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Resumo

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Resumo

Até à data, vários tipos de células-tronco em diferentes estádios de desenvolvimento estão no foco para o tratamento de doenças degenerativas. Ainda, certos aspectos, tais como morte celular maciça inicial e baixos efeitos terapêuticos, prejudicada sua ampla tradução clínica. Engenharia genética de células-tronco antes da transplantação surgiu como um método promissor para otimizar os efeitos terapêuticos de células estaminais. No entanto, sistemas de entrega segura e eficiente do gene ainda estão faltando. Portanto, o desenvolvimento de métodos adequados pode fornecer uma abordagem para resolver desafios atuais de terapias baseadas em células-tronco.

O presente protocolo descreve o extração e caracterização de células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) bem como suas modificações genéticas não-virais. O folículo dental pós-natal revelou-se como uma fonte promissora e facilmente acessível para a colheita de células estaminais adultas multipotentes possuindo potencial de alta proliferação. O procedimento de isolamento descrito apresenta um método simples e confiável para colher hDFSCs de dentes do siso. Este protocolo inclui também métodos para definir as características de células-tronco de células isoladas. Para a engenharia genética de hDFSCs, uma estratégia otimizada do transfection baseada em lipídios catiônicos é apresentada permitindo introdução de microRNA altamente eficiente sem causar efeitos citotóxicos. MicroRNAs são candidatos adequados para manipulação de célula transitória, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de integração estável do genoma. Assim, este protocolo representa um procedimento seguro e eficiente para a engenharia de hDFSCs que pode se tornar importante para otimizar sua eficácia terapêutica.

Introdução

O folículo dental humano é um frouxo ectomesenchymally-derivado do tecido conjuntivo em torno do desenvolvimento dente1,2. Ao lado de sua função de coordenação osteoclastogenesis e osteogênese para o processo de erupção do dente, este tecido abriga células estaminais e progenitoras especialmente para o desenvolvimento do periodonto,4,3,5. Portanto, o folículo dental é considerado como uma fonte alternativa para colher células-tronco adultas humanas6,7.

Vários estudos demonstraram que as células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) são capazes de diferenciar em linhagem periodontal, incluindo osteoblastos, fibroblastos do ligamento e cementoblastos8,9,10 . Além disso, essas células foram mostradas para coincidir com todas as características de células estromais mesenquimais (MSCs) incluindo a capacidade de auto renovadora, aderência plástica, expressão de marcadores de superfície específicas (por exemplo,, CD73, CD90, CD105), bem como osteogênico, adipogenic e chondrogenic diferenciação potencial11,12,13. Outros estudos também revelaram um potencial de diferenciação neural de hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Devido a suas propriedades promissoras e fácil acesso, o hDFSCs tornou-se recentemente relevante para a engenharia de tecido19,20,21. Os primeiros estudos concentraram-se sobre o potencial de DFSCs de regeneração óssea, periodontal e raízes de dente19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde o conhecimento da funcionalidade de neurogênica de hDFSCs, sua aplicação como potencial tratamento para doenças neurodegenerativas tem sido investigados31,32,33. HDFSCs também ganharam importância com respeito à regeneração de outros tecidos (por exemplo, o epitélio corneano)34,35. O potencial terapêutico de hDFSC não se baseia apenas em seu potencial de diferenciação directa, mas também na sua atividade parácrina. Recentemente, hDFSCs têm sido mostrados para secretar uma variedade de fatores bioativos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e crescimento hepatócito fator (HGF), que desempenham um papel crucial para a angiogênese, imunomodulação, remodelação da matriz extracelular e processos reparativa36.

No entanto, ampla tradução clínica da terapia de células-tronco ainda é prejudicada por vários desafios, como a morte maciça inicial celular e células-tronco baixo benéfico efeitos37,38. Engenharia genética fornece uma estratégia promissora para enfrentar esses desafios e, portanto, pode aumentar consideravelmente a eficácia terapêutica de células-tronco38,39,40. Para manipulação de célula transitória, microRNAs (miRs) são candidatos adequados, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de genoma estável integração41,42, 43. até à data, vários miRs benéficos foram identificados promovendo a proliferação de células-tronco, sobrevivência, orientação, atividade parácrina bem como a sua diferenciação em várias linhagens44. Por exemplo, miR-133a engenharia MSCs mostrou uma maior sobrevivência e enxertia em corações de rato enfartado, resultando em uma melhor função cardíaca quando comparado a não modificado MSCs45. Da mesma forma, miR-146 superexpressão MSCs foram mostrados a secretar quantidades mais elevadas de VEGF, que por sua vez, levou a uma maior eficiência terapêutica no tecido isquêmico46.

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a extração seletiva e engenharia genética de hDFSCs. Para este fim, descrevemos a digestão enzimática e colheita dos folículos dentários humanas, bem como o posterior isolamento do hDFSCs. Para caracterizar células isoladas, instruções importantes para a verificação das propriedades MSC foram incluídas em conformidade com as diretrizes da sociedade internacional para terapia celular13. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada para a geração de hDFSCs miR-modificado pela aplicação de uma estratégia de transfeccao baseada em lipídios catiônicos e a avaliação da eficiência do transfection e citotoxicidade.

Protocolo

HDFSCs são isolados os folículos dentários dos dentes do siso extraídos fornecidos pelo departamento de Cirurgia Buco Maxilo facial plástica do centro médico da Universidade de Rostock. Obteve-se consentimento informado e autorização por escrito de todos os pacientes. Este estudo foi autorizado pelo Comitê de ética local da Universidade de Rostock (permissão No. A 2017-0158).

1. isolamento de hDFSCs

Nota: Para evitar a contaminação bacteriana, o dente do siso não deve ser eclodiu antes de extração

