resolução, precisas, spray de folha MS facilita a rápida detecção de metabólitos de interesse. Também é possível coletar dados de fragmentação de massa em tandem com esta técnica para facilitar a identificação de compostos. A combinação de medições precisas em massa e a fragmentação é benéfica em confirmando identidades compostas. O spray de folha técnica MS requer apenas pequenas modificações a uma fonte de ionização de nanospray e é uma ferramenta útil para expandir ainda mais os recursos de um espectrômetro de massa. Aqui, o tecido de folhas frescas de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), uma planta medicinal tradicional da África do Sul, é analisado; numerosos alcaloides de mesembrine são detectados com spray de folha MS.

Introdução

As plantas contêm uma grande variedade de pequenas moléculas com propriedades químicas diferentes. MS é uma técnica poderosa para analisar compostos de plantas, porque pode fornecer composições elementares com uma alta sensibilidade e especificidade para a detecção e identificação de metabólitos¹. Mais comumente, MS é realizada em amostras extraídas por meio de solvente, que são separadas por cromatografia antes o MS análise¹. No entanto, o uso de cromatografia líquida (LC) requer vezes análise longa e é frequentemente associado com uma amostra extensa preparação¹. Em contraste, direto de análise química de tecidos intactos que contorna a cromatografia é uma técnica muito rápida, exigindo a amostra mínima preparação². Assim, em casos onde as etapas cromatográficas podem ser cobradas, uma análise química direta pode ser altamente vantajosa.

LC-MS típico para pesquisa de produtos e metabolomics natural depende de extrações demoradas em massa de materiais secos ou congelados planta contendo vários tecidos e células tipos³. Alternativamente, análise química direta, tais como a detecção de MS de metabolitos do tecido de planta, pode isolar os tipos de células e evitar artefatos de preparação⁴. Spray de folha MS, também conhecida como tecido-pulverizador^5,6, é uma técnica de ionização ambiente direto MS, que requer essencialmente, sem preparação amostra^5,7. Pulverizador de folha que MS está intimamente relacionada com spray de papel MS, uma técnica de ionização ambiente com características de ionização electrospray que permite a detecção dos analitos que são depositadas em papel⁷. Apesar do nome, folha spray MS é aplicável para vários tipos de tecidos vegetais, não nos deixa e tem sido demonstrado em frutos, sementes, raízes, tecidos florais e tubérculos, entre outros,^{6,8,9, 10,11,12}. A técnica facilita a ionização de fitoquímicos endógenas directamente a partir dos materiais de planta para o espectrômetro de massa para a deteção de⁸. Spray de folha MS também pode fornecer informações sobre a distribuição espacial dos produtos químicos em tipos diferentes de tecidos em plantas¹³. Quando o pulverizador folha MS é comparado com a extração de solvente e LC-MS, os resultados sugerem pulverizador folha que MS permite a rápida detecção de metabólitos de superfície de tipos de células únicas tais como tricomas¹³. A Figura 1 ilustra a montagem experimental de folha pulverizador MS. Ionização electrospray direta ocorre após apenas modificações de fonte menor. Uma alta tensão é aplicada no tecido vegetal através de uma pinça de metal, produzindo um spray de gotas altamente carregadas, formando um cone de Taylor que transporta os íons para a entrada de iões de Electrospray a Sra. ionização ocorre a partir do líquido natural da planta ou o solvente appl IED para a superfície da planta. Uma ponta pontiaguda no tecido facilita a electrospray e pode ser naturalmente natural ou criado por um corte.

Spray de folha MS é um método rápido de análise qualitativa e semi-quantitativa de tecidos de planta intacta que achei utilidade para uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, a técnica tem sido usada para detectar compostos endógenos para distinguir espécies relacionadas e até mesmo para avaliar alterações na mesma espécie cultivada em diferentes condições. Estudos anteriores mostraram esta abordagem medindo metabolitos em beautyberry (Callicarpa L.) ¹² e ginseng americano (Panax quinquefolium L.) ⁶. no último exemplo, ginsenósidos, aminoácidos e oligossacarídeos poderiam ser detectados depois de molhar o tecido cru ginseng. Ginseng americano selvagens e cultivado foram diferenciadas de tubérculo fatias⁶. Integridade do tubérculo de ginseng foi preservada sucedendo spray de folha MS, que permitiu uma inspeção morfológica e microscópico subsequente⁶. Além disso, compostos exógenos em amostras de plantas também podem ser detectados. Um número de pesticidas (acetamipride, Difenilamina, imazalil, linurão e tiabendazol) foram detectado na casca ou polpa de frutas e legumes⁹. Enquanto estes estudos e muitos outros têm mostrado a utilidade do pulverizador folha MS para várias finalidades específicas, um protocolo detalhado não foi anteriormente relatado.

