Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).

Resumo

Recentes melhorias na sensibilidade do sequenciamento de próxima geração facilitaram a aplicação de transcriptomic e análises genômicas para pequeno número de células. Utilizar esta tecnologia para estudar o desenvolvimento do sistema visual de Drosophila, que ostenta uma riqueza de ferramentas genética de tipo específico de célula, fornece uma abordagem poderosa para abordar a base molecular do desenvolvimento com resolução de celular precisa. Para tal abordagem viável, é fundamental ter a capacidade de forma confiável e eficiente de purificar células presentes em baixa abundância dentro do cérebro. Aqui, apresentamos um método que permite a purificação eficiente de clones de célula única em experimentos de mosaico genético. Com este protocolo, consistentemente alcançamos um alto rendimento celular após purificação usando fluorescência ativado celular classificação (FACS) (~ 25% de todas as células rotuladas) e realizou com sucesso transcriptomics análises na única célula clones gerados através de análise de mosaico com um marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo é ideal para a aplicação transcriptomic e análises genômicas para tipos específicos de células no sistema visual, em diferentes estágios de desenvolvimento e no contexto de diferentes manipulações genéticas.

Introdução

O sistema visual da drosófila é um excelente modelo para o estudo a base genética do desenvolvimento e comportamento. É composto por uma arquitetura celular estereotipados¹ e um conjunto de ferramentas de genético avançado para manipular tipos de célula específica^2,3. Uma força principal deste sistema é a capacidade de interrogar autonomamente a função do gene em tipos de células de interesse com resolução única célula, usando métodos de mosaico genético^4,5. Análises genômicas em única célula clones em experimentos de mosaico genético e procurámos combinar estas ferramentas genéticas com recentes avanços no sequenciamento de geração seguinte para executar transcriptomic de tipo específico de célula.

Para fazer isso, é essencial desenvolver um método robusto e eficiente para seletivamente isolar populações de baixa abundantes células no cérebro. Anteriormente, desenvolvemos um protocolo para isolar tipos de células específicas do sistema visual durante o desenvolvimento pupal através de FACS e determinando suas transcriptomes usando o RNA-seq.⁶. Nesses experimentos, a grande maioria das células de um tipo específico (por exemplo, R7 fotorreceptores) fluorescente foram rotulada. Usando esse método, em experimentos de mosaico genético, no qual apenas um subconjunto de células do mesmo tipo são rotulados, não conseguimos isolar células suficientes para obter dados de sequenciamento de qualidade. Para resolver isso, procuramos aumentar o rendimento celular melhorando o protocolo de dissociação de célula.

Nossa abordagem foi para diminuir o comprimento total do protocolo para maximizar a saúde das células dissociadas, melhorar a saúde celular, alterando os buffers de dissecção e dissociação e reduzir a quantidade de ruptura mecânica no tecido dissecado. Nós testamos o melhor protocolo⁷ usando análise de mosaico com uma célula repressible marcador⁵ (MARCM), que permite a geração de único fluorescente etiquetado clones de tipos de célula específica, que são tipo selvagem ou mutante para um gene de interesse em uma caso contrário heterozigota mosca. Onde, em condições idênticas, o nosso protocolo anterior falhou gerar material suficiente para RNA-seq, o protocolo melhorado foi bem sucedido. Nós reproducibly atingir um alto rendimento celular (~ 25% de pilhas etiquetadas) e obter dados de RNA-seq de alta qualidade de tão pouco como 1.000 células⁷.

Um número de protocolos têm sido descrito anteriormente para isolar os tipos de célula específica em Drosophila^{6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16}. estes protocolos destinam-se principalmente para isolar as células que são abundantes dentro do cérebro. Nosso protocolo é otimizado para isolar populações de células abundantes baixa (menos de 100 células por cérebro) no sistema visual usando FACS para posterior transcriptomic e análises genômicas. Com este protocolo, nosso objetivo é fornecer uma maneira de isolar reproducibly baixas abundantes células do sistema visual de voar pela FACS e obtenção de dados de alta qualidade transcriptome por RNA-Seq

