Escolha e bioensaios não-escolha para estudar a preferência de pupa e sucesso de surgimento de Ectropis grisescens

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a preferência de pupa de larvas maduras de Ectropis grisescens em resposta a fatores de solo (por exemplo, conteúdo de tipo e umidade do substrato) utilizando bioensaios de escolha. Apresentamos também um protocolo de não-escolha de bioensaios para determinar os fatores que afetam os comportamentos de pupa e sobrevivência de E. grisescens.

Resumo

Muitos insetos vivem acima do solo, como larvas e adultos e como pupate abaixo do solo. Em comparação com as fases acima do solo dos respectivos ciclos de vida, menos atenção no efeito de fatores ambientais como estes insetos quando eles pupate dentro do solo. O looper chá, Warren Ectropis grisescens (Lepidoptera: Geometridae), é uma praga severa de plantas de chá e causou enormes prejuízos econômicos no sul da China. Os protocolos descritos aqui visam investigar, através de bioensaios de múltipla escolha, se amadurecer último ínstar E. grisescens larvas podem discriminar variáveis de solo, tais como o conteúdo de tipo e umidade do substrato e determinar, através da não-escolha bioensaios, o impacto do substrato tipo e umidade conteúdo comportamentos de pupa e o sucesso de surgimento de E. grisescens. Os resultados aumentaria a compreensão da ecologia de E. grisescens pupa e podem trazer insights sobre táticas de gestão dos solos para suprimir as populações de E. grisescens . Além disso, estes bioensaios podem ser modificados para estudar as influências de vários fatores sobre os comportamentos de pupa e sobrevivência de pragas de solo-pupating.

Introdução

Em comparação com as fases de larvas e adultas de insetos, a fase de pupa é altamente vulnerável, devido à limitada capacidade móvel de pupas, que não pode escapar rapidamente de situações perigosas. Pupating abaixo do solo é uma estratégia comum usada por diversos grupos de insetos (por exemplo, nas ordens Diptera^1,2,3,4, Coleoptera⁵, Hymenoptera⁶, Thysanoptera⁷e Lepidoptera^8,9,10,11,12) para protegê-los de predadores acima do solo e riscos ambientais. Muitos deles são graves agrícola e florestal pragas^{1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12}. As larvas maduras desses insetos do solo-pupating geralmente deixar seus hospedeiros, cair no chão, vagueiam para encontrar um local adequado, escavam o solo e construir uma câmara pupal por pupating^8,10.

O looper chá, Warren Ectropis grisescens (Lepidoptera: Geometridae), é uma das mais importantes pragas desfoliante do chá da planta Camellia sinensis L.¹³. Embora esta espécie foi descrita pela primeira vez em 1894, ele foi identificado por engano como Prout Ectropis obliqua (Lepidoptera: Geometridae) no passado décadas^14,15. As diferenças na morfologia, biologia e distribuição geográfica entre as duas espécies de irmãos têm sido descritas em alguns recentes estudos^14,15,16. Por exemplo, Zhang et al . ¹⁵ relatou que E. oblíquo ocorreu principalmente nas fronteiras de três províncias (Anhui, Jiangsu e Zhejiang) da China, enquanto que E. grisescens tem uma distribuição geográfica muito maior em comparação com oblíquo E.. Portanto, as perdas econômicas causadas por E. grisescens em grande parte são negligenciadas, e o conhecimento desta praga precisa ser amplamente revisto e renovado^16,17,18,19 . Nossos estudos anteriores mostraram que E. grisescens preferem empupar no solo, mas também pode empupar quando o solo não está disponível (condições não-pupa-substrato)^11,12.

Este artigo fornece um procedimento passo a passo para (1) determinar a preferência de pupa de E. grisescens em resposta a fatores como o tipo de substrato e umidade de conteúdo por meio de bioensaios de múltipla escolha e (2) determinar o impacto dos fatores abióticos sobre os comportamentos de pupa e sucesso de surgimento de E. grisescens por meio de bioensaios não-escolha. Todos estes bioensaios são conduzidos sob condições de laboratório bem controlados. Além disso, estes bioensaios são adaptados para avaliar a influência de outros fatores sobre os comportamentos de pupa e sobrevivência de diversos insetos de solo-pupating.