Aqui, a descrição do protocolo não incidirá sobre a otimização do método para um determinado tecido ou composto. Em vez disso, a detecção de alcaloides de mesembrine de Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) é usada como um exemplo para discutir as medidas necessárias de otimização que devem ser tomadas ao preparar um experimento de MS de pulverizador de folha para uma espécie, tecido, ou Compound(s) pela primeira vez. S. tortuosum é uma suculenta endêmicas para a região semi-árida de Karoo, na África do Sul. Uma medicina tradicional de San e Khoi Khoi povos, foi usada para supressão apetite e sede, bem como quanto aos seus efeitos psicotrópicos e analgésicos^14,15. Atualmente, os extratos padronizados são utilizados para o tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos e neuropsicológicos^16,17. Os principais compostos de interesse incluem o alcaloide mesembrine e seus derivados, muitos dos quais também são encontrados em relacionados Sceletium espécies¹⁵. Populações selvagens e cultivadas de S. tortuosum têm concentrações variáveis de alcaloides mesembrine, apresentando, assim, um desafio de controle da qualidade¹⁸. Um método para a detecção rápida de mesembrine alcaloides, tais como spray de folha MS, pode ser útil na monitorização Sceletium produtos. Porque anteriormente, não tinha havido nenhum protocolo experimental visual pormenorizado pelo spray de folha técnica do MS, nós ilustraremos o método usando o exemplo da S. tortuosum, e é descrita a seguir: a modificação de uma fonte de nanospray, o seleção e preparação dos tecidos da planta, a aquisição dos dados, a interpretação dos resultados e a otimização dos parâmetros de MS.

Protocolo

1. modificações a fonte Nanospray para folha pulverizador MS

1. Use uma fonte de nanospray modificada para spray de folha MS. Como não fluídico componentes são necessários para spray de folha MS, modificar a fonte, removendo a sonda LC da fonte.
2. Monte o fio de MS de pulverizador de folha que aplicará a tensão no tecido da planta com o pino apropriado para conectar a fonte. Solde o pino para uma extremidade de um fio isolado; uma pinça para a extremidade oposta do fio de solda.
   Nota: A braçadeira (alligator clip tipo) pode ou não ter dentes. Para o pequeno tecido, uma braçadeira sem dentes é preferencial. Um braço flex opcional com uma pinça pode ser adicionado à fonte de nanospray para auxiliar no posicionamento do tecido de planta. Nota que este protocolo especificamente descreve como executar o pulverizador folha MS em um híbrido quadrupole ion trap massa analisador sistema MS (ver a Tabela de materiais); no entanto, outros sistemas de MS podem ser alterados para executar esta técnica⁶. Acoplamento de spray de folha MS com uma análise química em tempo real de espectrômetro de massa portátil pode ser executada no local sem a necessidade de transportar o material de planta para o laboratório de^19,20.
3. Posicione um tapete anti-estático no andar abaixo a fonte para reduzir a descarga elétrica que pode ocorrer da fonte usando altas tensões.

2. preparação do sistema MS para folha Spray MS

1. Se o sistema foi recentemente em uso, deixe-o esfriar ao toque e remova qualquer fonte alternativa e o cone de varredura. Anexe a fonte de MS de pulverizador de folha de nanospray.
2. Criar um arquivo de música com os parâmetros adequados de ionização definidos da seguinte forma: bainha, auxiliar e gás de varredura para 0; a tensão de pulverização de 2 a 5 kV; a temperatura capilar a 150-250 ° C; e o nível de RF de S-lente para 50. Salve o arquivo de música com os parâmetros desejados^8,13. Otimize a tensão e a temperatura para a melhor ionização do tecido e compound(s) de interesse.
   Nota: Bons pontos de partida são 4 kV e 200 ° C.
3. Fazer um arquivo de método, incluindo o arquivo de música de pulverizador MS folha com: MS completo positivos e negativos; uma resolução de 70.000; um alvo AGC de 1 x 10⁶; um máximo de 200 ms; e o intervalo de varredura desejado m/z. Como alternativa, use apenas 1 polaridade.

