Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Resumo

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Resumo

Os componentes genéticos e moleculares da cascata determinação do sexo têm sido muito estudados na abelha, Apis mellifera, um organismo modelo himenóptera. No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos de determinação do sexo encontrados em outros táxons himenóptera não do modelo, tais como formigas. Devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram em espécies himenóptera, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório. Aqui, descrevemos os métodos para a realização de cruzamentos de endogamia e para avaliar o sucesso dessas cruzes em formiga Vollenhovia emeryi. Induzindo a consanguinidade no laboratório usando V. emeryi, é relativamente simples devido a única biologia das espécies. Especificamente, esta espécie produz machos de alopecia, e femininos reproductives exibem polimorfismo de asa, que simplifica a identificação dos fenótipos em cruzamentos genéticos. Além disso, avaliar o sucesso da endogamia é simples, como os machos podem ser produzidos continuamente por consanguinidade cruzes, enquanto os machos normais aparecem apenas durante uma temporada reprodutiva bem definida no campo. Nosso protocolo permitem usando V. emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em espécies de formigas.

Introdução

Eusocial himenóptera táxons, como formigas e abelhas, desenvolveram um sistema de determinação do sexo do haplodiploid em que os indivíduos que são heterozigotos na determinação do sexo complementar um ou mais loci (CSD) tornar-se fêmeas, enquanto aqueles que são homo - ou heterozigotos tornar-se machos (Figura 1A)¹.

Componentes genéticos e moleculares envolvidos na cascata da determinação de sexo têm sido bem estudados na abelha, Apis mellifera, um modelo himenóptera organismo^2,3,4. Investigações recentes de genómica comparativa sugerem que as formigas e as abelhas compartilham muitos homologs putativos na via da determinação de sexo, tais como o gene de determinação de sexo inicial, csd⁵. No entanto, evidências de conservação funcional destes homologs ainda carece de formigas.

Para resolver este problema, linhas de endogamia precisam ser desenvolvida à medida que eles são essenciais para mapeamento genético e estudos moleculares. No entanto, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram.

Aqui, usamos Vollenhovia emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em formigas^6,7. As linhas de consanguinidade desta espécie foram desenvolvidas anteriormente para mapeamento de enlace dos loci de traço quantitativos (QTL) para os traços relacionados à determinação do sexo pela primeira vez em formigas⁶. Além disso, a cascata da sexo-determinação molecular tem sido investigadas⁷. Esta espécie tem evoluído de um sistema de reprodução incomum que emprega tanto ginogênese e androgenesis (Figura 1B)^8,9. A maioria das novas rainhas e machos são uma relação clonal produzidos a partir de genomas maternos e paternos, respectivamente. Além disso, os trabalhadores e algumas rainhas são produzidas sexualmente⁸. Este sistema de reprodução é particularmente adequado para estudos genéticos, pois as cruzes de endogamia produzidas usando sexualmente produziram rainhas e machos são geneticamente equivalentes a um cruzamento clássico. Desde rainhas sexualmente produzidas diferem morfologicamente rainhas produzidas a partir de genomas maternos¹⁰ (Figura 1B), realização e avaliação de endogamia cruzes é bastante simplificada usando esse método.

Neste artigo, os métodos para o estabelecimento de colônias de laboratório para teste de passagem, aplicação da consanguinidade cruzes usando pares de cheia-sib e avaliar o sucesso dessas cruzes usando genotipagem de membros da colônia e dissecção de prole masculina genitália é descrita no V. emeryi.

Independentemente do sistema de reprodução empregado, aplicação de consanguinidade cruzes é frequentemente o primeiro passo essencial em qualquer investigação de sistemas de determinação do sexo na Hymenoptera. Por exemplo em Cardiocondyla obscurior, a quase total ausência de machos diploides após 10 gerações de acasalamento no laboratório completo-sib demonstra ausência de CSD locus¹¹. É possível prever o número de loci CSD da proporção de machos produzidos em consanguinidade cruzes^6,12,13.

