Um eletrodo de Micro-agar sal ponte para analisar a taxa de rotatividade de próton de proteínas recombinantes de membrana

Resumo

Nas medidas eletrofisiológicas, a presença de uma potencial de difusão perturba a medição precisa do potencial reverso, alterando o potencial de eletrodo. Usando uma ponte de sal de micro-agar, o impacto de difusão potencial é minimizado, que permite uma medição mais precisa dos números de volume de negócios de substrato de proteínas de membrana recombinante reconstituído.

Resumo

Até à data, mais de 50% de todas as drogas farmacológicas alvo a cinética de transporte de proteínas de membrana. A caracterização eletrofisiológica das proteínas de membrana transportadora reconstituído em membranas de bicamada lipídica é um método poderoso mas delicado para a avaliação das suas propriedades físico-químicas e farmacológicas. O número do volume de negócios de substrato é um parâmetro único que permite a comparação da atividade de proteínas de membrana diferentes. Um electrogenic dos transportes, o gradiente do substrato translocado cria um potencial de membrana que directamente se correlaciona com a taxa de rotatividade do substrato da proteína. Por meio de eletrodos de cloreto de prata, um potencial de difusão, também chamado junção líquida potencial, é induzido, que altera o potencial de eletrodo e perturba significativamente medições de potencial de membrana precisos. Potencial de difusão pode ser minimizado por uma ponte de sal, que equilibra o potencial de eletrodo. Neste artigo, uma ponte de sal de micro-agar é projetada para melhorar a afinação eletrofisiológica, que utiliza micropipetas para a formação de membrana. A solução salina é preenchida em uma ponta da pipeta conta, estabilizada pela adição de agarose e pode facilmente ser montada em um padrão de eletrodo. O potencial de elétrodo de um eletrodo de ponte de microsal é mais estável em comparação com um padrão de eletrodo. A implementação deste sistema estabiliza o potencial de eletrodo e permite medições mais precisas do potencial de membrana gerados por um gradiente de pH. Usando este sistema, as taxas de rotatividade de prótons das transportadoras mitocondriais UCP1 e UCP3 são revogadas e em comparação com medições anteriores.

Introdução

Proteínas da membrana são alvo de até 60% de todas as drogas farmacêuticas conhecido¹. Medidas eletrofisiológicas das proteínas de membrana são uma ferramenta poderosa, mas delicada para analisar o transporte electrogenic de substratos mediada por proteínas de membrana transportadora. A modulação da corrente do transmembrane pela aplicação de tensões constantes ou rampas de tensão permite avaliar as propriedades farmacológicas e físicas das transportadoras, por exemplo, a ativação e inibição de substratos ou os transportes cinética. De especial interesse é o número de volume de negócios de substrato, que exibe a quantidade de substrato que é translocada por uma proteína de membrana por unidade de tempo. É um parâmetro importante quando se compara a cinética de várias proteínas de membrana. Estabelecimento de um gradiente de concentração do substrato carregado através da membrana gera uma força eletromotriz, da qual é deduzido o número de volume de negócios do substrato.

Usando um eletrodo de AgCl, a presença de um buffer de cloreto livre cria um potencial de difusão que altera o potencial de eletrodo e leva a uma mudança nas medições de corrente-tensão². Embora sempre presente, é insignificante para condutância padrão e medidas de capacidade desde que esses parâmetros são também dependente na encosta da gravação de corrente-tensão (condutância) ou são a diferença de uma única gravação (capacidade), que Cancela o potencial. No entanto, a gravação do potencial reverso, que é criado pelo transporte do substrato, pode significativamente ser perturbada pelo potencial de difusão. Assim, para medidas exatas do potencial reverso, os potenciais de eletrodo tem que ser mantido constante.

O potencial de difusão pode ser minimizada por dois métodos: (i) na presença de uma membrana de BICAMADA, uma concentração de substrato tem que ser aumentada em um lado da membrana^3,4, ou (ii) uma ponte de sal equilibra o potencial de eletrodo ⁵. o primeiro método é altamente dependente da estabilidade das medições. A membrana tem de sobreviver durante vários minutos, a partir da adição de substrato sob agitação até que o substrato é quase igualmente distribuído na solução. Se a membrana rompe no meio, o gradiente de substrato é alterado pelo livre intercâmbio de moléculas carregadas e medições virar imprecisas. O último método equilibra a potencial de difusão, mas é limitado pelo tamanho da afinação. Implementar um pequeno mas funcionamento ponte de sal em uma escala micro para um set-up eletrofisiológico está desafiando⁶. Para o último método, a solução salina é preenchida em uma dica de conta e estabilizada pela adição de agarose para impedir a difusão da solução de sal para a solução-tampão.

Neste protocolo, uma simples produção de um micro-agar sal ponte e implementação em um set-up eletrofisiológico baseada a pipeta de set-up⁷ é descrita. Uma dica de conta é ajustada para conter uma solução de KCl 3M com agarose a 1 mol % (p/v) e a ponte de uma solução de eletrodo e buffer de AgCl. A vantagem da ponte de microsal é exibida por vez gravações da mudança de potencial do eletrodo e as medidas mais precisas da membrana potencial em diferentes gradientes de pH. No sistema modelo de proteínas recombinantes, reconstituído em lipossomas, as taxas de rotatividade das transportadoras mitocondriais UCP1 e UCP3 produzidos sob condições similares são revogadas e comparadas ao anterior resultados^3,8.

Protocolo

1. produção de proteínas recombinantes de desacoplamento (UCPs) e a formação de membranas de BICAMADA Planar

1. Produzir UCP1 recombinante e UCP3, conforme descrito por Rupprecht et al ⁹ e Hilse et al ¹⁰
2. Formar as membranas de BICAMADA planar sobre as pontas de pipetas de plástico descartáveis convencionais como descrito por Beck et al ⁷

