Indução cirúrgica simples da perda auditiva condutora com verificação usando a visualização do otoscópio e a resposta comportável do startle do clap no rato

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer uma indução de perda auditiva condutora replicável por meio de punção cirúrgica da membrana de tympanic e verificação por visualização de otoscópio e avaliação comportamental por verino de gonorreia.

Resumo

A perda auditiva condutiva (CHL) é um comprometimento auditivo prevalente em seres humanos. O objetivo do protocolo é descrever um procedimento cirúrgico simples para induzir CHL em roedores. O protocolo demonstra CHL por punção de membrana tympanic. A verificação da cirurgia de CHL foi por exame de otoscópio e avaliação comportamental por resposta ao vermão, tanto replicável quanto confiável, e são métodos simples para demonstrar que a perda auditiva ocorreu. O procedimento simples de CHL é vantajoso devido à sua reprodutibilidade e flexibilidade a diferentes atividades na pesquisa de perda auditiva. As limitações da indução de LCH por abordagem cirúrgica estão associadas à curva de aprendizagem para realizar o procedimento cirúrgico e a confiança no exame audiológico. Induzir uma deficiência auditiva por CHL permite que um estude prontamente as manifestações neurais e os resultados comportamentais da perda auditiva.

Introdução

A prevalência da perda auditiva em crianças e adultos é de aproximadamente 19,5%¹ e 15,2%^2, respectivamente. No entanto, aproximadamente 39,3% de todos os recém-nascidos com triagem auditiva anormal não recebem tratamento corretivo conforme relatado pelo Centers for Disease Control³. A perda auditiva é uma condição amplamente estudada, e o roedor é um modelo robusto para estudar distúrbios normais relacionados à audição e audição^{4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15.} Distúrbios auditivos como perda auditiva condutiva (LE) levam a um aumento da depressão sináptica de curto prazo no córtex auditivo^4,o que resulta em inclinações psicométricas mais rasas associadas a limiares de detecção de modulação de frequência ⁵. Modelos de perda auditiva condutora por remoção/deslocamento cirúrgico do malleus, punção da membrana tympanic (TM) ou tampão de ouvido são facilmente empregados e permitem a rápida indução do modelo de perda auditiva^{5,14 ,15,16,17,18.} O objetivo do protocolo e método atual é demonstrar um modelo CHL simples e reproduzível em roedores.

O protocolo atual é barato (US$ 300 com todas as ferramentas) e prontamente alterado para diferentes atividades de pesquisa. O rato teve avaliações detalhadas da anatomia do ouvido médio^{19,20,21,22,23}, abordagens cirúrgicas²⁴, modelos em otitis media^{25, 26,27} e regeneração de perfuração TM^{16,17,18,28,29,30,}tornando-se um modelo ideal para estudar perda auditiva. Aqui, um procedimento simples da indução de CHL é descrito com verificação pelo otoscope e pela avaliação com resposta do startle do aplauso no rato, que então pode ser usado para explorar sequelas adicionais da perda de audição. O procedimento de LE é induzido pela punção cirúrgica do TM. A verificação do procedimento de CHL é realizada por visualização de otoscópio para determinar a ausência do TM. A avaliação comportamental é realizada por um alto nível de pressão sonora (DB) (SPL) palmas. Este método foi aplicado previamente em uma variedade de roedores. É fácil de replicar, produz diferenças psicométricas robustas e mudanças nas respostas fisiológicas neurais^{4,5,16,17,18.}

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Protocolo

O presente estudo e procedimentos foram aprovados pelos comitês de ética em pesquisa animal da Universidade da Cidade de Hong Kong, da Universidade de Hong Kong e do Departamento de Saúde da Região Administrativa Especial de Hong Kong.

1. Animais

1. Use ratos Sprague-Dawley (SD) de dois meses (N = 90, 200-250 g).
   NOTA: Roedores foram fornecidos pela unidade animal do laboratório acreditada da universidade de Hong Kong.
2. Mantenha os ratos uma temperatura constante de 25 °C e umidade de 60-70% na Unidade de Pesquisa Animal do Laboratório.
3. Casa de roedores em 12/12-h luz / ciclos escuros com acesso a alimentos e água potável, ad libitum.
4. Aclimata roedores ao ambiente de carcaça no mínimo um dia antes da cirurgia de CHL.
5. Pegue o roedor pela nuca e anestesiar o roedor com um coquetel de cetamina e xilacina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, respectivamente) via injeção intraperitoneal (combinar 1,0 mL de cetamina com 0,5 mL de xilazine como uma concentração final).
   NOTA: Use um 1 mL de seringa com uma agulha 23-25G. Injete aproximadamente 0,2 mL por 100 g de peso corporal do rato por 30 min de anestesia.
6. Executar a pitada do dedo do pé para verificar a sensação de dor e para corroborar a anestesia adequada. Uma reação à pitada profunda do dedo do pé (pela retirada do membro traseiro) indica anestesia insuficiente.

2. Configuração cirúrgica

1. Esterilizar todos os equipamentos em um esterilizador de contas de vidro quente ou autoclave antes do início da cirurgia. Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
2. Use luvas de látex e jaleco antes de iniciar o procedimento.
3. Coloque uma cortina cirúrgica estéril no banco limpo(Figura 1A).
4. Esterilizar microtesouras e um otoscópio antes da cirurgia para minimizar a infecção do ouvido(Figura 1B).
5. Coloque a micro-tesoura e otoscópio na área estéril.
6. Coloque o roedor no campo cirúrgico e em alinhamento com o cirurgião.
7. Prossiga com a indução cirúrgica de CHL.