  1. Preparação das soluções necessárias
    1. Preparar o tampão fosfato salino (PBS) / solução de penicilina-estreptomicina-glutamina (P-S-G): misturar 495 mL de PBS com 5 mL de solução de P-S-G. Loja alíquotas de 50 mL a 4 ° C.
    2. Preparar o meio de cultura de hDFSC: misturar 445 mL de meio basal com 5 mL de agente antibiótico e 50 mL de soro fetal bovino (FBS). Loja a 4 ° C.
    3. Preparar o tipo de colagenase armazeno solução (30 mg/mL): diluir 300 mg de tipo de colagenase em 10 mL de meio basal suplementado com 1% de agente antibiótico. Misture vigorosamente a solução. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm. Loja alíquotas de 500 µ l de colagenase tipo I solução estoque a-20 ° C.
    4. Preparar a solução Dispase II (40mg/mL): diluir 40 mg de Dispase II em 10 mL de meio basal suplementado com 1% de agente antibiótico. Misture vigorosamente a solução. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm. Loja alíquotas de 500 µ l de solução-mãe Dispase II a-20 ° C.
  2. Procedimento cirúrgico
    1. Injetar uma quantidade suficiente (máximo: 2 mL) de solução de anestésico local.
    2. Criar e aumentar um retalho mucoperiosteal três lados. Não é necessário criar um retalho lingual.
    3. Protege o aspecto lingual com um elevador periosteal.
    4. Delicadamente moinho bucal e distal osso com uma rebarba redonda de metal duro.
    5. Solte o tecido do folículo com um elevador periosteal. Remova cuidadosamente o dente completo (germe) e folículo puxando a coroa (e folículo) com posterior fórceps (terceiro-molar).
    6. Debride e irrigar o soquete abundantemente com solução de NaCl.
    7. Substitua o retalho mucoperiosteal com suturas de vicryl (ver Tabela de materiais).
    8. Remover o folículo do dente da cavidade oral e colocá-los em uma alíquota de 50 mL de solução de PBS/P-S-G.
      Nota: A amostra pode ser armazenada a 4 ° C até o processamento adicional.
  3. Digestão enzimática do folículo dente
    1. Pré-aquecer o meio de cultura de hDFSC e solução de PBS/P-S-G, à temperatura ambiente (RT).
    2. Descongele uma alíquota de cada tipo de colagenase eu e soluções estoque de Dispase II. Prepare uma solução de digestão de 3 mg/mL tipo colagenase eu e 4 mg/mL Dispase II adicionando 500 µ l de cada colagenase tipo I e a solução de 4 mL de basal médio contendo 1% antibiótico agente Dispase II.
    3. Coloque o folículo extraído em uma placa de Petri estéril e adicionar 10 mL de solução de PBS/P-S-G para lavar o tecido extraído. Repita este passo de lavar duas vezes.
    4. Picar o folículo extraído em pedaços de cerca de 1 x 1 mm com um bisturi estéril dentro da placa de Petri contendo 10 mL de solução de PBS/P-S-G.
    5. Tecido de transferência picada e solução de PBS/P-S-G a partir de Petri em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lave a placa de Petri com 10 mL de solução de PBS/P-S-G e transferir a solução para o mesmo tubo.
    6. Centrifugar o tubo de centrifuga conico por 10 min a 353 x g em RT e descartar o sobrenadante.
    7. Adicione 5 mL de solução de digestão no tecido granulado. Misture suavemente a solução e o tecido. Incube a mistura a 37 ° C e 5% CO2 por 2 h em uma incubadora de agitação.
    8. Centrífuga digerido suspensão de célula/tecido 353 x g durante 10 minutos no RT. descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento Obtido em 6 mL de meio de cultura de hDFSC.
    9. Suspensão de células de sementes em um 25 cm2 frasco de cultura de células e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.
      Nota: Se o tecido não é completamente digerido, transferi o tecido restante para o frasco de cultura celular também.
    10. Mude meio cuidadosamente 24 h após a semeadura da célula. Depois mude o médio a cada três dias até a confluência.
      Nota: HDFSCs devem ser plástico aderente 24 h após a semeadura da célula e podem ser separadas de células não-aderentes e os componentes sanguíneos, simplesmente alterando o meio.
  4. Colheita de células
    1. Pre-aquecer o meio de cultura de hDFSC, a solução de PBS/P-S-G e a solução de ácido (EDTA) tripsina/ácido etilenodiaminotetracético para RT
    2. Descartar o sobrenadante do frasco de cultura e lavar confluentes com 5 mL de solução de PBS/P-S-G.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina/EDTA para o frasco de cultura e incubar durante 3 min a 37 ° C. Interrompa o processo de digestão, adicionar 3 mL de meio de cultura de hDFSC para o frasco de cultura.
    4. Suspensão de células de transferência em um tubo de centrifuga conico de 15 mL e centrifugar a suspensão por 10 min a 353 x g em RT. descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em uma quantidade apropriada de meio de cultura de hDFSC.
    5. Contar as células: misture suavemente 10 µ l de suspensão de células com 10 µ l de solução de azul de Tripan. Aplicar 10 µ l em uma câmara de contagem e calcular a quantidade de células hDFSC.