3. preparação do instrumento, solventes e tecido de planta

Nota: Sempre use luvas e não use tecido de planta que tem sido tratado com as próprias mãos. Caso contrário, íons de contaminantes, tais como o glicol de polietileno dominará os espectros.

1. Trazer os tecidos da planta para a análise para o mesmo quarto que o sistema de MS para permitir uma rápida amostragem.
2. Para tecido de planta que não tem uma ponta naturalmente aguçada, use uma lâmina de barbear sobre uma lâmina de vidro para cortar um ponto afilado (Figura 2). Determinar a quantidade de tecido necessário para a análise com base na sensibilidade do instrumento, tipo de tecido e compound(s) de interesse (por exemplo, um jovem S. tortuosum folha ou seja ~ 5 mm de comprimento).
   1. Corte S. tortuosum sai às 10 semanas pós-germinação em tiras finas, cada um com uma extremidade pontiaguda para formar um ponto.
3. Use fórceps para selecionar suavemente o tecido de planta no final que irá ser fixado. Segurando o tecido com fórceps, cuidadosamente transferi-lo para o grampo.
   Cuidado: Não toque a fonte do instrumento se a tensão for na.
4. Ajuste o braço flexível e o fio com a pinça para posicionar o tecido em consonância com a entrada da MS para que a distância entre o tecido de planta e a entrada de iões do MS é de 5-10 mm para o triplo quadrupolo (por exemplo, TSQ) e armadilha linear quadrupolo (LTQ) e 10 -50 milímetros para o ion trap analisador de massa (por exemplo, orbitrap)⁸.
   1. Conecte a extremidade oposta do cabo da fonte. Se as primeiras tentativas produzem uma intensidade de sinal baixo, mova o tecido de planta mais perto da entrada do íon (referir-se a discussão para otimização).
5. Carregar o arquivo de método; o nome do arquivo de dados e definir o local de armazenamento de arquivo. Em seguida, ligue o sistema de MS clicando em jogar e clique em Iniciar para iniciar a aquisição de dados.
6. Aplicar um solvente (por exemplo, metanol) utilizando uma pipeta com uma ponta de gel de carregamento para maximizar a distância entre as mãos e a alta voltagem para proteger o usuário.
   Nota: O volume de solvente necessária depende do tamanho, secura e textura do tecido, geralmente ~ 2-20 µ l. S. tortuosum folhas não exigem qualquer solvente a ser adicionado. Aplique cuidadosamente o solvente e não tocar a fonte de instrumento quando a tensão está em. Use solventes grau de LC-MS e suas obras que tem sido ácido lavado e é livre de detergentes. Em alguns tecidos, um sinal pode ser observado sem a adição de um solvente devido ao teor de água natural do tecido vegetal. No entanto, uma maior intensidade de sinal e reduzida S/N normalmente é conseguido através da aplicação de um solvente para o tecido.
7. Aquisição de dados, enquanto o sinal persiste ou até os espectros adequados foram recolhidos, tipicamente 30-60 s. Se necessário, aplique o solvente adicional para manter uma intensidade de sinal elevado por um longo período de tempo. Impedir a aquisição de dados e pausar o sistema de MS.
8. Remova o tecido e lave a braçadeira com 100% de metanol e uma limpeza de fiapos. Limpe a entrada do íon de MS após aproximadamente 1-2 h de aquisição por spray folha MS de acordo com as especificações do fornecedor. Também, limpe a entrada de iões de MS entre as análises de tipos diferentes de tecido.