2. preparação do eléctrodo Micro-agar sal ponte

1. Ajustar uma pipeta conta ponta (ver Tabela de materiais) para o comprimento adequado.
   1. Marca a posição em uma ponta vazia no qual a ponta contendo tampão será anexado ao e usar uma pinça deslizante para medir o comprimento do eletrodo micro-agar sal ponte.
      Cuidado: A ponta de conta deve ser suficientemente compridas introduzir a solução-tampão para as medições.
   2. Corte a ponta do conta com uma faca afiada ou uma lâmina e limpe a superfície de corte com água e etanol.
2. Prepare o eletrodo revestido de AgCl.
   1. Cortar um fio de Ag de aproximadamente 8 cm de comprimento e limpe-o com água e etanol.
   2. Pegue um pedaço de lixa e suavizar a superfície de 1 cm de comprimento na extremidade do fio, que deve estar em contacto com a solução de sal.
   3. Mergulhe a extremidade suavizada em uma solução de KCl 3M e bata-eletroquimicamente com cloreto de usando uma fonte DC em 1.5 V para 10 s.
   4. Limpe o eletrodo com água, seque-o e ajuste o comprimento do eletrodo do lado sem revestimento AgCl para que penetra a mais profundamente possível de ponta de conta.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Prepare uma solução de sal de KCl 3M com agarose a 1% (v/v).
   1. Pesar 4,47 g de KCl e dissolvê-lo em 20 mL de água, agitando-lo num balão.
   2. Retire o agitador, pesar 0,2 g de agarose e adicioná-lo para o balão.
   3. Aquece a solução a 100 ° C para derreter o agarose e impedir a coagulação.
      Cuidado: O frasco estará muito quente. Não tocá-lo com as próprias mãos. Use luvas para a manipulação.
4. Encha a ponta de conta com a solução de sal de agarose.
   Atenção: A solução está quente. Protege as mãos e o trabalho cuidadosamente para evitar salpicos.
   1. Se a agarose começa a coagulação, aquece a solução de um sal totalmente derreter o agarose novamente.
   2. Mergulhe a ponta conta 10 µ l da solução de sal de ágar. Mergulhe-o lentamente e com cuidado evitar ar bolhas na ponta.
   3. Retire a ponta da pipeta e empurre o eletrodo de AgCl do lado mais amplo da ponta. Certifique-se de que o eléctrodo penetra a solução salina.
   4. Arrefecer o eletrodo à temperatura e ligá-lo dentro do amplificador.
5. Prepare o buffer para as medições.
   1. Pesar 0,710 g de Na₂SO₄, 0,195 g do MES, 0,121 g de TRIS, 0,023 g de EGTA, adicionar 100 mL de água destilada para um béquer e agitar a solução.
   2. Verifique o valor de pH da reserva por meio de um eletrodo de pH e ajustar o valor de pH de 7,32.
   3. Verifique se o eletrodo de referência e o eletrodo de sal ponte de ágar estão em contato elétrico.
      1. Adicione 1 mL de tampão de um recipiente de plástico.
      2. Mergulhe no eléctrodo de referência e o eletrodo de sal ponte de ágar e procure uma resposta de sinal. Se a resposta de sinal está correta, vá para a etapa 2.7.
6. Se houver uma resposta de sinal falso ou sem contato elétrico, execute a seguinte resolução de problemas.
   1. Verifique se o eletrodo estiver em contacto com a solução de sal e empurre o eletrodo na solução.
      Nota: Se a solução estiver muito pegajosa, remover a ponte de micro-agar sal e preparar uma nova conta de ponta.
   2. Verifique se existem bolhas de ar dentro da solução de sal. Se sim, prepare uma nova conta de ponta.
   3. Verifique se a solução de sal está em contato com a solução-tampão. Se não, então cortar outro 1 mm da extremidade da ponta de tubo.
      Atenção: Certifique-se de que a ponta é ainda tempo suficiente para penetrar a ponta contendo tampão. Se não há ainda nenhum contato, prepare uma nova conta de ponta.
   4. Se nenhuma dessas etapas ajudar, prepare uma nova conta de ponta.
7. Para armazenamento, mergulhe o eletrodo de sal ponte de ágar em uma solução de KCl 3M.
   Nota: O protocolo pode ser parado aqui. Para uma pausa durante a noite, guarde o eletrodo na solução de sal de KCl 3 M a 4 ° C.
8. Prepare a ponta de plástico contendo tampão.
   Nota: Se o eletrodo foi armazenado durante a noite, tirá-lo e deixá-lo calor até a temperatura ambiente por 30 min.
   1. Pegue uma ponta de conta e dobrar o tubo, 2 cm da borda da parte estreita, cerca de 90 graus, usando um fio de aquecimento.
   2. Use uma faca bem afiada ou uma lâmina e cortar o tubo em torno de 5 mm da curva.
   3. Limpe a superfície no final com água e etanol e medir o diâmetro do furo da ponta. A partir disso, calcule a área da superfície.
   4. Revesti a superfície da ponta com hexano: hexadecano de 85:15 (v: v).
      1. Pipete 3 µ l de solvente e removê-lo da ponta.
      2. Espera 1 min para que todos o solvente residual na ponta tenha evaporado.
   5. Encher a ponta de medição com 3 µ l de tampão e ligá-lo para o eletrodo de ponte de sal.
      Observação: Verifique novamente se o eléctrodo de ponte de sal e o eletrodo de referência estão em contato elétrico realizando passo 2.5.3.
   6. Se não há nenhum contato elétrico, verifique o seguinte:
      1. Verificar se o eletrodo de ponte de sal é em contacto com a solução-tampão. Se não, então ou aumentar o volume da reserva na ponta ou preparar uma dica conta mais.
      2. Se há uma bolha de ar, retire a ponta do eletrodo a ponte de microsal, volte a encher o buffer na ponta e ligá-lo ao eléctrodo de novo.

3. medição dos parâmetros elétricos da membrana reconstituído com proteína recombinante

1. Aplicar um sinal de tensão alternada triangular com máxima Voltagem U_máx = 50 mV e ΔT_rampa = 50 ms, que cria uma resposta retangular de corrente alternada. Dos valores médios das correntes positivas e negativas (₊ e eu_–), calcule a capacidade da membrana de acordo com a seguinte fórmula:
   
2. Aplicar uma rampa de tensão variando de -50 mV para + 50 mV e registro atual. Caber uma função linear para os dados - o declive é a condutância - e calcular o ponto de intersecção do eixo x do ajuste.
3. A solução na ponta plástica de descarga e preencher um novo com um buffer contendo uma concentração de substrato aumentada.
   1. Se nenhuma membrana é formada dentro os primeiros 20-30 s, o volume de descarga e recarregá-lo. Isto garante que o gradiente de concentração através da membrana não altera significativamente durante a formação da membrana.
   2. Após a formação de uma membrana, execute os passos 3.1 e 3.2 novamente para verificar a formação adequada da membrana e para obter o ponto de intersecção do eixo x.

