Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.

Resumo

Em um sistema nervoso de mamíferos, mielina fornece um isolamento eléctrico por enwrapping as fibras de axônio em uma espiral de várias camada. Inspirado por sua arquitetura subcellular altamente organizado, desenvolvemos recentemente uma nova modalidade de imagem, chamada reflectometria espectral (provador), que permite que a imagem latente de nanoescala rótulo livre sem precedentes dos axônios mielinizadas ao vivo em situ. O princípio subjacente é obter informações nanoestrutural, analisando o espectro de refletância da estrutura subcelular várias camada. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado passo a passo para a realização de uma imagem de provador básica dos tecidos nervosos usando um sistema comercial microscópico confocal, equipado com um laser de luz branca e um filtro sintonizável. Cobrimos os procedimentos de preparação da amostra, aquisição de dados espectrais e processamento de imagem para obtenção de informações nanoestrutural.

Introdução

No sistema nervoso dos mamíferos, mielina fornece condução nervosa rápida e integridade axonal por enwrapping as fibras de axônio com bainhas membranosas em várias camadas. É composta por sua estrutura várias camada alternando nanoescala fino-filmes compostas por membranas de plasma (~ 5 nm), citoplasma (~ 3 nm) e espaços extracelulares (~ 7 nm)^1,2. Microscopia ótica, incluindo a recente microscopia de super-resolução, não são adequados para observar a dinâmica de mielina nanoescala devido a sua resolução insuficiente devido à difração óptica^3,4,5. Apesar de microscopia eletrônica pode fornecer detalhes de nanostructure a mielina, não é compatível com os sistemas biológicos vivos devido a preparações altamente invasivo amostra envolvendo fixação química e^,ultrasectioning⁶⁷ . Até recentemente, não houve nenhuma técnica aplicável para observar a dinâmica de nanoescala de dendritos em situ.

Schain et al relataram anteriormente que dendritos exibem refletância de luz colorido⁸. Adotando a análise espectroscópica da luz refletida, criámos uma nova modalidade de imagem para a imagem latente de nanoescala de axônios mielinizados, chamado reflectometria espectral (provador)⁹. Provador baseia-se a interferência de filme fino que ocorrem na estrutura multi-camadas da bainha de mielina (Figura 1). Por simulação óptica em vários axônios, revelamos que o espectro de refletância é uma função periódica do número de onda e sua periodicidade () é inversamente proporcional ao diâmetro do axônio (d). Esta relação simples () oferece fácil quantificação do diâmetro do axônio a partir dos dados do provador. Utilizando este, revelamos o axônio prevalente abaulamento sob leve traumatismo crânio-encefálico em nosso relatório prévio.

O sistema de provador baseia-se na microscopia confocal e consiste de uma fonte de laser especializado e filtros (Figura 2). A fonte de entrada é um laser de luz branca, fornecendo banda larga saída espectral visível para regiões de infravermelhas. Para a varredura espectral, o sistema é equipado com dois dispositivos óptico-acústico: um filtro sintonizável Acusto-óptica (AOTF) para a entrega de um comprimento de onda selecionado de fonte entrada de banda larga e um divisor de feixe óptico-acústico (AOBS) para guiar o selecionado refletido comprimento de onda do detector. O software para a microscopia confocal hiperespectral (ver Tabela de materiais) oferece uma opção de varredura espectral personalizável para adquirir sequencialmente as imagens de reflectância em vários comprimentos de onda de entrada. Além disso, a aberração cromática criticamente pode interferir na medição espectral; Portanto, recomenda-se uso de uma lente objetiva de apochromat.

Digno de nota, lasers de luz branca produzir uma saída espectral desigual e componentes ópticos também afetam o perfil espectral. Portanto, os espectros adquiridos precisam ser calibrados para posterior análise quantitativa. Um espelho de prata protegido é geralmente usado como uma referência, que fornece uma reflectância quase constante (> 97%) sobre a região completamente visível. Os espectros adquiridos dividem-se em seguida pelos espectros de referência do espelho.

O tamanho de etapa espectral para a varredura espectral determina a velocidade de aquisição; assim, ele precisa ser otimizado. Como um axónio maior tem um período maior de espectral, requer mais fino amostragem espectral. Por exemplo, um axônio com um diâmetro de 10 µm, dentre os axônios fisiológicos maiores, tem um período espectral de ~ 8 nm. Aplicando os critérios de amostragem de Nyquist, utilizamos o intervalo de amostragem espectral de 4 nm para cobrir todos os axônios fisiológicos nos tecidos nervosos do mouse. Esta abordagem geralmente leva vários segundos para uma varredura espectral completa e, portanto, não é adequada para aplicações na vivo , onde o movimento fisiológico (por exemplo, respiração e batimentos cardíacos) interfere aquisição espectral estável. Anteriormente, resolvemos esse problema por instrumentação um microscópio vertical personalizado, concebido para adquirir todo o espectro para cada ponto usando um espectrômetro de matriz (aquisição velocidade ≈ 30 ms por pixel).

Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado do provador de imagens sobre uma fatia de cérebro fixa, que pode ser executada em um microscópio hiperespectrais comercial (ver Tabela de materiais). Assim, o protocolo pode ser concluído por experimentadores sem especialização em instrumentação óptica. Também abordamos os problemas potenciais e solução de problemas para a aquisição e análise de dados do provador.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da amostra

Nota: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes de manipulação de animais. Realizar todo o desempenho cirúrgico em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.

1. Fixação de tecidos
   1. Prepare duas seringas de 10 mL que cada um preenchido com tampão fosfato salino (PBS) e paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.
   2. Anestesiar um rato de 7-12-semanas, (C57BL/6J ou quaisquer linhas de rato com ambos os sexos) através da administração de uma mistura de zoletil e xilazina (1:1, 20 mg/kg cada) ou um regime alternativo de anestesia adequada (por exemplo, mistura de 80 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg xilazina) com uma injeção intraperitoneal.
   3. Uma vez que o mouse alcançou um plano cirúrgico da anestesia (use o método de pitada-resposta do dedo do pé), expor o coração cortando a pele e a caixa torácica com uma tesoura.
   4. Cortar o átrio direito com uma tesoura pequena para drenar o sangue e perfundir a solução de PBS e PFA sequencialmente através do ventrículo esquerdo com uma agulha (taxa de perfusão = 4 mL/min, volume = 10 mL de cada solução).
      Nota: O rato torna-se duro, se o procedimento for concluído com êxito. O uso de pomada ou esterilização não é necessário que o procedimento é terminal. O procedimento de fixação pode ser ignorado. No entanto, esta etapa é recomendada para minimizar deformações estruturais, incluindo danos nos tecidos mecânicos e inchaço axonal isquêmico. Para mais detalhes sobre a fixação de tecidos, consulte o artigo de Gage, et al . G. J. ¹⁰
2. Preparação da fatia cerebral
   1. Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica através da ventral do tórax e abdômen.
   2. Remova o periósteo usando uma tesoura devidamente pequena até expor totalmente o crânio e o couro cabeludo.
   3. Quebrar o osso frontal e cortar o crânio ao longo da sutura sagital do osso occipital usando tesouras pequenas com cuidado para não danificar o cérebro.
   4. Remova cuidadosamente o crânio e a dura-máter sequencialmente utilizando pinça fina.
   5. Extraia o cérebro usando uma colher de plástico macia, tomando cuidado para não danificar o tecido.
   6. Lave e mergulhe o cérebro extraído em uma solução PFA 4% durante 30 min a 4 ° C.
   7. Corte o cérebro fixo em 100-150 µm seções usando um vibratome.
      Nota: Para obter mais detalhes sobre a preparação do tecido, consulte o artigo por Segev et al ¹¹. para os procedimentos subsequentes, o tecido deve ser cortado em seções mais fino que a espessura do espaçador.
3. Montagem da fatia cerebral
   1. Prepare lâmina de 1 vidro e 2 copos de tampa quadrados (22 × 22 × 0,17 mm) para cada pedaço de tecido.
   2. Cortar um dos copos de tampa quadrados em meia (duas peças retangulares) usando um cortador de vidro.
   3. Anexe os dois dos copos de capa cortados ao meio, usando uma super cola no vidro do slide.
      Nota: O espaço entre os dois copos cortados ao meio deve ser ligeiramente maior que o tamanho da fatia do tecido.
   4. Colher a fatia do cérebro usando um pincel ou uma pipeta e colocar o tecido no vidro entre o espaçador do slide. Tome cuidado para não dobrar o tecido.
   5. Dispense 100 μL de PBS sobre a superfície do tecido.
   6. Coloque o outro vidro tampa quadrado em cima do tecido. Evite a inclusão de bolhas de ar durante esta fase.
   7. Selo em torno do vidro tampa usando um esmalte (ou alternativamente apropriados adesivos) para evitar a evaporação de PBS e contaminação por poeira durante a sessão de imagens subsequente.
      Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.