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Protocolo

1. planejamento antes do experimento

1. Antes de iniciar o experimento, execute um experimento piloto em pequena escala para confirmar se a genética funciona conforme o esperado para rotular especificamente as células desejadas.
   1. Como primeiro passo, uso imuno-histoquímica e microscopia de luz para determinar se as células indesejáveis são rotuladas. Idealmente, marcadores genéticos será específicos dentro da retina e o lobo óptico (Figura 3). Só óptica lóbulos são utilizados para dissociação de célula e então rotulagem no cérebro central não é um problema. Ao mesmo tempo, determine quantas células de interesse são rotuladas por cérebro.
   2. Se a etiqueta genética tem a especificidade desejada, realizar um experimento piloto de FACS (Figura 4) para determinar se uma população pura de células pode ser reproducibly isolada, e também avaliar quantas células de interesse pode ser isolados de cada cérebro. Se necessário, avalie a pureza de células isoladas através de PCR quantitativo para determinar o enriquecimento ou de enriquecimento de genes específicos.
2. Determine o número de cruzes é necessário para obter a quantidade desejada de material para o experimento.
   Nota: Com base na experiência experimental, ~ 17 – 25% de células fluorescente etiquetadas é consistentemente isolados com este protocolo, e dados de alta qualidade-a sequenciação do ARN são obtidos a partir de 1.000 células de FACS purificado (menos células podem ser suficientes).
   1. Para obter a 1.000 células para análises de RNA-seq, certifique-se de que há pelo menos 40 células de interesse fluorescente etiquetado por cérebro (20 células por lobo óptico). Em torno de ~ 10 células de interesse devem ser purificadas por cérebro, então disse 100 cérebros.
   2. Para obter ~ 100 moscas na fase do desenvolvimento para dissecar em cada experimento, use ~ 100 cruzes se selecionando contra balanceadores (isso irá variar dependendo os genótipos dos pais). Se moscas são homozigotos para os alelos/transgenes de interesse menos cruzes podem ser definidos.
   3. Limite a janela de dissecação para 1h para maximizar a saúde celular e minimizar alterações inespecíficas de expressão gênica e organização do genoma que pode ocorrer depois de cérebros são dissecados, mas isto pode ser ajustado. Determine o número de dissectors necessário para dissecar 100 cérebros em 1 h, que depende da habilidade dos dissectors.

2. trabalho de voar

Nota: Moscas são disparadas a 25 ° C, com umidade de ~ 50% a menos que indicado o contrário. Abaixo o genótipo das fêmeas é indicado como genótipo F e o de machos como genótipo M.

1. Estoques em expansão
   1. Obter ~ 100 frascos de moscas jovens (não mais de uma semana de idade com genótipo F) e ~ 30 frascos de genótipo M.
   2. Na quinta-feira da semana 1, flip 100 frascos de genótipo F para alimentos frescos. Começando na sexta-feira, vire os frascos cada dia através de 2 semana terça-feira. Estes 6 aletas serão usadas para coletar virgens. Também na quarta-feira da semana 2, flip moscas de genótipo M sobre alimentos frescos e limpar os pais na sexta-feira da semana 2. Estes frascos serão usados para coletar os machos para as cruzes.
2. Coleta de virgens
   1. De segunda-feira da semana 3, colete virgens de frascos de genótipo F. Coletar 2 - 3 vezes por dia e armazenar as virgens a 18 ° C, com umidade de ~ 50%. Repita isto cada dia através de terça-feira da semana 4. É altamente recomendável para coletar tantas virgens quanto possível, uma vez que muitos deles morrem antes que as cruzes são definidas. Normalmente, ~ 2.500 virgens devem ser recolhidas para definir 100 cruzes.
3. Configuração de cruzes
   1. Na sexta-feira da semana 4, defina os números desejados de cruzes (tipicamente de 100 – 200 cruzes por experiência) com 15 virgens de genótipo F e 7 machos de genótipo M para cada cruz. É muito importante o uso de machos jovens e saudáveis com asas intactas.
   2. As cruzes da aleta todos os dias de domingo a sábado da semana 5. Complementar as cruzes com virgens frescas ou os machos se encontram-se moscas mortas. É essencial para evitar que os alimentos sequem, então os frascos da água conforme necessário. Alimentos secos diminuirá significativamente o rendimento.
4. Controlo negativo para classificação de FACS
   1. Incluir um controle negativo sem as células desejadas ser rotuladas para a classificação de FACS. Idealmente, o controle negativo deve ter o repórter (por exemplo, UAS-GFP) mas não o driver (por exemplo, GAL4), para que a expressão basal do repórter (UAS-construções podem ser "furados") pode ser determinado conjunto apropriado de canal para a classificação de FACS. Inverter as moscas para o controle negativo ao mesmo tempo com as moscas experimentais e fase-los da mesma forma.
5. Pupas de encenação
   1. Para coletar as células em um estágio específico do desenvolvimento pupal (por exemplo, 40 h após a formação do casulo [h APF]), palco as pupas em uma janela de tempo de 1 h para coincidir com o período de 1h alocado para as dissecções (discutidas acima). FACS deve ser realizada imediatamente após a dissociação do celular, que ocorre após as dissecções e leva ~ 40 min. Assim, a hora exata da encenação e dissecações é determinada pela disponibilidade de FACS.
   2. Para obter pupas a 40 h APF, estágio na segunda-feira da semana 6, em um ponto específico de tempo (por exemplo, 17:00) para dissecar pupas 40 h mais tarde (por exemplo, 09:00 de quarta-feira). Use um pincel molhado suavemente escolher brancos pré-pupas e colocá-los na parede em frascos previamente aquecidos. Só escolha as pupas com genótipo desejado.
6. Réplicas biológicas
   1. Fazer pelo menos 3 réplicas biológicas para cada experimento. Como uma maneira simples, repeti a experiência três vezes na mesma semana (semana 6) usando as mesmas cruzes. Por exemplo, fase de pupas para a segunda e o terceira é replicada na terça e quarta-feira, respectivamente. Disse esses pupas na quinta e sexta-feira, respectivamente.