2. caracterização do hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Preparação de células para análise de fluxo cytometric
      1. Preparação das soluções necessárias
        1. PBS/EDTA (2 mM) de preparar: misturar 996 mL de PBS com 4 mL de EDTA (0,5 M).
        2. Preparar o buffer de coloração: misture 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) com 5 g de BSA. Filtrar a solução usando uma unidade de filtro de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C até o uso.
        3. Preparar a solução de paraformaldeído (PFA) (4%): diluir PFA 4G em 100 mL de PBS e aquecer a solução a 80 ° C. Misturar a solução e ajustar o valor de pH de 7,3. Alíquota obtido solução PFA em montantes respectivos (1,5 mL) e loja a-20 ° C até o uso.
          Cuidado: Porque PFA fumos são tóxicos, prepare a solução PFA em uma coifa ventilada.
      2. Após a célula da colheita (1.4), transferi 14 amostras de 5 x 104 células para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. Centrifugar as suspensões a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
        Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células e os reagentes no gelo, salvo indicação em contrário.
      3. Ressuspender as células em determinadas quantidades de buffer de coloração (4 ° C) e adicionar FcR bloqueando o reagente (4 ° C), conforme indicado na tabela 1.
      4. Adicionar os seguintes anticorpos para o lado interno da respectiva amostra, conforme indicado na tabela 1: Allophycocyanin (APC) do mouse anti-humano CD29; Rato APC controle de isotipo IgG1 κ; Proteína peridinin-clorofila (PerCP)-Cyanine5.5 do mouse anti-humano CD44; PerCP-Cyanine5.5 rato controle de isotipo IgG2b κ; V500 rato anti-humano CD45; V500 rato controle de isotipo IgG1 κ; Ficoeritrina (PE) do mouse anti-humano CD73; Rato de PE controle de isotipo IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 do mouse anti-humano CD90; PerCP-Cyanine5.5 rato controle de isotipo IgG1 κ; mouse anti-humano CD105: Alexa Fluor (AF) 488; controle negativo de IgG1 de mouse: AF488; PE-Cyanine7 do mouse anti-humano CD117; PE-Cyanine7 rato IgG1, controle do isotipo κ. Depois de anticorpos foram adicionados para cada amostra, spin para baixo de anticorpos e misture delicadamente. Incubar as soluções durante 10 minutos a 4 ° C.
      5. Adicionar 1 mL de PBS (4 ° C) e centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
      6. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS (4 ° C) e adicione µ l 33 de PFA (4%). Misturar as soluções e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
    2. Medição de fluxo cytometric de células
      Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células no gelo até a medição.
      1. Para examinar a expressão de antígenos de superfície, transferir as amostras para tubos adequados para medições de fluxo cytometric.
      2. Medir pelo menos 2 x 104 eventos usando um citômetro de fluxo. Analise como está representada na Figura 2.
  2. Potencial de diferenciação multipotentes de hDFSCs
    1. Use um comercialmente disponível humana Mesenchymal Stem Cell funcional identificação Kit para confirmar adipogenic, osteogênico e potencial de diferenciação chondrogenic de hDFSCs. Aplicar o anticorpo secundário de burro de anti-cabra AF488 para coloração de ácido graxo proteína 4 (FABP4) e aggrecan bem como anticorpo secundário de burro anti-rato AF488 para coloração de osteocalcina. Para a coloração de núcleos, use o meio de montagem com 4' 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Nota: Prepare amostras sem anticorpo primário como controles negativos para análises microscópicas.
    2. Analise a expressão de proteínas por laser, microscopia confocal. Configurações de microscopia: 40 x objetivo com a imersão de óleo; excitação do laser 488 nm (para AF488) e 405 nm (DAPI).

3. a transfeccao de hDFSCs

  1. Após a célula da colheita (1.4), as sementes hDFSCs sobre uma placa de cultura de células 24-poço 24 h antes do transfection.
    Nota: Começando a densidade celular é de aproximadamente 4 x 104 células por poço. Células devem alcançar confluência de ~ 80% no dia do transfection.
    Nota: As sementes uma amostra de células adicionais como controle para análise de fluxo cytometric.
  2. Preparação de complexos de transfeccao
    Nota: Para evitar a contaminação de RNases, limpe o espaço de trabalho diretamente antes de preparação dos complexos de transfeccao usando solução de descontaminação de RNase. Use somente material livre de RNase e soluções.
    Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada.
    1. Preparar a solução-mãe de miR (50 µM): re-suspender miR com rótulo Cy3 precursor (5 nmol) na água de nuclease livre 100 µ l. Solução-mãe de alíquota miR obtidos em loja no escuro a-20 º C até o uso e respectivos montantes (5 µ l).
    2. Dilua a 40 pmol de miR (0,8 µ l de solução-mãe miR 50 µM) em 66,7 µ l de meio de soro reduzida. Misture a solução suavemente
    3. Dilua 0.67 µ l de reagente de Transfeccao de baseada em lipídios catiônicos em 66,7 µ l de meio de soro reduzida. Misture a solução suavemente e incubar durante 5 min à RT
    4. Após a incubação, adicione o reagente de transfeccao pré-diluído para a miR pre-diluída. Misture a solução suavemente e incube por 15 min no RT
  3. Adicione gota a gota os complexos de transfeccao preparado diretamente para o meio de cultura de células. Misture delicadamente agite-a placa de cultura de células de 24-bem e para trás.
  4. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 20% O2 por 24 h.

