Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Resumo

A atividade elétrica das células em tecidos pode ser monitorizada por técnicas eletrofisiológicas, mas estas geralmente limitam-se a análise de células individuais. Desde que um aumento de cálcio intracelular (Ca^{2 +}) no citosol ocorre muitas vezes devido à atividade elétrica, ou em resposta a uma miríade de outros estímulos, esse processo pode ser monitorado pela imagem de células carregado com sensíveis ao cálcio fluorescente corantes.  No entanto, é difícil esta resposta em um tipo de célula individual dentro de todo tecido da imagem porque estas tinturas são aceites por todos os tipos de células dentro do tecido. Em contraste, os indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) podem ser expressa por um tipo de célula individual e fluorescem em resposta a um aumento de intracelular Ca^{2 +}, permitindo assim a imagem de Ca^{2 +} sinalização em populações inteiras de tipos de células individuais. Aqui, nós aplicamos o uso do GECIs GCaMP3/6 até a junção neuromuscular do mouse, uma sinapse tripartida entre os neurônios motores, músculo esquelético e terminal/perisynaptic células de Schwann. Vamos demonstrar a utilidade desta técnica em preparações do tecido clássico ex vivo . Usando um divisor ótico, realizamos imagem dual-comprimento de onda de Ca^{2 +} sinais dinâmicos e um rótulo estático da junção neuromuscular (JNM) em uma abordagem que poderia ser facilmente adaptada para monitorar duas células específicas Lino ou tensão geneticamente codificado indicadores (GEVI) simultaneamente. Finalmente, discutimos as rotinas usadas para capturar espacial de mapas de intensidade de fluorescência. Juntas, estas técnicas ópticas, transgênicas e analíticas podem ser empregadas para estudar a atividade biológica das subpopulações de células distintas para o MNJ em uma ampla variedade de contextos.

Introdução

O MNJ, como todas as sinapses, é composto por três elementos: um terminal pré-sináptica derivado de um neurônio, uma célula neurônio pós-sináptico/efetoras, e um perisynaptic glia celular^1,2. Enquanto os aspectos básicos de transmissão sináptica primeiro foram demonstrados neste de sinapse³, muitos aspectos deste processo permanecem desconhecidos, em parte devido a expressão das mesmas moléculas por elementos celulares distintas desta sinapse. Por exemplo, os receptores de ambos os nucleotídeos de adenina Purina ATP e acetilcolina (ACh), que são co liberados por neurônios motores no MNJ vertebrado, são expressos por músculo, células de Schwann e neurônios motores, complicando, assim, a interpretação de qualquer efeito funcional exercido por estas substâncias (por exemplo, liberação de transmissor ou resposta, geração de força muscular)⁴. Além disso, embora os componentes tripartites o MNJ são simples em comparação com, por exemplo, os neurônios no sistema nervoso central que muitas vezes apresentam múltiplas entradas sinápticas, se os neurônios motores, células musculares ou células de Schwann variam em resposta a estímulos com base na sua intrínseca heterogeneidade (por exemplo, derivação embrionária, subtipo de fibra, morfologia) não é clara. A fim de abordar cada uma destas questões, seria vantajoso para controlar simultaneamente a resposta de muitas células dentro de um elemento sináptico, bem como faixa, ao mesmo tempo, essa resposta em qualquer um dos outros elementos separados. Estratégias convencionais usando corantes químicos para medir a sinalização de cálcio não podem atingir esses dois objetivos, porque banho-aplicado tintura é retomada por vários tipos de células após a aplicação de tecido e intracelular carregado da tintura só pode ser usada para Visualizar individuais ou pequenas divisões de células. Aqui, utilizar ratos transgênicos expressando GECIs projetado para medir a célula específica cálcio sinalização, juntamente com imagens específicas e ferramentas de software⁵, demonstramos o primeiro destes dois objectivos globais e discutir como a adição de novos ferramentas de transgénicas ajudaria a alcançar o segundo. Esta técnica será útil para qualquer pessoa interessada em acompanhar a dinâmica de cálcio ou outro celular sinalização observáveis de eventos através de sensores ópticos gene codificado em várias populações de células ao mesmo tempo.

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Protocolo

Pecuária e experimentos foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e o IACUC na Universidade de Nevada.

1. preparação dos diafragmas e nervos frênico de ratos transgênicos

1. Compre ratos transgénicos e primeiras demão do oligonucleotide genótipo estes ratos.
   Nota: Os primers são listados na página "Informações" para cada um destes ratos.
   1. Criar um mouse de 3 a 6 meses de idade, expressando uma cópia do apropriado transgénicos/TOC-no alelo Cre-motorista e zero cópias do alelo GCaMP3/6 condicional com um segundo mouse da mesma idade expressando uma ou duas cópias da condicional GCaMP3 / 6 alelo e zero cópias do alelo Cre-driver.
   2. Genótipo a filhotes e mark aqueles que possuem Cre e condicional GCaMP3/6 alelos — estas daqui em diante serão chamadas ratos transgénicos-duplo (por exemplo, Myf5-Cre, GCaMP3 condicional)⁶.
      Nota: Deste modo, todos os dados irão derivar de ratinhos expressando uma cópia do Cre e condicional GCaMP3/6 alelos. Isto é particularmente importante quando adicionando em outros ratos mutantes (por exemplo, nocautes) em cruzes.
2. Quando os ratos duplo-transgênicos são de idade apropriada (por exemplo, dia pós-natal 0 ou 5 [P0 ou P5] ou adulto), eutanásia os ratos por decapitá-los com uma tesoura (para ratos mais jovens que P10) ou colocando-os em uma câmara de inalação de isoflurano — quando eles estão Já não responsivo a beliscar o rabo com um par de pinças, estão prontos para o sacrifício.
3. Sacrifica o animal por decapitação com um par de tesouras.
4. Transversalmente a seção do outro lado o animal inteiro logo abaixo do fígado e imediatamente acima do coração e pulmões com uma tesoura de iridectomy.
5. Disse, embora o fígado, o coração e os pulmões, tendo o cuidado de manter um comprimento do nervo frênico que é suficientemente longo para ser desenhado em um eletrodo de sucção (ou seja, 1-2 cm).
   Nota: O nervo frênico esquerdo pode ser identificado como um pedaço de tecido que insere a porção medial do diafragma esquerdo branco. Não deve ser cortada quando retirar os pulmões. O nervo frênico direito é executado dentro de um pedaço da fáscia que também contém a veia cava superior e é mais fino e mais branco que a veia cava. Juntos, ambos penetram o diafragma direito medial.
6. Ainda mais, remova a caixa torácica e coluna vertebral, excepto o cume fina em torno do diafragma.
7. Coloque o diafragma e o exemplo do nervo frênico em um tubo de microcentrífuga com solução de Krebs-Ringer com 1 µ g/mL 594-αBTX por 10 min no escuro.
   Nota: Esta concentração de 594-αBTX rótulos receptores ACh (AChRs) sem bloquear sua função (observação pessoal).

2. estimulação e gravação dos potenciais de ação muscular

1. Usando os pinos minutien, imobilizar o diafragma fixando em um prato de 6 cm revestido com gel de silicone dielétrico e repleto de ~ 8 mL de solução de Krebs-Ringer oxigenada e coloque-a sobre a fase de microscópio. Perfundir o diafragma com mais solução de Krebs-Ringer (8 mL/min) por 30 min.
   Nota: Isto enxágua o desacoplado 594-αBTX, bem como se equilibra o tecido após a dissecação.
2. Fazer um eletrodo de sucção de acordo com os métodos estabelecidos⁷.
   1. Na ampliação de 4x, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo e aplique sucção puxando para fora do cano de uma seringa de 5 mL, conectado à tubulação que é anexada ao eléctrodo de sucção.
      Nota: Quando desenhada com êxito para o eletrodo de sucção, o nervo frênico é tenso. Ligue o estimulador e estimular o frênico nervo lançando o manual switch 1 x.
   2. Certifique-se de que o diafragma contratos em resposta à estimulação de 1 Hz, examinando visualmente com iluminação brightfield. Caso contrário, ajuste a tensão, girando o botão de tensão incrementalmente para alcançar um pulso de supramaximal, que pode ser verificado através de um exame visual da contração muscular. Se ainda não é visível, explodir o nervo com a seringa e tente desenhá-lo novo aplicando sucção.
3. Desligue a perfusão e adicionar a miosina de músculo específico inibidor BHC⁶ ou o canal de sódio voltagem-dependentes antagonista µ-conotoxina⁸ para uma concentração final de 100 µM.
   1. Para fazer 100 µM BHC, pipete 4 µ l de estoque de 200 mM em DMSO e predilute-lo em 1 mL de solução de Krebs-Ringer.
   2. Retire o prato, 1 mL de solução de Krebs-Ringer.
   3. Adicione o BHC pré-diluído, ao prato.
      Nota: Este pré diluição ajuda a evitar a indução de DMSO não diluído de uma resposta de fluorescente não transitório em células GCaMP3-expressando.
   4. Espere 30 min e em seguida, ligue a perfusão de solução de Krebs-Ringer fresca por mais 20-30 minutos.
4. Prepare o eléctrodo de gravação.
   1. Usando luvas, colocar um vidro de borosilicato filamentado com um diâmetro externo (OD) de 1 mm e um diâmetro interno (ID) de 0,4 mm em um extrator de micropipeta e aperte os mostradores para apertá-lo em posição. Feche a porta do extrator.
   2. Usando um extrator de P-97, programar a seguinte configuração: calor em 900, puxe a 120, velocidade em 75, tempo em 250, pressão no 500 e sem loops adicionais.
      Nota: Resistance (R) é medido usando controles de software do amplificador: o software de aquisição de dados confirma resistência resolvendo-se a fórmula V = ir O controlador de software passa uma conhecido corrente (I) (tipicamente 1 nA) através do eletrodo e mede a mudança de tensão (V), permitindo assim que resolver para R.
   3. Para diafragmas embrionários, certifique-se de que a resistência está perto de 60 MΩ e para o mais velho dos diafragmas, 10-20 MΩ. Carrega o eléctrodo de gravação com 3 M de KCl.
5. Na ampliação de 10x, baixe o eletrodo muscular, usando um segundo micromanipulador no lado oposto do palco como um eletrodo de estimulação.
6. Usando o software de aquisição de dados eletrofisiológicos, esperar até que o potencial de membrana de repouso muda de 0 para -65 mV ou abaixo.
7. Estimular a 1 Hz e verificar a presença de um potencial de ação muscular, verificando-se para um grande potencial que apresenta uma modesta taxa de superação (potencial que se eleva acima de 0 mV quando começa às -65 mV ou abaixo). Não confunda o artefato de estimulação com um potencial de ação.
   Nota: Potenciais são significativamente mais longos em duração (~ 5 ms) do que artefatos de estimulação.

3. imagem latente da fluorescência da amostra

1. Ampliação de 20 X, localize a banda placa terminal no centro do músculo por procurando NMJs 594-αBTX – rotulado sob excitação luz verde/amarelo (550 nm). Alterne para a excitação de luz azul (470 nm) a imagem Ca^{2 +} respostas no músculo, neurônio motor ou células de Schwann.
2. Se desejar, configure o divisor de imagem com filtros bandpass e um filtro de borda única dicroicos para a imagem de dual-comprimento de onda.
3. Para calcular a fluorescência máxima (Fmax) exibida por tecido GCaMP3/6-expressando, adicione 12 µ l de 3 M de cloreto de potássio (KCl) para as preparações de diafragma⁶.
   1. Realizar experiências com a barra de brilho na barra de tabela de pesquisa definida a 110% do nível no qual o tecido GCaMP3/6-expressando exibe saturação na ampliação de X 20, sem binning em resposta ao KCl.
4. Grave a 20 frames por segundo para não perder quaisquer eventos rápidos.
5. Estimular com 1-45 s de 20-40 Hz de estimulação do nervo, entregando um trem de impulsos usando o eletrodo de sucção ou adicionar agonistas farmacológicas, aplicação de banho ou por perfusão e coletar dinâmico fluorescente Ca^{2 +} respostas no subtipo de uma célula juntamente com o sinal de JNM estático 594-αBTX.
   Nota: Se o tecido-específica vermelhos ou far-red Lino ou GEVI ratos se tornam disponíveis para uso com o MNJ, pode ser usados para coletar dois sinais dinâmicos, refletindo dois elementos celulares distintos no MNJ.
6. Quando terminaram os experimentos de imagem ou eletrofisiológicos porque os resultados desejados foram alcançados, perfundir água através das linhas de perfusão e sugar a água 2 x - 3 x através do eletrodo sucção para garantir que sais não acumular.