Protocolo

1. umidade-escolha bioensaios para determinar a preferência de pupa de E. grisescens

1. Obtenção de larvas de último ínstar maduras de E. grisescens
   1. Corte brotos frescos (30-40 cm de comprimento) de plantas de chá (Camellia sinensis L.). Inserir a 25-30 tiros num triangular de 250 mL. Encha o frasco com água da torneira. Colocar balões de 3-4 (com brotos de chá) em uma bacia plástica (lado superior: 51 cm de diâmetro; lado inferior: 40 cm de diâmetro; altura: 16 cm).
   2. Libere as larvas de 1.000-2.000 (segundo ao quinto ínstar) da colônia de E. grisescens laboratório sobre as folhas de chá brotos em cada bacia. Manter estas larvas em condições controladas de laboratório [um fotoperíodo de 14 h de luz seguido por 10 h de escuro (14:10 L:D), 24-28 ° C e umidade relativa de 60-90% (RH)]. Transferi com cuidado as larvas para folhas frescas à mão d cada 1-2. Cada dia remova fezes e detritos do fundo das bacias.
   3. Selecione as larvas de último ínstar maduras que cair das folhas de chá brotos e maravilhar-se ativamente na parte inferior da bacia. Obter pelo menos 240 larvas maduras para garantir que suficiente larvas estão disponíveis para os bioensaios.
      Nota: Apenas selecione ativamente errantes larvas para os experimentos. Não selecione larvas que ficam nas folhas, porque estas não estão prontas para empupar. Além disso, não selecione pré-pupa com actividades limitadas móveis porque eles não ativamente procurará as condições apropriadas depois de ser libertado em arenas de bioensaio.
2. Preparo do substrato
   1. Coletar e identificar os 4 tipos de substrato (por exemplo, areia, arenoso 1, areia loam 2 e silte argila) usando o método de hidrômetro²⁰. Esterilizar o solo e a areia em um forno de 80 ° C secador para > 3 d e em seguida seque completamente o solo e a areia a 50 ° C durante várias semanas até que o peso seco das amostras de substrato não muda mais ao longo do tempo.
   2. Solo o solo seco com macacos de madeira e morteiros. Peneire a areia e o solo aterrado através de uma peneira de 3 mm e armazená-los em sacos de plástico seláveis.
   3. Calcular o conteúdo de umidade diferentes de cada substrato (areia, areia barro 1, areia loam 2 ou silte argila) como segue²:
      
   4. Adicione a quantidade necessária de água destilada para os sacos de plástico seláveis contendo o solo seco ou areia para preparar 5%-20%-35%-, 50%, 65% e 80%-umidade substrato. Misture bem a água destilada e o solo ou areia.
3. Preparação de bioensaio arena
   1. Divida igualmente os contentores de polipropileno (lado superior: 20,0 cm de comprimento x 13,5 cm de largura, lado inferior: 17,0 cm de comprimento x 10,0 cm de largura, altura: 6,5 cm) em 6 câmaras com folhas impermeável cloreto de polivinila (PVC) (altura: 3,5 cm). Fixe as folhas de PVC e selar as rachaduras usando cola quente.
      Nota: Sele completamente toda a rachadura para impedir a penetração de água.
   2. Para cada teste, encha as 6 câmaras usando o mesmo tipo de substrato com conteúdo de umidade diferentes (5%-20%-35%-, 50%, 65% e 80%-umidade) (Figura 1a).
      Nota: Utilize apenas 1 tipo de substrato de conteúdo de umidade diferentes em cada ensaio. Atribua aleatoriamente a ordem das câmaras que contêm o substrato com as 6 humidades.
   3. Cole 4-6 pedaços de folhas de chá fresco usando pequenos pedaços de fita para cobrir a superfície interna das tampas dos recipientes de polipropileno (Figura 1b).

Figura 1: exemplos de arenas de bioensaio para os testes de escolha. (um) à prova d'água folhas de cloreto de polivinila (PVC) são usadas para dividir igualmente os contentores de polipropileno em 6 câmaras. Folhas de PVC são fixadas com cola quente, e todas as rachaduras são cuidadosamente seladas. Neste exemplo, arenoso 2 com conteúdo de umidade diferentes (5%, 20%, 35%, 50%, 65% e 80% de umidade) são usados para preencher as câmaras nas ordens de aleatoriamente atribuídas. (b) chá fresco folhas são coladas no lado interno das tampas onde o maduro Ectropis grisescens larvas serão lançadas. (c), PVC folhas são utilizadas para dividir igualmente os contentores de polipropileno em 4 câmaras, que são preenchidas com 4 tipos de substratos (areia, areia barro 1, areia loam 2 e sedimentos de barro) com 50% de humidade. Esta figura foi modificada de Wang et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Configuração de bioensaio e gravação de dados
   1. Versão 30 maduras último ínstar larvas (obtidas na etapa 1.1.3) para as folhas de chá fresco coladas na tampa do recipiente de polipropileno. Vire cuidadosamente a tampa e cubra firmemente o recipiente de polipropileno.
   2. Repita cada teste x 8. Manter as arenas de bioensaio em um cenário de câmara ambiental em um fotoperíodo de 14:10 (L:D) e 26 ° C.
   3. No dia 5, conte o número de pupas na superfície do solo em cada câmara. Também, desmontar os bioensaios e contar o número de pupas dentro do substrato.
      Nota: Apenas conte as pupas ao vivo ou dentro do substrato. Verificar a viabilidade de pupas, observando movimentos abdominais depois de tocar as pupas usando fórceps.
5. Análises de dados
   1. Para cada ensaio, calcule a porcentagem de pupas encontradas em cada câmara de cada replicar. Transferi os dados de porcentagem para o log de-proporção usando o método fornecido pelo Kucera e Martins Rodrigues²¹.
   2. Compare a porcentagem de pupas (dados transformados) em cada câmara usando um unidirecional análise de variância (ANOVA). Definir os níveis de significância de α = 0,05 para cada teste.