4. análise do Transfection

Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada.

  1. Célula da colheita depois de transfeccao
    Nota: Recolha todas as soluções de célula de uma amostra no tubo de centrifuga conico de 15 mL mesmo.
    1. 24 h após a transfeccao, recolher o sobrenadante de amostras em tubos de centrífuga respectivos.
    2. Lavar as células com 1 mL de PBS, PBS de transferência para o tubo de centrifugação respectivos e adicione 500 µ l tripsina/EDTA (RT) para as células. Incubar as soluções para 3 min a 37 ° C.
    3. Pare tripsinização, adicionando 1 mL de meio de cultura (RT) para as células e a transferência da solução no tubo de centrífuga respectivos. Células de centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      Nota: A partir deste momento, manter células e reagentes no gelo, salvo indicação em contrário.
  2. Preparação de células para análise de fluxo cytometric
    1. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 µ l de tampão de coloração (4 ° C) e transferência celular solução para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    2. Adicione 0,5 µ l de corante reativo de amina para as amostras a fim de distinguir entre células vivas e mortas. Delicadamente, misturar a solução e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
    3. Adicionar 1 mL de PBS (4 ° C) para as células e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    4. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS (4 ° C) e adicione µ l 33 de PFA (4%). Misturar as soluções e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
  3. Medição de fluxo cytometric de células
    Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células no gelo até a medição.
    1. Transferi as amostras para tubos adequados para medições de fluxo cytometric.
    2. Examine a viabilidade celular e eficiência de absorção de miR usando um citômetro de fluxo. Medir pelo menos 2 x 104 eventos. Use a estratégia associada representada na Figura 4.
      Nota: Use células untransfected como controlo negativo para organizar o gating para células positivas Cy3 e calcular a morte celular causada por transfecção.

Resultados

Aqui, apresentamos uma instrução detalhada de isolamento para colher hDFSCs do tecido do folículo dental humana. Devido ao fácil acesso do folículo dental durante cirurgia de rotina, é uma fonte promissora para a extração de células-tronco adultas.

O hDFSCs isoladas mostrou todas as características descritas para a definição do MSCs13. Na verdade, as células foram plástico aderente sob descr...

Discussão

Células-tronco adultas estão atualmente em foco para o tratamento de diversas doenças degenerativas. Em particular, a medula (BM) óssea-derivadas de células-tronco, incluindo as células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) e MSCs, estão sob investigação clínica intensiva47. No entanto, BM colheita é um procedimento invasivo, causando dor no local da doação e pode levar a efeitos adversos48. Recentemente, o tecido dental pós-Natal tem emergido como um romance ...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programa Forum de Rostock University Medical Centre (889018) e a Fundação úmida (2016-11). Além disso, P.M. e R.D. são suportados pelo BMBF (VIP + 00240).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 AntibodyBD Biosciences559883Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences555751Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 AntibodyBD Biosciences550257Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences555749Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 AntibodyBD Biosciences339217Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences557872Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 AntibodyBD Biosciences560531Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences558304Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 AntibodyBD Biosciences561557Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences55095Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 AntibodyBD Biosciences560777Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences560787Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, humanMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification KitR&D SystemsSC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination SolutionThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1Thermo Fisher ScientificAM171105nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPISigma-AldrichF6057-20MLhistology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscopeZeiss
BD FACS LSRII flow cytometerBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 softwareZeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)BiochromL2143in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antibiotic, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Collagenase type IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µmBraun4099206
50 mL conical centrifuge tubeSarstedt62,547,254
15 mL conical centrifuge tubeSarstedt62,554,502
Cell culture flask 75 cm2Sarstedt833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2Sarstedt833,911,002
Freezing medium, BiofreezeBiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671.8 mL
Trypan blue solutionSigma-AldrichT81540.4 %
Counting chamberPaul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%Mibe
NaCl solutionBraun0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapideEthicon3 - 0

Referências

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