4. exportação e análise dos dados por um desvio padrão mapa de intensidade de fluorescência (SD_iu16)

1. Gravar sequências de imagem gravadas como pilhas TIFF de 16 bits e carregá-los para o sistema de análise de dados de imagem desejado para análise.
2. No menu de arquivo do software 8D, selecione a pilha de imagem de interesse e clique para carregar.
   1. Uma vez que o vídeo carrega, digitalizar através do tempo para identificar uma seção que não tem celular fluorescente atividade.
      Nota: Esta região será usada para criar uma amostra de plano de fundo.
   2. Segure a tecla Shift e clique para desenhar uma caixa de interesse (ROI) da região na área identificada como a área de amostra de plano de fundo.
   3. Depois de criar a caixa, pressione a barra de espaço para gerar uma trama de mudança de atividade do plano de fundo.
   4. O rastreamento com o botão direito e selecione a opção sortidas para apresentar a opção de Despejo ROI como texto para fazer o rastreamento como um arquivo de texto de coordenadas xy.
3. Voltando para o vídeo de interesse, digitalizar novamente para identificar a região de tempo onde a atividade de interesse está ocorrendo.
   1. Usando o botão do meio do mouse, selecione nesta região de tempo na caixa tempo de amarelo.
   2. Botão direito do mouse sobre o vídeo e selecione OPS de pilha e, em seguida, mapear Stat opção 5.
      Nota: Isto irá gerar um mapa de desvio padrão (SD mapa) na janela da esquerda.
   3. Clique no mapa SD e em seguida pressione o ] chave 19 x para aplicar o mapa de calor de cor apropriada.
   4. O mapa de SD com o botão direito e selecione salvar e carregar de STM, que apresentará a opção salvar stm como tiff para salvar o mapa SD.
   5. Então, pressione o [ chave 19 x para retornar a um mapa de cores em tons de cinza.
   6. Pressione C e D para trazer as ferramentas de mapeamento de densidade. Usando o botão esquerdo do mouse e o botão do mouse do centro, ajuste o limite para incluir todas as atividades fluorescente mostrada no mapa de SD.
   7. Pressione C para fechar as ferramentas de densidade, mantendo as configurações de limite.
   8. O mapa de SD com o botão direito e selecione partículas STM e, em seguida, PTCLS de encontrar.
      Nota: Isto irá identificar células individuais, expressando a atividade fluorescente.
   9. Botão direito do mouse o mapa SD mais uma vez e selecione Criar partículas ROIs.
      Nota: Isto irá sobrepor as células selecionadas no vídeo original do interesse.
   10. Segurando Shift, clique com botão direito em qualquer uma da partícula ROIs agora identificada no vídeo original.
   11. Selecione o marcador ROI e medida Int no ROI.
       Nota: Isto irá gerar parcelas de atividade fluorescente individuais para cada ROI identificado no vídeo de interesse. Estes podem ser salvos clicando em qualquer uma dessas e selecionando Assorted, seguidos por Despejar ROI como texto.
4. Para detalhadas lógica subjacente a essas operações, por favor consulte o código de fonte arquivo⁹.

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Resultados

Vários exemplos de mudanças de intensidade de fluorescência, mediadas por aumentos de intracelular Ca^{2 +} dentro de tipos de células definidas do MNJ, mostram a utilidade desta abordagem. Estes resultados são apresentados como mapas de intensidade de fluorescência espacial, que fornecem a localização das células de resposta, bem como a intensidade de suas respostas, permitindo, assim, para a avaliação de quantas células respondem e quanto cada célula responde a uma ...

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Discussão

Aqui nós fornecemos alguns exemplos de Ca^{2 +} respostas em células específicas no tecido neuromuscular intacto, usando ratos Lino-expressando de medição. Para executar com êxito estes experimentos, é imperativo para não machucar o nervo frênico durante a dissecção. Para^{Ca 2 +} respostas nas células de Schwann em baixa ou alta potência (ou seja, 20 X ou 60 X) de imagem, é necessário usar BHC ou µ-conotoxina ao movimento do bloco. Para imagens de baixo consumo de energia de Ca

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data