3. preparação da amostra

Nota: Todos os reagentes utilizados neste protocolo são listados na Tabela de materiais.

1. Preparar soluções para dissecções e dissociação de tecido
   1. Preparar a solução de reserva de mistura de enzimas proteolíticas (ver Tabela de materiais) por reconstituir a enzima liofilizada com DDQ₂O a uma concentração de 26 unidades Wünsch (Wu) / mL. Para um frasco contendo 260 Wu (frasco grande), adicionar 10 mL de DDQ₂O para o frasco e fazer uso único alíquotas (4,2 µ l são necessários por dissociação). Solução estoque de loja a-20 ° C. Cada experimento exige dissociação das duas amostras (controlo negativo e tecido experimental).
   2. Prepare-se 10 x solução (RS do Rinaldini) e mídia (CSM da Schneider completa) no dia anterior a dissecação (segunda-feira da semana 6). Prepare-se 5 mL do CSM para cada Dissecador e cerca de 5 mL de 1x do RS e 5 mL do CSM para dissociação de 2 amostras (controlo negativo e experimental). Armazene o RS 10 x a 4 ° C por até um mês e o CSM a 4 ° C por até uma semana.
      1. Para preparar 100 mL de 10 x RS, dissolva 8 g de NaCl, 200 mg de KCl, 50 mg de NaH₂PO₄, 1G de NaHCO₃ e 1 g de glicose em 100 mL de DDQ₂O em um copo de 250 mL. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,22 mm.
      2. Adicione 20 mg de L-glutationa para 1 mL de DDQ₂O em um microtubo.
      3. Para preparar 50 mL de CSM, adicionar 5 mL de calor inativada soro bovino, 0,1 mL de solução de insulina de 10 mg/mL, 5 mL de solução de L-glutamina de 200 mM, 12,5 μL de 20 mg/mL L-glutationa e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina (5.000 unidades de penicilina e 5 mg de estreptomicina / mL) para 38,9 mL de mídia do Schneider. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,22 mm.
      4. Dilua 10 x RS com O ddH₂para fazer 1 x solução de trabalho de RS. Prepare-se para cada amostra 500 μL de 1 x RS em microtubos não adesivas.
   3. Ligue um banho de água e definir a temperatura a 37 ° C. Certifique-se que a temperatura é precisa, usando um termômetro. O banho de água deve estar na temperatura correta antes da ativação de papaína. Recomenda-se definir a temperatura a noite antes de uma dissecação de manhã.
2. Preparar a papaína e a enzima proteolítica misturar
   Nota: Fazer a solução de papaína fresco antes de cada dissociação.
   1. Na terça-feira da semana 6 em torno de 45 min antes de iniciar as dissecções, recuperar 1 frasco de pó de papaína de 4 ° C e incubar a temperatura ambiente. Também Reserve CSM em um tubo de Eppendorf à temperatura ambiente para depois adicionar o pó de papaína.
   2. min antes do início das dissecções usar uma seringa para adicionar a temperatura CSM para o frasco de papaína (diretamente através da tampa) para que a concentração é de 100 unidades/mL (a quantidade de pó em cada frasco é um pouco diferente; para um frasco contendo 123 unidades adicionar 1,23 m L do CSM). Para misturar, primeiro, inverta o frasco para capturar qualquer pó preso no interior da tampa e em seguida Pipetar para cima e para baixo.
   3. Adicione o frasco para um béquer contendo água de 37 ° C em banho-maria. Certifique-se que o frasco de solução de papaína não é flutuante. Ativar a papaína durante 30 min a 37 ° C.
   4. Depois de adicionar a papaína para um béquer no banho de água, recuperar uma parte alíquota de mistura de enzimas proteolíticas (26 Wu/mL) de-20 ° C e -incubar à temperatura ambiente. Após 30 min de ativação, incube a papaína à temperatura ambiente.
3. Dissecções
   1. Na terça-feira da semana 6, dissecar o cérebro pupal encenado no frio CSM com pinça limpa e cortar os lóbulos óptica por beliscar na junção do lobo óptico e o cérebro central.
   2. Adicione os lóbulos no fundo de um microtubo contendo 500 μL de 1 x RS (um microtubo para o tecido experimental) e outro para o tecido de controle negativo. Sempre manter os tubos em gelo.
   3. Disse lóbulos tantos quanto possível em 1h. Para o tecido de controlo negativo, 10 lobos são suficientes. Piscina dissecado lóbulos de óptica em um microtubo único para eliminar a perda de tecido durante a transferência entre microtubos.
4. Dissociação de célula
   1. Remova cuidadosamente a RS 1 x do microtubo com lóbulos de óptica dissecados usando uma pipeta P200, deixando o suficiente para cobrir os lóbulos. Cuidadosamente, adicione 500 μL de RS 1 x ao lado do tubo, de modo a perturbar os menos possível de cérebros. Mantenha sempre o tubo no gelo.
   2. Deixa os lóbulos se ao fundo. Só uma vez, tome a 200 μL e pipetar para fora a mistura (lóbulos devem movimentar). Deixe-os lóbulos resolver novamente.
   3. Para duas amostras (controle experimental e negativo), alíquota 600 μL de papaína de temperatura registrados para um microtubo. Adicione 4.2 μL de mistura de enzimas proteolíticas de temperatura ambiente em solução de papaína 600 μL para obter uma concentração final de 0.18 Wu/mL. Misture pipetando para cima e para baixo. Esta é a solução de dissociação.
   4. Cuidadosamente remova o RS 1 x cada amostra e adicionar 300 μL de solução de dissociação dos lóbulos. Incube as amostras a 25 ° C, 1.000 rpm por 15 min em um microtubo de thermomixer.
   5. Nos 5 e 10 min tempo pontos, pare a thermomixer e deixar os lóbulos afundam até o fundo do microtubo. Ocupam 200 μL de solução e pipeta para fora para misturar.
   6. Depois de 15 min, deixe os lóbulos se estabelecer ao fundo e Retire cuidadosamente a solução de dissociação de lóbulos (tentar não perturbar os lóbulos).
   7. Lave duas vezes com 1 x RS. Para fazer isso, adicione cuidadosamente 500 μL 1 x RS (tentar não perturbar os lóbulos). A mistura, pipeta suavemente até 200 μL e pipetar então fora para o microtubo. Deixe os lobos afundar até o fundo e repita.
   8. Lave cada amostra duas vezes com 500 μL de CSM (igual ao passo anterior).
   9. Cuidadosamente remova o CSM e adicionar outro 200 μL do CSM para o tubo. Usando uma pipeta P200, perturbar o tecido pipetando acima e para baixo sem formação de espuma, até que a solução é homogênea (i.e., não posso mais ver todos os restos de tecido).
   10. Filtrar a suspensão através de um tampão de malha 30 μm em um tubo de 5 mL FACS no gelo (use um P200 e certifique-se que atravessa a suspensão inteira). Adicionar outro 500 μL do CSM para enxaguar o microtubo de dissociação e filtrar a solução no tubo de FACS.
   11. Cuidadosamente Tire a tampa do tubo FACS, recolher a solução sob o filtro de rede com um P200 e adicioná-lo para o resto da suspensão no tubo do FACS. As amostras estão prontas para FACS.
   12. Assegure-se de microtubos para coletar células FACS purificado pronto com antecedência. Para o RNA-seq, classificar as células de cada amostra diretamente em microtubos contendo 300 μL de tampão RLT (lise) do kit de purificação de RNA (adicionar 1: 100 2–Mercaptoethanol antes do uso).
5. Classificação de FACS
   Nota: Após a dissociação, imediatamente classificar as células por FACS (máximo de 1 h). Certifique-se de sessões de FACS livro conformemente ao planejar o experimento. Um classificador de pilha com tamanho de bico 100 μm é normalmente usado.
   1. Compare a distribuição de célula no controle negativo e a amostra experimental para configurar o canal para a classificação. Idealmente, estabelecer o gating no experimento piloto FACS, e a amostra de controlo negativo irá fornecer a confirmação ou a sintonia fina do gating pré-estabelecidas. As células de interesse devem ser bem separadas as células de fundo que estão presentes em ambos o controle negativo e a amostra experimental (Figura 4) (testar isso nos experimentos piloto).
   2. Colete as células classificadas nos tubos preparados coleção.
6. Purificação de RNA
   1. Após separação das células diretamente em 300 μL de tampão, RLT, pipeta para cima e para baixo lisar as células.
   2. Purificar o RNA após o protocolo padrão de purificação de RNA Total do Animal e humano as células usando a purificação kit (veja a Tabela de materiais)-com de digestão de DNA na coluna⁷. Eluir o RNA em 20 μL de água livre de RNase.
   3. Congelar as amostras de RNA com nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
   4. Para cada experimento execute pelo menos 3 repetições para condições experimentais e de controle. Preparar as bibliotecas de cDNA para todas as amostras ao mesmo tempo e executar todas as amostras na mesma célula de fluxo para controlar a variabilidade técnica. Uma vez que todas as amostras de RNA são preparadas, use uma vac de velocidade para reduzir o volume de 2 – 5 μL (cada amostra).