2. calibração

1. Ligue o microscópio pelo menos 1h antes da imagem latente para permitir a estabilização térmica do laser de origem (ver Tabela de materiais). Em seguida, ativar o software para fazer a varredura espectral (ver Tabela de materiais) e clique no botão adquirir no topo do GUI (Figura 3a).
2. Ative o obturador de software para o laser de luz branca (WLL) e tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 3a).
3. Selecione o modo de xyΛ na lista drop-down no Modo de aquisição, em seguida, o modo de entrada de laser é automaticamente alterado de % constante para Poder constante. Desmarque a caixa de seleção do Movimento automático SP. E em seguida, defina a janela espectral do laser entrada para 470 – 670 nm e o tamanho de etapa espectral a 4 nm na Λ-excitação Lambda Scan configurações (Figura 3b).
4. Defina o intervalo espectral de PGTO para 450-690 clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral (Figura 3C).
   Nota: Esta faixa espectral deve incluir a largura de banda completa da fonte de entrada.
5. Seleccione uma lente objetiva de imersão de água, devidamente com uma abertura numérica elevada (at > 0,7) e dar qualquer valor ao poder de PGTO e laser para ativar o botão configuração AOBS e Live Scan . Mude o caminho óptico, verificando o reflexo na Configuração AOBS (Figura 3d).
6. Montar um espelho de referência (ver Tabela de materiais) na fase de microscópio. A superfície do espelho deve ser enfrentada contra a lente objetiva. Se não é fácil de colocar o espelho no palco microscópio, vínculo um espelho na chapa plana (por exemplo, vidro de slide).
7. Controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a superfície do espelho.
8. Ajustar o ganho de PGTO e a potência do laser, tendo em conta a gama dinâmica do detector e altere o modo de entrada de laser de constante por cento para Poder constante.
   Nota: Como é típico, um PGTO ganho de 500 (V) e um poder relativo do laser de 0.1% são utilizados em 570 nm.
9. Confirme em um modo de cor pseudo para verificar que não há nenhuma saturação em toda a gama de comprimento de onda. Se for observada a saturação, reduzir a potência do laser (Figura 3a).
10. Execute a aquisição de Lambda Scan .
11. Retire o espelho do palco e repetir a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura (ou seja, deslocamento escuro).
12. Salve os dados em um formato TIF Multistacked .

3. aquisição de imagens provador

1. Coloque o tecido montado no palco do microscópio. Para aproximadamente alinhar o tecido para o plano focal da lente da objetiva, use o modo de fluorescência de campo amplo através de uma parte do olho.
2. Com a Varredura de viver lá, controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione a região alvo de pelo menos 15 μm de profundidade a partir da interface de vidro-tecido.
3. Adquira a pilha de imagem espectral para a região de destino usando o mesmo procedimento como descrito nos passos 2.1 – 2.10.
4. Salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro em formato TIF Multistacked .
   Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.

4. processamento e análise de imagem

1. Abra os dados espectrais (multistacked TIF) para o espelho de referência e o tecido cerebral no ImageJ.
2. Selecione o ROIs (regiões de interesse) para as pilhas de imagem aberto — a área central para o segmento de uma fibra do axônio para o tecido cerebral e o espelho de referência.
3. Adquirir os espectros brutos para o ROIs selecionado pela execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.
4. Abra os dados de deslocamento escuros, uma tomada para o espelho de referência e os outros que eram levados para o tecido cerebral.
5. Adquirir os espectros para os deslocamentos escuros por execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.
6. Salve todos os espectros adquiridos usando as opções copiar e colar .
   Nota: Para a imagem latente do provador, uso do campo de imagem central para minimizar as aberrações ópticas fora do eixo é recomendado. As fibras de axônio podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seu comprimento. Daí, selecionando o ROI em um segmento do axônio pequenos, tipicamente < 5 µm, para minimizar o volume parcial artefato é recomendado.

5. linha de base correção e análise de sinal de provador

1. Subtrai os deslocamento espectros dos espectros do espelho de referência e os tecidos do cérebro.
2. Normalize cada espectro dividindo-se a intensidade máxima do espectro.
3. Dividir o espectro normalizado do axônio pelo espectro normalizado do espelho de referência e subtrair deslocamento DC do espectro normalizado.
4. Medir a frequência de wavenumber encaixando o espectro adquirido para um sinusoidal curva (ver Tabela de materiais) e em seguida, converter o wavenumber adquirida a periodicidade por tomar recíproca.
5. Converta a periodicidade wavenumber ao diâmetro do axônio, usando a equação na Figura 4C.

Resultados

De acordo com o protocolo, uma fatia do cérebro fixa foi preparada com coloração exógenos, um fluoróforo mielina-direcionamento (ver Tabela de materiais). Imagem de provador foi realizada na fatia cérebro usando um microscópio confocal hiperespectrais comercial em conjunto com fluorescência confocal de imagem (figura 4a). Para provador, entrada intensidade óptica foi definida como 5 µW/µm² com um tempo de interrupção d...

Discussão

Provador é uma nova modalidade de imagem livre de rótulo baseada na interferometria espectral, que pela primeira vez, oferece a informação de nanoescala em axônios mielinizadas ao vivo. No actual protocolo de aquisição, a resolução espacial para o diâmetro do axônio é da ordem de 10 nm. Além disso, o provador utiliza ordens de magnitude menor dose leve em comparação com outros microscopies de super-resolução; assim, é livre de fototoxicidade e fotobranqueamento. Provador forneceria uma nova avenida para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.