Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

Resumo

Para melhorar os testes diagnósticos sorológicos para antígenos de tuberculose mycobacterium, desenvolvemos nanoprobes de óxido de ferro superparamagnético para detectar tuberculose extrapulmonar.

Resumo

Uma sonda de imagem molecular composta por nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) e anticorpo de superfície mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) foi sintetizada para aumentar a sensibilidade à imagem para tuberculose extrapulmonar (ETB). Uma nanosonda SPIO foi sintetizada e conjugada com MtbsAb. A nanoprobe SPIO-MtbsAb purificada foi caracterizada usando TEM e NMR. Para determinar a capacidade de direcionamento da sonda, as nanoprobes SPIO-MtbsAb foram incubadas com Mtb para ensaios de imagem in vitro e injetadas em camundongos inoculados em Mtb para investigação in vivo com ressonância magnética (MR). A redução do aumento do contraste na ressonância magnética (Ressonância Magnética) das células Mtb e THP1 mostrou-se proporcional à concentração de nanoprobe SPIO-MtbsAb. Após 30 min de injeção de nanosonda SPIO-MtbsAb intravenosa em camundongos infectados por Mtb, a intensidade do sinal do sítio granulomatoso foi reforçada por 14 vezes nas imagens de MR ponderadas t2 em comparação com a dos camundongos que recebem injeção de PBS. As nanoprobes MtbsAb podem ser usadas como uma nova modalidade para detecção de ETB.

Introdução

Globalmente, a tuberculose extrapulmonar (ETB) representa uma proporção significativa de casos de tuberculose (TB). No entanto, o diagnóstico de ETB é muitas vezes perdido ou atrasado devido à sua apresentação clínica insidiosa e ao baixo desempenho nos testes diagnósticos; resultados falsos incluem manchas de esputados negativos para bacilos rápidos ácidos, falta de tecido granulomatoso na histopatologia ou falha na cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Em relação aos casos típicos, o ETB ocorre com menos frequência e envolve pouca libertação do bacilo Mtb. Além disso, geralmente é localizado em locais de difícil acesso, como linfonodos, pleura e áreas osteoarticulares¹. Assim, os procedimentos invasivos para a obtenção de amostras clínicas adequadas, o que torna a confirmação bacteriológica arriscada e difícil, são essenciais^2,3,4.

Testes de detecção de anticorpos disponíveis comercialmente para ETB não são confiáveis para detecção clínica devido à sua ampla gama de sensibilidade (0,00-1,00) e especificidade (0,59-1,00) para todos os locais extrapulmonares combinados⁵. Ensaios imunospotas ligados à enzima (ELISPOT) para interferon-γ, proteína filtrante de cultura (PCP) e alvo antigênico secreto (ESAT) precoce têm sido usados para diagnosticar tb latente e ativa. No entanto, os resultados variam entre diferentes locais da doença para o diagnóstico de ETB^6,7,8. Além disso, o PPD da pele (derivado de proteína purificada) e a QuantiFERON-TB frequentemente forneceram resultados negativos falsos⁹. QuantiFERON-TB-2G é um ensaio de reatividade imunoambiental sanguínea inteiro, que não requer umespécime do órgão afetado e esta pode ser uma ferramenta de diagnóstico alternativa^6,10,11. Outros métodos diagnósticos tipicamente utilizados para meningite de TB, como a reação da cadeia de polimerase, ainda são muito insensíveis para excluir com confiança o diagnóstico clínico^12,13. Estes testes convencionais demonstram informações diagnósticas insuficientes para descobrir o local da infecção extrapulmonar. Assim, novas modalidades diagnósticas são clinicamente exigidas.

A imagem molecular visa projetar novas ferramentas que possam rastrear diretamente alvos moleculares específicos de processos de doenças em^14,15. Óxido de ferro superparamagnético (SPIO), um agente de contraste nmr ponderado t2, pode aumentar significativamente a especificidade e sensibilidade da imagem de ressonância magnética (MR) (MrI)^16,17. Esta nova modalidade de imagem funcional pode esboçar precisamente as alterações teciduais no nível molecular através de interações ligand receptores. Neste estudo, uma nova sonda de imagem molecular, composta por nanopartículas SPIO, foi sintetizada para conjugar com anticorpo superficial Mtb (MtbsAb) para diagnóstico de ETB. As nanosondas spio são minimamente invasivas a tecidos e corpos exame^18,19. Além disso, essas nanoprobes podem demonstrar imagens precisas de Mr em baixas concentrações devido às suas propriedades paramagnéticas. Além disso, as nanosondas SPIO parecem provocar reações menos alérgicas porque a presença de íons de ferro faz parte da fisiologia normal. Aqui, foram avaliadas a sensibilidade e especificidade das nanoprobes SPIO-MtbsAb voltadas para o ETB em modelos celulares e animais. Os desfechos demonstraram que as nanoprobes eram aplicáveis como agentes de imagem ultrasensíveis para o diagnóstico de ETB.

Protocolo

Todo o protocolo em relação ao experimento animal segue os procedimentos operacionais padrão para a criação de animais laboratoriais de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais (8ª Edição, 2011) e é aprovado pelo Instituto Nacional de Diretrizes de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais (8ª Edição, 2011) e aprovado pelo comitê institucional de cuidados e animais.

1. Síntese de nanopartículas spio

1. Prepare nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestida de dextran, mexendo vigorosamente uma mistura de soluções Dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) e FeCl₃×6H₂O (0,45 g; 2,77 mmol) e FeCl₂×4H₂O (0,32 g; 2,52 mmol) em temperatura ambiente.
2. Adicione NH₄OH (10 mL; 7,5% v/v) rapidamente.
3. Ainda agita a suspensão preta por 1h; posteriormente, centrífuga a 17.300 x g por 10 min e, em seguida, remover os agregados.
4. Separe os produtos SPIO finais do T-40 dextran unbound dextran by gel filtration chromatography²⁰.
5. Carregue a mistura de reação (volume total = 5 mL) em uma coluna de 2,5 cm × 33 cm e lute com uma solução tampão contendo 0,1 M Na acetato e 0,15 M NaCl no pH 7.0.
6. Colete as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestida suspida purificada no volume vazio e rediga que a coluna se esluata para ferro e dextran a 330 e 490 nm usando ácido clorídrico e os métodos de ácido fenol/sulfúrico²⁰, respectivamente.

2. Síntese SPIO-MtbsAb

1. EdBE conjugado pelo Synthesize spio usando métodos relatados anteriormente^21,22.
2. Anidrida sinthesize SPIO-EDBE-succinic (SA).
   1. Mexa uma solução alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) de SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 μmol) em temperatura ambiente por 24 h.
   2. Difundir a solução com 20 alterações de 2 L de água destilada usando tubos de membrana porosa molecular (corte de 12.000-14.000 MW). 6 h para cada mudança.
3. Por fim, adicione 100 μL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL da Fe) a 400 μL de 4,5 mg/mL MtbsAb para sintetizar SPIO-MtbsAb usando 1-hidroxibenzotriazol e (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfato como catalisadores e agitam a solução em temperatura ambiente por 24 h.
4. Por fim, separe as soluções do anticorpo sem limites através da cromatografia de filtragem de gel.
5. Carregue a mistura de reação (5 mL) na coluna de 2,5 cm × 33 cm e lute usando um tampão PBS. Confirme o complexo de ab-nanopartículas (ou seja, nanoprobe) usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchoníco²³.

3. Observação de morfologia de partículas e medição de nível de relaxamento

1. Examine o tamanho médio da partícula, a morfologia e a distribuição de tamanho usando microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de 100 kV.
   1. Lançar a dispersão composta em uma grade de cobre de 200 malhas e secar o ar à temperatura ambiente antes de carregá-la no microscópio.
2. Meça os valores de tempo de relaxamento (T₁ e T₂) das nanoprobes utilizando o relaxômetro nmr a 20 MHz e 37,0 °C ± 0,1 °C.
   1. Calibrar o relaxômetro antes de cada medição.
   2. Registre os valores r₁ e r₂ dos oito pontos de dados gerados através da inversão-recuperação e da sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar as relaxividades r₁ e r₂ ².