4. avaliação de qualidade de dados

1. Abra o arquivo de dados e inspecione visualmente o cronograma de massa base de pico. Verifique a intensidade do sinal é ~1.0 x 10⁷ -5.0 x 10⁸. Se o sinal for baixo, mova o tecido mais perto da entrada do íon. Se superior, o front-end do sistema MS se tornará sujo, então mova o tecido mais longe da entrada do íon.
2. Com base na presença ou ausência dos íons de interesse em espectros de massa produzida, altere os parâmetros.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. fragmentação de massa em tandem

1. Decidir quais íons são de interesse para a fragmentação de massa em tandem (MS/MS); um sinal de espectros de massa que é > 1,0 x 10⁵ é suficiente para a seleção de íons para MS/MS.
2. Fazer um novo arquivo de método com uma lista de inclusão de m/z para fora com 4 casas decimais. Clique em listas globais e inclusão. Em Propriedades do PRM, selecione a energia de fragmentação [por exemplo, energia de colisão normalizado (NCE) de 30-50 é um bom intervalo para começar] e outros parâmetros de MS/MS.
   1. Para obter dados de MS/MS para alcaloides mesembrine, fragmentar os seguintes íons, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, em 35 NCE.
      Nota: A aquisição de dados de MS/MS pode ser realizada imediatamente após a MS ou em um momento posterior. O mesmo tecido pode muitas vezes permanecer preso após uma completa MS e pode ser reutilizado para adquirir dados de MS/MS. No entanto, se um constatados não fornecem um sinal suficiente, use um tecido novo.
3. Carrega o arquivo de método de MS/MS e um arquivo de dados nomeado. Ligue o sistema MS e, em seguida, iniciar a aquisição de dados, adicionando um solvente se necessário. Quando foram coletados espectros adequados, normalmente após 30-60 s, pare a aquisição.
4. Recolha a fragmentação em muitas energias diferentes ao atribuir fragmento íons.
   Nota: Desde que o spray de folha MS carece de uma separação cromatográfica, os espectros de fragmentação são susceptíveis de conter muitos íons e fragmentando-se em energias diferentes vai ajudar a trazer clareza.

6. putativos identificações por fragmentação de massa massa exata e Tandem

1. Fazer as identificações putativos referenciando medições precisas em massa de bancos de dados disponíveis publicamente metabólito como Metlin²¹, humano de banco de dados Metabolome²², banco de massa²³, mapas de lipídios²⁴, Instituto Nacional de Normas e tecnologia MS busca²⁵, respeito pelos fitoquímicos²⁶, ou dos PNB²⁷.
2. Como esses bancos de dados não são exaustivos, realizar uma revisão de literatura adicional sobre as espécies de planta caracterizadas quimicamente conforme necessário.
3. Íons de fragmentação de correspondência da folha pulverização-MS/MS para os bancos de dados acima mencionados quando MS/MS informação está disponível, ou à literatura. Como alternativa, use uma interpretação manual de íons de fragmento de MS/MS ou uma fragmentação de uma autêntica norma realizada pela injeção direta ou LC-MS/MS.

7. análise de dados

1. Converta os arquivos raw de MS para mzXML arquivos com a ferramenta de msConvert de Proteowizard²⁸.
2. Use o pacote de software XCMS implementado em R para a colheita de pico. Use uma infusão direta método pelo spray de folha MS análise de processamento.
   Nota: Os scripts bem anotados, usados para processamento de dados podem ser encontrados no https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
3. Para obter medições semi-quantitativa, representando a variabilidade experimental, normalizar a intensidade de cada metabólito pelo íon total atual (TIC), como o spray de folha MS intensidade de sinal pode variar, em parte devido a pequenas variações no posicionamento dos a folha na fonte e as diferenças em tamanho e forma de folha.
4. Como alternativa, use o software fornecido pelo fornecedor para a análise de dados ou MZmine2 (para ser encontrado em http://mzmine.github.io/)²⁹.

Resultados

Em 10 semanas que pós-germinação, recém coletados com efeito de estufa-crescido S. tortuosum folhas foram analisados por spray folha MS. O fluxo de trabalho experimental para a detecção de metabólitos de S. tortuosum deixa usar spray de folha que MS é ilustrada na Figura 2. Uma folha foi selecionada, cortar uma tira fina com uma extremidade pontiaguda para formar um ponto e fixada com o spray de folha MS aparelhos de grampo de arame....

Discussão

O uso bem sucedido do presente protocolo baseia-se sobre a otimização de várias etapas para as espécies de plantas, tipo de tecido e compound(s) de alvo de interesse. Os parâmetros descritos no protocolo fornecem um bom ponto de partida. As seguintes decisões experimentais precisam ser feitas e testadas: ou não para uso (1) corte ou tecido sem cortes e (2) solventes ou sem solvente, (3) o solvente para usar e em que volume, (4) qual a distância do tecido a partir da entrada do íon deve ser e (5) a amplitude de t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum