Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos

Resumo

Um protocolo detalhado para a avaliação de leituras visuais e estruturais em roedores por coerência óptica tomografia computadorizada e optocinético resposta é apresentado. Os resultados fornecem informações valiosas para investigação oftalmológica, bem como neurológica.

Resumo

Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica rápida, não-invasivo, interferométricas, permitindo que a imagem da retina de alta resolução. É uma ferramenta ideal para a investigação dos processos de neurodegeneração, neuroproteção e neuro-reparação envolvendo o sistema visual, como estes frequentemente correlacionar bem com as alterações da retina. Como uma leitura funcional, visualmente evocado olho compensatório e os movimentos da cabeça são comumente usados em modelos experimentais envolvendo a função visual. Combinar as duas técnicas permite uma investigação in vivo quantitativa da estrutura e função, que pode ser usada para investigar as condições patológicas ou para avaliar o potencial de novas terapêuticas. Um grande benefício das técnicas apresentadas é a possibilidade de realizar análises longitudinais, permitindo a investigação de processos dinâmicos, reduzindo a variabilidade e reduz o número de animais necessários para os experimentos. O protocolo descrito visa fornecer um manual para a aquisição e análise de retina de alta qualidade de camundongos e ratos usando um suporte personalizado de baixo custo com uma opção para fornecer anestesia inalatória. Além disso, o guia proposto destina-se como um manual de instruções para pesquisadores usando análise de resposta (OKR) optocinético em roedores, que podem ser adaptados às suas necessidades específicas e os interesses.

Introdução

O exame do percurso visual, como parte do sistema nervoso central, tem provado para ser um ponto de partida eficaz na abordagem não só oftalmológica^1,2,3,,45 , mas também neurológicos^{6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16} perguntas. Nos últimos anos, a OCT e OKR foram identificados como ferramentas úteis de analíticas, não-invasivo para avaliar uma variedade grande de retinopatias e manifestações da retina em vários modelos de roedores^{17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25}. OCT permite rápido e de alta resolução na vivo visualização da morfologia da retina e estrutura em camundongos e ratos, com resultados em boa concordância com cortes histológicos de animais retinae²⁶. OKR constitui um método rápido e robusto para avaliar quantitativamente a função visual.

Muitos dispositivos OCT permitam simultânea confocal digitalização laser Oftalmoscopia (cSLO) de imagem com diferentes comprimentos de onda, que fornece informações de diagnóstico sobre patologias da retina, ou seja, visualização de lipofuscina depósitos ou alterações da retina pigmento de epitélio²⁷. Além disso, a imagem latente na vivo de fluorescência rotulados de células em animais transgénicos é possível^{28,29,30,31,32}. No entanto, a aplicação da tecnologia de OCT em modelos de roedores é ainda um desafio, principalmente por causa do tamanho pequeno olho. Vários dispositivos comercialmente disponíveis exigem adaptações e muitas vezes um tamanho diferente de titular é necessário para os animais de espécies diferentes da imagem. Além disso, os animais requerem anestesia para medição.

OKR dispositivos podem ser usados para avaliar a função visual em roedores. Os animais são colocados em uma plataforma no centro de um cilindro real ou virtual, exibindo um movimento irritante, que os animais acompanhar com movimentos de pescoço e cabeça reflexiva. Esta resposta optokinetic é reduzida ou eliminada em caso de redução ou perda da função visual.

O objetivo do presente protocolo é apresentar um manual para a medição da espessura da retina usando um dispositivo OCT comercialmente disponível com um suporte personalizado fornecendo anestesia inalantes. O protocolo ilustra como analisar o volume de digitalizações usando o software fornecido pelo fabricante. Para o teste visual, o objectivo é fornecer instruções sobre como usar um sistema comercialmente disponível para avaliar a OKR.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados em conformidade com as diretrizes experimentais aprovadas pelas autoridades regionais (Agência Estado de natureza, ambiente e defesa do consumidor; referência número 84-02.04.2014.A059) e de acordo com a associação de Pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) declaração sobre a utilização dos animais em oftalmologia e Vision Research e a directiva europeias 2010/63/CE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.

1. confocal digitalização tomografia de coerência óptica-Oftalmoscopia de Laser

Nota: O protocolo para a medição de cSLO-OCT é adaptável para todas as cepas de ratos de laboratório e ratos.

1. Preparações de set-up e pré-imagem latente
   Nota: O sistema de configuração do dispositivo OCT utilizado neste protocolo já foi descrito em outro lugar,³¹.
2. Preparação de roedor para anestesia inalantes
   1. O roedor em uma câmara de indução e o vaporizador para uma concentração de isoflurano de 2% em 2 L/min O₂.
   2. Verifique se o roedor é anestesiado por beliscar a cauda, remova-o da câmara e embrulhe em papel toalha para mantê-lo quente.
   3. Coloque o roedor no suporte personalizado³³ e ligar os incisivos na barra dentada integrado da peça boca, conectada para o vaporizador (2,5% de isoflurano em 2 L/min O₂).
   4. Aplique uma gota de fenilefrina 2.5%-Tropicamide 0,5% em cada olho para dilatação da pupila.
   5. Limpe qualquer excesso de líquido de colírios após 1 min e lubrificar os olhos com gel oftálmico de metil-celulose com base (por exemplo, hypromellose 0,3% colírio) para evitar a secagem para fora e turvação da córnea.
   6. Coloque a lente de contato personalizada (+ 4 dioptrias) no olho do rato à mão ou usando fórceps. Cubra o olho de rato com uma placa de vidro (por exemplo, redondo, lamela de vidro de diâmetro 12 mm) sem propriedades ópticas para assegurar uma superfície plana.
      Nota: Taxa respiratória do monitor durante a anestesia. Aumentar ou diminuir a concentração de isoflurano, se necessário.
3. Medição e análise
   Nota: Certifique-se de executar e relatar as medições OCT em consonância com as recomendações de APOSTEL³⁴ e executar o controle de qualidade de acordo com o consenso de OSCAR-IB critérios³⁵. Como estas recomendações foram desenvolvidas para imagens humanas OCT, alguns critérios não são ou somente parcialmente aplicável.
   1. Para o olho esquerdo da imagem, posicione o titular, tal como apresentado na figura 1A , para garantir que o bulbo do olho esquerdo das faces roedores a câmera.
   2. Pressione o botão Iniciar no canto direito do visor do painel de controle para iniciar o modo de aquisição.
   3. Coloque a alavanca do filtro de R e selecione BR + OCT para imagem de fundo azul reflectância e aquisição de B-scan no painel de controle.
   4. Defina a distância do foco de aproximadamente 38 dioptrias, usando o botão de foco na parte de trás da câmera e zoom na retina até o exame de OCT é visível na tela.
      Nota: Na primeira medição, o braço de referência deve ser adaptada para a medição de roedor. Pressionar a combinação Ctrl + Alt + Shift + O e ajuste o valor de referência braço na janela aberta até o OCT-scan aparece na tela.
   5. Para assegurar um caminho de feixe no meio da pupila com um ângulo ortogonal à retina em todos os aviões, posicione o disco óptico no meio do campo iluminado (BR) e ajustar a linha horizontal e vertical B-exames de nível horizontal girando girando / o titular (figura 1B) ou mover a câmera.
   6. Selecione o modo de verificação do volume e configurá-lo para 25 B-exames no modo de alta resolução em 50 rastreamento automático em tempo real (arte rasterizada de 50 em média A-Scans) sobre a tela do software.
   7. Centralizar o meio da grade de varredura de volume do disco óptico e iniciar aquisição pressionando o botão de sensibilidade preto e depois adquirir no painel de controle.
   8. Coloque a alavanca de filtro para o A, selecione Azul Auto florescimento (BAF) no painel de controle e ajustar o brilho da imagem com o botão de sensibilidade. Pressione o botão de sensibilidade e adquirir a imagem fluorescente células (por exemplo, EGFP) ou depósitos fluorescente auto.
   9. Aplica o gel oftálmico no olho do roedor para prevenir a desidratação e colocar o animal em uma gaiola separada com uma fonte de calor.
   10. Supervisione o roedor até que está totalmente recuperado da anestesia, em uma gaiola separada e alojado individualmente. Quando o animal é ambulatorial, devolvê-lo para a gaiola em casa.
   11. Para análise das varreduras volume, usar a segmentação automática do software do dispositivo OCT clicando sobre a verificação e selecione segmentação , em seguida, Todas as camadas. Certifique-se de que a qualidade das imagens OCT é suficiente e definir cortes de qualidade para cada conjunto de experimentos, por exemplo, > 20 decibéis.
   12. Realizar correção manual das camadas clicando duas vezes sobre o exame desejado, selecione Espessura de perfil e clique em Editar segmentações de camada. Selecione uma camada, por exemplo, pressione ILM para interno limitando a membranae, se necessário, corrigir a linha verde, movendo os pontos vermelhos por arrastar e soltar na posição correta.
       Nota: Certifique-se que o investigador para realizar a correção manual é cego para os grupos experimentais.
   13. Selecione a guia Espessura mapa e escolher o tratamento precoce 1, 2, 3mm de grade de estudo (ETDRS) de retinopatia diabética. Centro do círculo interno do disco óptico (Figura 2, à esquerda).
   14. Calcule a espessura das camadas da retina dos valores de espessura fornecidos pelo software para os diferentes sectores da retina de interesse. Para calcular os valores de espessura média de scans de volume, use o inteiro 1, 2, grade ETDRS de 3 mm, que cobre um ângulo de aproximadamente 25°, excluindo o círculo interno de 1 mm, que contém o disco óptico (Figura 2, direita).
   15. Realizar a análise estatística utilizando o software adequado. Se ambos os olhos de um animal estão incluídos, considere uma contabilidade modelo estatístico para dentro as correlações inter olho do assunto (por exemplo,, generalizado estimando equações ou misturado modelos lineares), como os olhos de um assunto são estatisticamente dependentes³⁶ .

2. optocinético resposta

Nota: A seguir, é fornecido um manual detalhado para medições de OKR de camundongos e ratos, que pode ser adaptado às necessidades individuais específicas.

1. Instalação e pré-medição preparações
   1. Ligue o computador. Depois de iniciado o sistema, ligue as telas da câmara de teste, conforme descrito em mais detalhes em outro lugar,³⁷.
   2. Selecione uma plataforma adequada para a medição de camundongos ou ratos.
      Nota: O tamanho da plataforma é selecionado, com base no corpo do roedor. O animal deve ser capaz de sentar-se corretamente na plataforma sem a capacidade de andar por aí.
   3. Abrir a janela de Pre-configurações clicando duas vezes sobre o software, selecione novo grupo e escolha o nome do grupo, o número de indivíduos, as espécies e cepas. Selecione um estímulo variável: frequência espacial e temporal, a sensibilidade ao contraste, a velocidade ou a orientação no menu drop-down, em seguida, pressione Criar novo grupo.
   4. Concentre-se na plataforma, manipulando o anel de foco da câmera no topo da câmara e calibrar o sistema, alinhando (arrastar e soltar) o círculo vermelho ao redor do círculo preto na plataforma.
2. Medição e análise
   1. Coloque o animal na plataforma, deixá-lo a se adaptar ao ambiente de ~ 5 min.. Levante o animal até na plataforma se ele cai (Figura 3A).
   2. Selecione o número de assunto e condição no canto superior direito da tela do software (Figura 3B). Um estímulo é variável, os outros estímulos são mantidos constantes. Isto é confirmado pelo símbolo de cadeado aberto ou fechado a cadeado ao lado do estímulo.
   3. Inicie a medição, selecionando ◄ para Sim ou ■ por n, se o animal controla ou não monitorar, respectivamente.
      Nota: Acompanhamento para a direita corresponde para o esquerda e para a esquerda de rastreamento no olho direito. O software aleatoriamente altera a direção da grade em movimento.
   4. Selecione o tamanho do passo do estímulo manualmente clicando nas setas para cima e para baixo ao lado do estímulo variável ou deixá-lo se adaptar automaticamente pelo software, se o limiar de estímulo converge.
   5. Para obter melhores resultados, anime o animal, , por exemplo, por alta assobiando sons e anular, clicando no símbolo caixa preta ou branca na tela software. Execute essas ações repetidas vezes no caso de medições prolongadas.
   6. Para análise de dados, selecione a guia Sumário e clique no arquivo | Exportar tabela/gráfico para exportar o conjunto de dados desejado.
   7. Realizar a análise estatística utilizando o software desejado (Veja também passo 1.3.15).

Resultados

Utilizando 3 imagens de OCT de geração de^rd em peptídeo de glicoproteína (MOG) mielina oligodendrocyte induzida modelos de rato de encefalomielite auto-imune experimental (EAE), obtiveram-se seções morfológicas de alta resolução da retina do rato. Usando esta tecnologia, as capacidades protetoras de substâncias diferentes foram demonstradas¹⁷. Os valores de espessura das camadas internas da retina (IRL) obtidos estão em boa concordância com os números de células ganglionares da retina (RGC) obtidos pela coloração histológica de wholemounts da retina (Figura 4).

OKR monitoramento fornece uma leitura funcional da neurodegeneração vista pela OCT. Nesses experimentos, função visual avaliada como frequência espacial por OKR e neuroaxonal danos avaliados como IRL desbaste por OCT, foram em estreita correlação¹⁷. Vários protocolos podem ser empregados para examinar a acuidade visual, alterando a frequência espacial ou temporal, sensibilidade ao contraste, orientação ou velocidade da grade em movimento. No modelo de EAE, uma frequência espacial melhorada de 0.05 ciclos/grau (c/d) de animais tratados com a substância 1 foi detectada em comparação com ratos não tratados de MOG-EAE (Figura 5).

Figura 1: suporte personalizado para medição de OCT. (A) OCT imagem de um rato C57BL/6J, usando o suporte personalizado³³ e (B) eixo de rotação em volta do olho de roedor. Rotação no plano transversal (à esquerda) e no plano axial (à direita) é demonstrada. Esta figura foi modificada de Dietrich, M. et al.³³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: OCT post análise aquisição. "1, 2, 3 mm" grade ETDRS no 25 B-scan de volume protocolo (à esquerda). A espessura das camadas da retina é fornecida para os diferentes sectores da retina pelo software (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: medição de OKR de ratos e estímulo configurações. (A) Top ver através da câmera analisando um rato C57BL/6J na plataforma na câmara. (B) interface do usuário e configurações do software OKR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: camundongos C57BL/6J com MOG EAE mostram um curso da doença atenuado quando tratados com a substância 1 comparados aos controles não tratados. (A), a degeneração das camadas interiores da retina é reduzida (B) e a clínica Pontuação EAE é atenuada durante o curso da EAE quando foi administrada a substância 1. Os ratos foram marcados diariamente, e OCT medições foram realizadas mensalmente durante um período de 120 dias. Os gráficos representam a média e o desvio-padrão de pelo menos dez animais por grupo. (*p < 0.05, * * *p < 0,001, área sob a curva comparada por ANOVA com teste post hoc de Dunnett). (C) a mudança de espessura IRL é em boa conformidade com perda RGC (* * *p < 0,001, por ANOVA com teste post hoc de Dunnett em comparação com ratos MOG não tratada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: medição de OKR de camundongos C57BL/6J com MOG-EAE. (A) OKR revela uma melhor acuidade visual dos animais tratada com a substância 1 em comparação com não tratada MOG EAE ratos medidos pelo limite de frequência espacial testes ao longo de um período de 120 dias. Os gráficos representam a média e o desvio-padrão de pelo menos seis animais por grupo (* *p < 0,01, * * *p < 0,001, área sob a curva comparada por ANOVA com teste post hoc de Dunnett). (B) a imagem de um rato C57BL/6J na câmara de testes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo fornece uma instrução para as medições de espessura e o exame da função visual em roedores. Leituras visuais são cada vez mais utilizadas em pesquisa translacional^{18,26,38,39,40} e são facilmente transferíveis para ensaios clínicos. A significativa vantagem de PTU em comparação com investigações histológicas em experiências com animais é que análises longitudinais são possíveis, permitindo que a investigação de processos patológicos dinâmicos, em grande medida, reduzindo a variabilidade e o número de animais necessários por estudo. Além disso, imagens in vivo com OCT não está sujeita a fixação, corte ou coloração artefatos, que podem afetar a espessura de camada em investigações histológicas.

No entanto, a orientação ortogonal do raio laser em todos os planos em relação a retina é um passo fundamental para garantir a qualidade e a reprodutibilidade dos valores de espessura. Isso requer algum treinamento do investigador e é obrigatório antes da aquisição do OCT varreduras. Além disso, como os dispositivos comerciais são construídos para aplicações em seres humanos, a qualidade das imagens de OCT roedores é ainda inferior em comparação com B-exames de pacientes humanos. Na experiência dos autores, pode ser difícil distinguir a retiniana interna diferente camadas (camada retinal da fibra do nervo, camada de células ganglionares e camada plexiforme interna) durante a correção manual. Portanto recomendamos analisar estas camadas como uma leitura composta (IRL).

A instalação experimental fornece uma opção para anestesia volátil, por exemplo, inalantes, isoflurano, que é, em nossa experiência, mais segura e mais fácil de controlar do que a anestesia injetável, por exemplo, xilazina-cetamina^41,42 e reduz o risco do despertar prematuro de roedores em caso de aquisição mais vezes (por exemplo, ao realizar imagens de células fluorescente rotuladas). Em um estudo preliminar, varreduras de volume foram identificadas como os protocolos com a maior validade e confiabilidade. A confiabilidade de reteste inter avaliador e o teste foi excelente quando volume varreduras, excluindo a parte central que contém o disco óptico foram avaliadas com valores de ICC (coeficiente de correlação intraclasse) acima de 0,85 para todas as avaliações.

A medição da resposta optokinetic baseia-se o reflexo optocinético involuntário, que ocorre em resposta a um campo continuamente em movimento. Em roedores, em contraste com outras espécies, o movimento envolve não só os olhos, mas a cabeça, que pode ser facilmente detectada usando a câmera.

Distinção entre "acompanhamento" ou normal movimentos comportamentais dos animais requer algum treinamento do investigador, e é importante para o grupo experimental de ser cego. Além disso, os animais precisam de uma fase de adaptação para acomodar a configuração experimental e durante os protocolos de medição de longa data, os animais tem que ser animado repetidamente para assegurar-se de que "sem controle" é devido ao atingir o limiar OKR e não para diminuir atenção. Há também uma variação de tensão significativa em relação a função visual do laboratório ratos e ratazanas^43,44. A acuidade visual do roedor, portanto, devem ser avaliada antes que eles são testados e algumas estirpes, tais como ratos SJL, podem não ser adequados para medições de OKR, como eles são homozigotos para o alelo Pde6brd1 (degeneração da retina 1).

Em resumo, o exame da morfologia da retina e função visual em modelos animais permite investigações não-invasivo, longitudinais de danos estruturais e funcionais que ocorrem no contexto da EAE e pode ser útil em outros modelos envolvendo o visual sistema, incluindo mas não limitado aos modelos de retinopatias ou lesão do nervo óptico.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.10.0
blue 25D non-contact  lens	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	lens for rodent mesurement
OptoMotry	CerebralMechanics Inc., Canada	N/A	system for visual function analysis
OptoMorty HD software	CerebralMechanics Inc., Canada	N/A	Version 2.1.0
Inhalation Anesthetic Isoflurane	Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA	803250	inhalation anesthetic
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5%	University Hospital Düsseldorf, Germany	N/A	pupillary dilation
Visc-Ophtal	Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany	58407	ophthalmologic eye gel
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software, Version 5.00
IBM SPSS Statistics	IBM Corporation, Armonk, New York, USA	N/A	statistical analysis software, Version 20