2. substrato-escolha bioensaios para determinar a preferência de pupa de E. grisescens

1. Repita a etapa 1.1 para obter larvas de último ínstar maduras, e passo 1.2 para preparar o substrato com conteúdo de umidade diferentes. Desta vez, apenas 20%, 50% e 80%-umidade substrato são necessários.
2. Preparação das arenas de bioensaio
   1. Semelhante ao passo 1.3.1, dividir igualmente os contentores de polipropileno em 4 câmaras, usando folhas de PVC. Fixe as folhas de PVC e selar as rachaduras usando cola quente.
   2. Para cada teste, encha as câmaras com os 4 tipos de substratos (areia, areia barro 1, areia loam 2 e sedimentos de barro) que possuem o mesmo teor de umidade (20%, 50% ou 80% de umidade) com aleatoriamente atribuído ordens (Figura 1C). Repita a etapa 1.3.3 para preparar as tampas.
3. Repita a etapa 1.4 conjunto bioensaios e gravar os dados e passo 1.5 para analisar os dados.

3. não-escolha de bioensaios para determinar o comportamento de solo-construção de galerias e sucesso de surgimento de E. grisescens

1. Repita a etapa 1.1 para obter a larva de último ínstar madura, e passo 1.2 para preparar os 4 substratos (areia, areia barro 1, areia loam 2 e sedimentos de barro) 3 conteúdo de umidade (20%, 50% e 80% de umidade).
2. Configuração de bioensaio
   1. Adicione o substrato em um recipiente plástico (lado superior: 11,5 cm de diâmetro; lado inferior: 8,5 cm de diâmetro; altura: 6,5 cm) a uma profundidade de 3 cm. No total, certifique-se de que haverá 12 tratamentos (as combinações de 4 tipos de substrato e 3 conteúdo de umidade). Repita cada tratamento 7 x.
   2. Versão 15 larvas de último ínstar maduras sobre o substrato de cada arena de bioensaio. Sele os recipientes firmemente cobrindo as tampas. Manter os bioensaios em um cenário de câmara ambiental em um fotoperíodo de 14:10 (L:D) e 26 ° C.
      Nota: Não haverá nenhuma necessidade para colar folhas de chá fresco nas tampas como mencionado nos bioensaios escolha.
3. Gravação de dados e análises
   1. No dia 3, conte o número de pupas e qualquer larva morta na superfície do substrato de cada replicar. Calcule a percentagem de indivíduos E. grisescens que entocada no substrato da seguinte forma:
      
   2. Registrar o número de adultos emergentes cada dia até que não mais adultos surgiram para 15 m. calcular o sucesso do surgimento da seguinte forma:
      
   3. Compare o percentual de indivíduos entocados e o sucesso de emergência entre os tratamentos utilizando ANOVA One-Way. Definir os níveis de significância de α = 0,05.

Resultados

Bioensaios umidade-escolha mostraram que significativamente mais indivíduos E. grisescens puparam sobre ou dentro de 5% e 35%-umidade areia em comparação com a areia de 80%-umidade (Figura 2a). No entanto, significativamente mais indivíduos preferiram pupate ou dentro do solo (arenoso, 1 e 2 e silte-argila) que tinha um teor de umidade intermediária (figuras 2b - 2d).

Discussão

Preferências de pupa, respondendo às variáveis de solo diferentes têm sido estudadas em algumas pragas^6,9,22,23. Por exemplo, para estudar a preferência de larvas maduras de Bactrocera tryoni (Froggatt) (Diptera: Tephritidae) entre as condições de umidade do solo diferentes, Hulthen e Clarke²² cenografia um 3x3 latino-Praça contendo 9 recipientes cheios ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triangular flask	Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD	99	250 mL
Plastic basin	Chahua, Fuzhou, China	100	upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm
Zip lock bags	Glad, Guangzhou, China	126/133
Polypropylene containers	Youyou Plastic Factory, Taian, China	139/155/160/161/190	upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm
Waterproof polyviny chloride sheet	Yidimei, Shanghai, China	141
Tape	V-tech, Guangzhou, China	VT-710
Oven drier	Kexi, Shanghai, China	KXH-202-3A
Environmental chamber	Life Apparatus, Ningbo, China	PSX-280H