Protocolo

1. coleta e manutenção de V. Emeryi colônias em laboratório de campo

Nota: Ninhos de V. emeryi são encontrados em logs e caído em decomposição árvore branchesin florestas secundárias em todo o Japão a apodrecer. Esta espécie mostra dois tipos de colônias, ou seja, (1) colônias produzindo apenas longimanus rainhas e (2) colônias produzindo principalmente rainhas-de-asa-curta, além do pequeno número de rainhas longimanus^8,14. Neste protocolo, recolhemos o último tipo de colônias na província de Ishikawa, Japão.

1. Colete V. emeryi colônias durante o início do verão.
   Nota: Para obter um número suficiente de indivíduos sexuais durante a temporada reprodutiva, colônias contendo mais de 300 indivíduos são preferidas.
2. Transferi os espécimes de formiga dos ramos coletados para um ninho de gesso artificial com uma tampa de vidro usando um aspirador (Figura 2, à esquerda).
3. Manter colônias no ninho artificial a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h. Fornece água da torneira com um frasco de lavagem para molhar o gesso.
   1. Adicione cerca de 100 mg de pó de grilo seco envolvido em papel alumínio e açúcar mascavo cheio de água na ponta (ponta de 20 µ l) todos os dias até surgem reproductives novos (F₁ alado-rainhas e machos de₁ F).

2. cruzes de laboratório experimental

Nota: Reproductives novos começam a surgir do final do verão ao Outono (Figura 3). Longimanus rainhas são produzidas sexualmente, e damas-de-asa-curta são produzidas uma relação clonal e têm o genoma materno (Figura 1). Use longimanus rainhas e machos por consanguinidade cruzes.

1. Para parar os indivíduos de se mover, coloque colônias em uma sala de ambiente constante a 4 ° C por 15 min.
2. Retire as pernas meados dos 30 trabalhadores usando fórceps sob um microscópio estereoscópico e transferi-los para o ninho novo em gesso menor (Figura 2, direita) por consanguinidade cruzes.
   Nota: As pernas são removidas para distinguir os trabalhadores presentes os trabalhadores que vão ser produzidos pelas cruzes de endogamia subsequentes.
3. Adicione 3-4 larvas ou pupas em um ninho de gesso contendo os trabalhadores.
   Nota: Os trabalhadores mostram atividade exploratória na colônia de rainhas-menos F₀ . Larvas ou pupas podem efetivamente atrair esses trabalhadores e reproductives novos no centro da colônia durante o teste de passagem. Como resultado, manter as condições da colônia experimental perto da colônia normal.
4. Transferi uma rainha longimanus e um macho em um ninho de gesso preparado na etapa 2.3 para procriação consanguínea cruzes.
5. Manter colônias a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h com comida e água fornecida conforme descrito no ponto 1.3, até a rainha perde as asas e pôr ovos.
   Nota: Isso leva uma semana para um mês.
6. Verifica o cotidiano da colônia experimental sob um microscópio estereoscópico. Depois de executar a endogamia atravessa entre a prole de₁ F, ovos podem ser observados sob um microscópio estereoscópico.
7. Após a F₁ rainha começa a postura dos ovos, remover os machos de₁ F e larvas ou pupas adicionadas na etapa 2.3 do ninho para evitar misturar F₂ geração (descendência e a geração de₁ F (machos e fêmeas usadas por endogamia Cruzes) produzidos a partir de cruzamentos de consanguinidade).
   Nota: Se houver alguns machos na colônia, é possível induzir a endogamia cruzes usando um macho e 1 a 3 rainhas na mesma colônia experimental.
8. Manter colônias sob a mesma conditionsas descrito no ponto 1.3, até descendentes de₂ F emergem.
   Nota: Rainha de transferência F₁ e F₂ prole em ninho novo em gesso maior (Figura 2, à esquerda) para manutenção a longo prazo da colônia.