4. cálculo da taxa de rotatividade do substrato

Nota: Ver trabalhos anteriores para detalhes^3,7.

1. Estimar a quantidade de proteína na membrana da massa molecular de lipídios e proteínas (M_lipídico e a_proteínaM), a área da membrana e do grupo de cabeça um lipido (uma_membrana e um_lipido) e a proporção em massa da proteína por lipídios (r).
   
2. Calcule o potencial para o substrato transportado de Nernst. R é a constante dos gases, T a temperatura, z a carga do substrato transportado, F o Faraday constante e c₁ e c₂ as concentrações do substrato de ambos os lados da membrana.
   
3. Desde as gravações de corrente-tensão, apanhe o inverso potencial calculado com a diferença de pontos de interseção do eixo x da linear se encaixa na presença e na ausência do gradiente substrato.
4. Calcule a proporção de condutância de substrato, G_substrato, para a condutância total da membrana, G_total, pelo quociente do potencial reverso para o potencial de Nernst¹¹.
   
5. Calcular o volume de negócios de substrato número ΔN_substrato por hora unidade ΔT da condutância de substrato (G_substrato), a tensão aplicada U e a carga de a z: substrato
   
6. Partir da relação de substrato transportado por hora para o número de proteínas, calcule o volume de negócios taxa κ.
   

Resultados

Para verificar a minimização de potenciais a difusão, a estabilidade das medições da corrente-tensão de uma membrana intacta foi medida. Na Figura 2,gravações de representante-corrente tensão são retratadas na presença (pontos brancos) e na ausência (pontos pretos) de um gradiente de pH. De acordo com a equação de Nernst, o gradiente de pH induz uma mudança na voltagem. Desde o ponto de interseção do eixo x de um ajuste linear para os dados, é calculado o potencial de mudança. A fim de testar os dois eléctrodos, a mudança no ponto de intersecção do eixo x foi analisada para um padrão AgCl (Figura 2B; pontos brancos) e uma ponte de sal de microágar (Figura 2B; pontos pretos). Uma rampa de tensão foi gravada dez vezes seguidas, e a mudança média no eixo x é representada contra o tempo. Considerando que o eléctrodo de sal ponte agar tinha um deslocamento máximo de menos de 5 mV mesmo após 300 segundos de medição, o padrão de eletrodo variou de 30 mV no comportamento imprevisível e aleatório,.

Em seguida, os dois eléctrodos foram testados em gradientes de pH diferentes(Figura 3). Para o padrão de eletrodo, foi gerado um gradiente de pH de 0.35 e 1.0 (pontos brancos); para o eletrodo de sal ponte de ágar, gradientes de pH de 0.35, 0,7 e 1,0 (pontos negros). A mudança em potencial foi analisada em três medições independentes. Em contraste com um gradiente de 0.35, onde o deslocamento medido apenas varia ligeiramente, a mudança de tensão altera significativamente com o gradiente de pH de 1.0 na ausência da ponte microágar de sal. De um ajuste linear para os dados, a inclinação da função é de 26,4 ± 2,3 mV/ΔpH para o padrão de eletrodo e 50.1 ± 4,6 mV/ΔpH para o elétrodo de micro-agar sal ponte. De acordo com a equação de Nernst, a mudança de potencial calculada é 60.7 mV/ΔpH em T = 32 ° C.