4. Imagem celular

1. Cultivar monocitos humanos THP-1 em RPMI 1640 com soro bovino 10% fetal, 50 μg/mL gentamicina sulfato, 100 unidades/mL penicilina G sódio, 100 μg de sulfato de estreptomicina e 0,25 μg/mL fungizone em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C.
2. Incubato SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) com 10⁶ unidades de formação de colônias (CFU) de Mycobacterium bovis BCG preincubados com 1 × 10⁷ monocitos ativados em tubos de microcentrífuga (1 mL) em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C por 1 h.
3. Tubos de centrífuga a 200 x g e descartar o supernatante. Redissolva pelotas no meio (200 μL).
4. Escaneie as amostras usando uma sequência rápida de pulso de eco gradiente (Tempo de repetição (TR) = 500; Tempo de eco (TE) = 20; Ângulo de flip = 10°) através da ressonância magnética 3.0-T para determinar a especificidade e sensibilidade da nanoprobe^21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) inoculação

1. Reconstituir a vacina liofilizada ou o estoque bacteriano no meio de Sauton e, em seguida, diluir o estoque com soro fisiológico até se dispersar adequadamente como descrito anteriormente²⁴.
2. Inocular uma cepa atenuada ao vivo de M. bovis BCG, obtida da ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (cepa Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a um volume de 0,1 mL/mouse (ou seja, 10⁷ CFU) intradermally na pele dorsal esquerda ou direita de camundongos, como descrito anteriormente²³. Injete salina em camundongos como controle negativo. Monitore os animais diariamente após a inoculação do BCG.
3. Sacrificar animais 1 mês após a inoculação de bactérias usando eutanásia de dióxido de carbono. Retire o tecido do local de inoculação intradermal. Fixar o tecido em 10% de formalina e incorporar em parafina para seções seriais a 5-10 μm. Seções de tecido manchacom as manchas hematoxilina/eosina e manchas ziehl-neelsen para bactérias rápidas ácidas²⁴ e com azul de Berlim para ferro-féico²⁵.

6. In vivo MRI

1. Injetar cetamina (80 mg/kg de peso corporal) e xilazina (12 mg/kg de peso corporal) subcutâneamente em camundongos para anestesia animal.
2. Injete sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) em veias traseiras de camundongos. Ratos de imagem MR antes e imediatamente após a injeção de sonda e, em seguida, a cada 5 min por 30 min para adquirir imagens de spin-echo rápido ponderadas t2 (TR = 3000; TE = 90; campo de visão = 8).
3. Analisar quantitativamente todas as imagens de Mr utilizando intensidade de sinal (SI), uma medição de regiões definidas de interesse em locais comparáveis de um centro de granuloma Mtb e o músculo traseiro adjacente a uma área granulomatosa.
4. Calcule os aprimoramentos relativos do sinal usando a medição si antes (SIpre; controle) e 0-3 h após a injeção (SIpost) dos agentes de contraste usando a fórmula
   
   [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
   
   onde o SIpre é o SI da lesão na varredura pré-aprimorada e o SIpost é o SI da lesão na varredura pós-aprimorada^21,22.

Resultados

Síntese e caracterização de nanoprobe SPIO-MtbsAb
As nanopartículas spio foram projetadas para conjugar com MtbsAb. O dextran estabilizado na superfície das nanopartículas SPIO foi cruzado por epichlorohydrin. As nanopartículas spio foram posteriormente incorporadas ao EDBE para ativar grupos funcionais primários de amina nas extremidades dextran. SA foi então conjugado para formar SPIO-EDBE-SA. Nanoprobes SPIO-MtbsAb formaram-se na etapa final através da conjugação de MtbsAb com SPIO-EDBE...

Discussão

Semelhante aos estudos relevantes, nossos achados sobre nanoprobes SPIO-MtbsAb demonstraram uma especificidade significativa para Mtb^27,28. O subcutâneo Mtb granuloma foi encontrado 1 mês após injeção de TB nos modelos do mouse. Os achados típicos de histologia granulomatosa da TB incluíram infiltração linfócito, presença de macrófagos epitelióides e neovascularização. Bacilos rápidos de ácido foram espalhados nas lesões de TB, corroborando os a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate	Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole	Sigma-Aldrich
dextran(T-40)	GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate	Fluka
ferrous chloride tetrahydrate	Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NH4OH	Fluka
NMR relaxometer	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off	Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
transmission electron microscope	JEOL	JEM-2000 EX II