3. avaliação do sucesso de consanguinidade

1. Extração de DNA e genotipagem da geração parental (F₀)
   1. Remover uma perna de uma rainha de₀ F usando fórceps e transferir a perna para um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.
   2. Sob um microscópio estereoscópico, dissecar um abdômen feminino em prato de vidro preenchido com 300 µ l de água ultrapura usando fórceps e isolar a espermateca contendo o esperma dos machos acasalados.
   3. Descascar o tecido da espermateca e isolar o esperma do tecido da fêmea utilizando pinos de insetos.
      Nota: Para facilitar a extração de esperma da espermateca, armazenar espécimes femininos em 100% EtOH por mais de um dia antes de dissecação.
   4. Utilizando uma micropipeta, transferi o esperma em um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.
   5. Incubar as amostras da rainha de F₀ e espermatozoides preparados na etapa 3.1.1 e 3.1.3, respectivamente, a 95 ° C por 20 min. Flash microtubo de centrifugação e armazenam a 4 ° C.
   6. Genótipo todas amostras usando o método descrito em outra parte⁴.
2. Extração de DNA do par de formigas usadas por cruzes de endogamia (F₁)
   1. Depois de confirmar a produção de ovos pela sib acasalado rainha de F₁ , extrair o DNA da rainha usando suas asas galpão ou uma perna mid e genótipo usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima.
   2. Extraia o macho de DNA de F₁ usando uma perna e genótipo-los usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima.
      Nota: As amostras podem ser armazenadas em 100% EtOH antes de extração de DNA e DNA em agente quelante podem ser armazenado durante dois meses a 4 ° C.
3. Avaliação da fertilidade masculina em machos produzidos a partir de consanguinidade cruzes
   Nota: Machos diploides, produzidos a partir de endogamia cruzes são muitas vezes estéril.
   1. Disse órgãos reprodutivos internos em um prato de vidro com 400 µ l de solução de PBS usando fórceps.
   2. Remover o PBS e adicionar 4% paraformaldeído (PFA) utilizando uma micropipeta.
   3. Fixe o tecido incubando em PFA por 30 min à temperatura ambiente (15-25 ° C).
   4. Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS utilizando uma micropipeta.
   5. Dilua a 4', a solução de (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindole 1 µ g/ml em PBS.
   6. PBS de remover e adicionar aproximadamente 300 µ l desta solução diluída de coloração DAPI para tecido.
   7. Incube 15 min sob condição de escura, à temperatura ambiente (15-25 ° C).
   8. Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS e transferir o tecido no centro do vidro de slide usando fórceps.
   9. Monte o tecido na montagem média faloidina contendo diversos TRITC-conjugados.
   10. Observe as amostras por laser confocal microscópio usando 20 X ou 63 X objectivas.
   11. Use um laser de excitação 405 nm e um detector de híbrido em 410-530 nm para a deteção de DAPI.
   12. Use um laser de excitação 561 nm e um detector de híbrido em 565-650 nm para a deteção de TRITC.
   13. Use uma velocidade de varredura de 400 Hz (400 linhas/s) com uma resolução de 1024 × 1024 pixels.
   14. Capture imagens usando uma plataforma de software.

Resultados

Resultados da análise de microssatélites usando F₀ e F₁ gerações mostraram que a consanguinidade cruzes foram produzidas com sucesso (Figura 4)⁶. Como resultado de cruzamentos de consanguinidade, rainhas acasaladas foram obtidas dentro de um mês de estabelecer colônias cruzamento experimental. Um quarto (27,1 ± 8,91% SD) de todos os descendentes (F₂) de cruzamentos a endogamia era do sexo masculi...

Discussão

Este artigo demonstra os protocolos que podem ser usados para induzir a endogamia cruzes e avaliar a ocorrência de endogamia na formiga V. emeryi. Nos experimentos, genotipagem dos indivíduos utilizados para cruzes é necessária para garantir que a endogamia cruzes foram bem sucedidos. No entanto, a eficácia destes testes de cruzamento é evidente como os machos diploides podem ser produzidos durante todo o ano, enquanto os machos haploides só podem ser produzidos no outono em campo e o laboratório

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.