Usando a ponte de sal micro-agar, o número do volume de negócios de próton, κ, mitocondrial UCP1 e UCP3 foi medido e em comparação com medições anteriores (Figura 3B). Semelhante à Figura 3A, ΔpH = 1.0 foi gerado e o potencial reverso foi medido. A quantidade de proteína na membrana foi estimada de acordo com a fórmula fornecida na seção 4 do protocolo, com uma proteína, a proporção de lipídios de 4 µ g / (mg de lipídios), uma massa molecular de 33.000 e 750 de proteínas e lipídios, uma área de superfície de membrana de 3,53 x 10 ^-4 cm²e uma área por lipídios de 7,8 x 10^-15 cm². O obtidos κwas 5,56 ± 0,38 s^-1 e 4,10 ± 0,71 s^-1 para UCP1 e UCP3, respectivamente (Figura 3B).

Figura 1 : A afinação eletrofisiológica com a ponte de micro-agar sal. (A), este painel mostra um esboço de afinação. A ponta de conta contendo a solução de sal de ágar (retratada em laranja) é colocada entre o eléctrodo (preto) e a ponta de tampão-contendo (azul). A membrana é formada na superfície no final da ponta do tampão-contendo (indicada pela seta). (B), este painel mostra uma imagem de afinação eletrofisiológica com a implementação da ponte microágar de sal. As setas apontam para o eletrodo, a ponte de sal de micro-agar, o eletrodo de referência e o recipiente com a solução-tampão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : A comparação de uma ponte de sal de micro-agar e um padrão de eletrodo AgCl. (A), este painel mostra uma representante atual tensão medida na presença (cinzas pontos) e na ausência (pontos brancos) de um gradiente de pH de 1. As linhas representam um ajuste linear para os dados, do qual condutância e o eixo x são obtidos valores de interseção. A mudança de voltagem é avaliada pela diferença dos valores de interseção de ambas as gravações. (B), este painel mostra o deslocamento da membrana potencial de um eletrodo padrão de AgCl (pontos brancos) para um eletrodo de micro-agar sal ponte (pontos pretos) no tempo. Medições de corrente-tensão dez foram gravadas em uma linha e a mudança de média tensão por difusão potencial é plotada contra o tempo. Em todos os experimentos, a membrana foi feita de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstituído com ácido araquidônico 15 mol % na concentração de 1,5 mg/mL. O buffer contido 50mm Na₂SO₄, MES de 10 mM, 10 mM TRIS e 0,6 mM EGTA a pH = 7,34 e T = 32 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Número de volume de negócios de próton de UCP1 e UCP3 calculado a partir do potencial reverso na presença de um gradiente de pH. (A), este painel mostra a mudança no potencial de membrana contendo UCP1 de vários gradientes de pH de um padrão AgCl (pontos brancos) e um eletrodo de micro-agar sal ponte (pontos negros). As linhas representam um ajuste linear para os dados. (B), este painel mostra o número do volume de negócios de próton de UCP1 (primeiro conjunto de dados) e UCP3 (segundo conjunto de dados) como calculado partir da razão de mudança de tensão para o potencial de Nernst, de acordo com as fórmulas na secção 4 do protocolo. A primeira barra de cada conjunto representa taxas de rotatividade, medidas com a ponte de sal de microágar. A segunda barra de cada conjunto de dados representa medições anteriores, utilizando um eléctrodo padrão de AgCl. Valores para UCP1 e UCP3 foram tirados de Urbankovaet al . ³ e Macher et al ⁸. em todas as medições, tornou-se a membrana de 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL reconstituído com 15 mol % AA e UCP1/UCP3. A concentração de lipídios e proteínas foi 1,5 mg/mL e 4 µ g/mg de lipídios, respectivamente. O buffer contido 50mm Na₂SO₄, MES de 10 mM, 10 mM TRIS e 0,6 mM EGTA a pH = 7,34 e T = 32 ° C. O pH do buffer para as medições de gradientes foi aumentado para 7,66, 8,00 ou 8.33 adicionando TRIS e foi alterado em pipeta contendo solução. Os valores são o média ± desvio-padrão das três medições independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A implementação da micro-agar sal ponte com o eletrodo minimiza sua difusão potencial e permite medições mais precisas do potencial de membrana gerados por um gradiente de pH. Na presença de vários gradientes de pH transmembrana, o potencial de mudança de ambos os eletrodos era aceitável no ΔpH = 0.35 quando comparando com o valor teórico do equilíbrio Nernst potencial (Φ_Nernst = 23,8 mV para ΔpH = 0,4). No entanto, mais gradientes de pH fisiológico, como para a instância em mitocôndrias entre a matriz e o espaço intermembranar, o eletrodo padrão de AgCl falhou medir precisamente a mudança potencial no ΔpH = 1(Figura 3). O eletrodo em ponte com micro-agar sal entregues os valores que foram muito mais comparáveis com a teoria.