4. preparação de bibliotecas de cDNA e sequenciamento por Smart-seq2

Nota: Para minimizar a variabilidade técnica, fazer todas as bibliotecas de cDNA ao mesmo tempo e sequenciá-los na mesma célula de fluxo.

1. Use uma entrada de 1,5 µ l de RNA concentrado para tornar as bibliotecas de cDNA, seguindo o protocolo padrão para Smart-seq2¹⁷ , exceto para as seguintes modificações: utilização de um mestre de PCR de alta-fidelidade diferente mistura (veja Tabela de materiais) para PCR amplificação; Use uma purificação de PCR na coluna kit (veja a Tabela de materiais) em vez de grânulos magnéticos para purificar os produtos de PCR.
2. O protocolo de Smart-seq2 inclui uma etapa de pré-amplificação do PCR após a transcrição reversa, bem como um passo PCR de enriquecimento final após tagmentation. O número de ciclos de amplificação da PCR depende da abundância de material a entrada. Com 1.000 células como entrada, usado tipicamente 15 ciclos na etapa pré-amplificação do PCR e 12 ciclos para a etapa PCR de enriquecimento final.
3. As bibliotecas da piscina e Sequencie-los em uma célula de fluxo único (por exemplo, a plataforma de NextSeq).

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Resultados

Regime geral
Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo é dividido em três partes principais: voar de trabalho, preparação da amostra, sequenciamento e análise de dados. A sessão "Planejamento antes do experimento" do protocolo não está incluída no regime geral para a simplicidade.

Linha do tempo
Um calendário das principais p...

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Discussão

Este protocolo é simples e não é tecnicamente difícil de executar, mas há chave de várias etapas que se negligenciado irá causar uma redução considerável no rendimento celular. (Etapa 2.3.2.) É crucial que as cruzes são saudáveis, e que a comida não secar. Molhar regular de cruzes é essencial para maximizar o número de moscas disponíveis para dissecação que estão com o mesmo genótipo e a correta fase de desenvolvimento. Quantas vezes cruzes precisa ser regada irá variar dependendo o alimentos utiliz...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liberase TM	Roche	5401127001	Proteolytic enzyme blend
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Glucose	Sigma-Aldrich	G0350500
L-Glutathione	Sigma-Aldrich	G6013
Heat Inactivated Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F4135
Insulin Solution	Sigma-Aldrich	I0516
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin Solution	Sigma-Aldrich	P4458
Schneider's Culture Medium	Gibco	21720024
Papain	Worthington	LK003178
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA purification kit
RNase-free DNase	Qiagen	79254
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
dNTP Mix	Life Technologies	R0191
MgCl2 Solution	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
Betaine Solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
RNaseOUT	Life Technologies	10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit	Illumina	FC-131-1024
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems	Corning	CLS431153
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020
FACSAria Flow Cytometer	BD Biosciences	656700
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY–401–2501