3. Indução cirúrgica de perda auditiva condutiva

1. Coloque a cauda e a cabeça do roedor alinhadas em uma posição propensa, cabeça mais próxima do cirurgião.
2. Visualize a orelha esquerda e direita do roedor o ostocópio para garantir a membrana de tympanic saudável (Figura 2a). Avalie a orelha direita e esquerda de cada roedor para verificar a condição saudável antes da indução de CHL.
3. Pegue a hélice do ouvido e estenda o canal auditivo externo (ou seja, canal auditivo, carne auditiva externa, canal auditivo) para fazer com que o interior fique obscurecido e enegrecido pela profundidade. Aqui, o canal auditivo é feito perpendicular à superfície do TM.
   NOTA: Certifique-se de que o cannel auditivo esteja diretamente paralelo agora e a TM forma um ângulo reto com o eixo de inserção da microtesoura. Ele será visualizado como um tubo preto sem luz. Às vezes, o canal auditivo precisa ser inclinado em um ângulo leve, aproximadamente 15° para a superfície planar do crânio. Isso garante que a mão do cirurgião é perpendicular à superfície do TM.
4. Introduza a micro-tesoura no centro do canal auditivo prestando atenção para não roçar ou cortar o tecido do canal auditivo e proceder ligeiramente, aproximadamente 5 mm do centro da obscuridade, empurrando para a frente suavemente através do centro da TM.
   NOTA: A punção de TM pode ser confirmada por um som pop quando as pontas da micro-tesoura perfuram o TM. O som de estalo pode ser ouvido aproximadamente em 2 min 52 s no vídeo. Este não é um som de tesoura; este é um som de punção TM. Medida após a análise, o "pop" é aproximadamente 20 dB SPL maior do que o som de fundo, conforme registrado por um microfone de alta frequência. Não há necessidade de verificar o som "pop" a este ponto, visualização de otoscópio é suficiente. O investigador pode precisar de praticar garantir que um 'pop' seja ouvido durante cada procedimento de CHL.
5. Abra imediatamente a micro-tesoura carregada de mola e gire três vezes após a punção do TM para garantir o deslocamento da cabeça do malleus longe do TM (somente se o deslocamento malleus é desejado).
6. Retire a micro-tesoura e coloque o roedor o otoscópio para visualização.
   NOTA: É importante notar que nenhum sangramento significativo deve ocorrer após o procedimento cirúrgico. Eutanásia do roedor e não proceder à avaliação comportamental se ocorrer sangramento.
7. Induzir chl bilateral, procedendo como acima no ouvido oposto.

4. Visualização de otoscópio

1. Confirme uma cirurgia bem sucedida de CHL com um otoscópio usando um speculum de pequeno diâmetro para visualizar a orelha média do roedor.
2. Avalie cada roedor antes e depois do procedimento cirúrgico do CHL debaixo do otoscópio. Garantir a confirmação do TM normal(Figura 2a)e tm danificado após a indução CHL(Figura 2b).
3. Cuidados pós-operatórios para o roedor
   1. Coloque o roedor na gaiola em casa uma lâmpada quente.
   2. Observe a indução do roedor após o CHL até que o roedor se alegre.
   3. Injete o roedor com soro de glicose (dextrose/soro soro) para recuperar a consciência e colocar roedores na gaiola para recuperação.
      NOTA: Use uma agulha 23G com uma seringa de 10 mL para injetar 5 mL de soro para soro após a cirurgia de CHL.
   4. Injete o roedor via intramuscular com enrofloxacina antibacteriana 0,05 mg/kg duas vezes durante o período de recuperação de 24 h.
   5. Observe o roedor regularmente para o comportamento ou os sintomas da dor após a cirurgia.

5. Avaliação comportamental (validação da indução de CHL) - resposta do início do aplauso

1. Corroborar chl (após a confirmação do otoscópio) 24 h pós-cirurgia com a avaliação comportamental consistindo no clap-startle-teste.
2. Coloque o rato induzido chl ao lado de um rato normal em duas gaiolas adjacentes separadas.
3. Coloque os roedores em uma sala silenciosa.
4. Fique a aproximadamente 0,5 m de distância dos roedores e continue a bater palmas em durações igualmente espaçadas várias vezes (5 palmas foram escolhidas e espaçadas acima de 1 segundo).
   NOTA: O vermão de palmas produzido pelo aplauso medido - 40 dB SPL maior do que o som de fundo, como registrado por um microfone de alta freqüência.

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Resultados

O procedimento simples do CHL foi executado em 90 ratos e fora deste grupo 2 teve o sangramento significativo e 2 não teve a perda da audição o next day como avaliado pelo startle comportável do clap. Estes quatro ratos foram descartados. Os ratos devem ser descartados conforme descrito pelas razões da discussão devido a complicações. Induzir a punção e/ou o deslocamento/ou a remoção do malleus do TM(figura 2B)elicia CHL, que conduz às manifesta?...

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Discussão

Descrevemos uma simples indução cirúrgica de CHL com verificação usando visualização de otoscópio e resposta comportamental de verniz em ratos. Aqui demonstramos o método em rato e anteriormente este método foi aplicado a gerbils e camundongos. O método pode ser facilmente adotado para outros roedores. A indução da CHL permite o estudo de uma forma sutil de perda auditiva que se manifesta em alterações corticais auditivas e achados comportamentais psicofísicos^4,

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex, polyvinyl or nitrile gloves	AMMEX		Use unpowdered gloves 8-mil
Micro spring scissors (see Fig. 1b)	RWD Life Science	S11035-08	8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice
Otoscope mini 3000	HEINE	D-008.70.120M	Standard LED otoscope will suffice
Rat or mouse	JAX labs		Any small rodent
Small rodent cage	Tecniplast	1284L	Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2