Potencial de difusão também pode ocorrer no eletrodo de referência AgCl se a solução-tampão é alterada durante o experimento. Solução tampão de cloreto livre foi usada nas experiências desde que proteínas de desacoplamento foram sugeridas para o transporte de íons cloreto, e o pH foi ajustado usando Tris ou MES. O potencial de eletrodo, na ausência de uma considerável concentração de cloreto, depende principalmente de impurezas de cloreto na solução tampão. Sua composição é inalterada durante os experimentos, simplesmente resultará em um potencial de deslocamento constante. No entanto, para a medição de uma absoluta diferença de potencial entre os dois eletrodos, um sistema de sal-ponte de ágar simples (Ag/AgCl 3 M KCl) pode também ser utilizado para o eletrodo de referência.

Uma ponte de micro-agar sal equilibra a potencial de difusão por um equilíbrio de potencial do eletrodo. A fim de estabilizar a solução salina, agarose a 1% (p/v) foi adicionado para evitar que a mistura da solução de sal com a solução-tampão. Os íons de sal K⁺ e Cl^– tem mobilidades semelhantes em líquido e equilibrar o potencial de eletrodo. Para instalar corretamente a ponte de sal, a solução de ágar de sal tem de ser suficientemente aquecido para encher a ponta de conta sem quaisquer bolhas de ar e para cobrir o eletrodo de AgCl. Antes de nova utilização, contato elétrico entre o eletrodo de ponte de sal e o eletrodo de referência tem que ser verificado. Dependendo da hora em que a ponte de sal é usada, a solução de sal tem de ser suficientemente gelificada para evitar qualquer mistura da solução de sal com o buffer. Isto é especialmente crítico se K⁺ ou Cl^– transportadores são investigados. A ponte de sal foi usada para um tempo muito curto e a eluição de agarose é insignificante neste intervalo de tempo. Uma maior concentração de agarose de até 5%, ou de ágar-ágar (3% - 5%), permite usar a ponte de sal por um longo período de tempo^6,12.

Este método permite determinar a cinética de transporte de um transportador de membrana (i) com taxas de baixo volume de negócios e (ii) de mitochondrial proteínas da membrana interna, que dificilmente pode ser investigado em padrão remendo braçadeira set-ups¹³. Sua precisão é principalmente dependente da medição potencial reversa, que precisão é diminuída em uma condutância da membrana total baixa e pequenos gradientes de concentração que induzem uma membrana potencial abaixo do ruído de gravação.

Usando esta instalação, foram medidos os índices de volume de negócios de UCP1 e UCP3 produzidos nas mesmas condições. Devido o gradiente de pH mais elevado, as taxas obtidas parecem ser mais precisos e imperturbável por artefatos resultantes a partir da mudança de potencial do eletrodo menor. Ele pode ser usado para mais analisar e comparar os transportadores de membrana mitocondrial produzidos em condições similares.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microloader tips	Eppendorf	5242956.003	Microcapillary pipette tip
Ethanol 99%	AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H	AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid	Carl Roth GmbH + Co. Kg	6781.3
DC supply	Voltcraft	V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3810.2
Patch Clamp Amplifier	Heka
Sample tube	Carl Roth GmbH + Co. Kg	5863.1
Na2SO4	Carl Roth GmbH + Co. Kg	8560.3
MES	Carl Roth GmbH + Co. Kg	4256.2
TRIS	Carl Roth GmbH + Co. Kg	AE15.2
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. Kg	3054.1
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-100ML
Hexadecane	Sigma-Aldrich	296317-100ML
Heating wire	Voltcraft	USPS-2250