Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Resumo

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Resumo

A herança de receptores pre-rearranjados da pilha de t (tcrs) e de seu rejuvenescimento epigenéticas faz a pilha de haste pluripotente induzida (IPSC)-pilhas de t derivadas uma fonte prometedora para a terapia adotiva da pilha de t (ato). Entretanto, os métodos in vitro clássicos para produzir pilhas de T regeneradas do iPSC resultam em pilhas de T innate-like ou terminalmente diferenciadas, que são fenotipicamente e funcionalmente distintas das pilhas de T ingênuas. Recentemente, um romance tridimensional (3D) sistema de cultura Thymic foi desenvolvido para gerar um subconjunto homogêneo de células T antígeno-específicas de CD8αβ⁺ com um fenótipo funcional t cell-like ingênuo, incluindo a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral in vivo. Este protocolo evita os destinos desenvolventes aberrantes, permitindo a geração de pilhas de T clìnica relevantes iPSC-derivadas, designadas como emigrantes Thymic iPSC-derivados (iTE), ao igualmente fornecer uma ferramenta potente para elucidar as funções subseqüentes necessárias para a maturação da célula T após a seleção Thymic.

Introdução

A terapia de célula T adoptiva (ACT) pode ser um tratamento eficaz para alguns pacientes com câncer avançado. Infelizmente, muitos pacientes não experimentam a regressão do tumor, e as pilhas transferidas deixam de persistir após a infusão. Isto pode ser devido à qualidade das células T infundidas. Um modelo de mouse do ACT mostrou que, comparado a células T de memória central ingênuas ou menos diferenciadas, as células efetoras terminalmente diferenciadas são menos potentes devido à persistência do pobre in vivo¹, uma observação também apoiada por dados clínicos^2, a ³.

Em um esforço para melhorar a eficácia do ato atual, células-tronco pluripotentes induzidas por células t (t-IPSC) têm sido estudadas extensivamente^4,5. Quando as células T são reprogramadas em T-iPSC e re-diferenciadas em células T, a configuração reorganizada de genes TCR é herdada por T-iPSC, e subsequentemente as células T re-diferenciadas. Conseqüentemente, a capacidade de T-iPSC de submeter-se à expansão in vitro ilimitada permite a reprodução eficiente de pilhas de T imaturas que carreg os receptores de célula T neoantigen-específicos (TCR) quando tais pilhas são projetadas das pilhas de T antígeno-específicas 6 do tumor ^,7. Entretanto, o método preciso para a diferenciação de T-iPSC em pilhas de T maduras, que permitisse a produção de pilhas de T antígeno-específicas do cancro com um phenotype menos diferenciado e uma melhor potência antitumoral, remanesce ser elucidado.

A diferenciação t-IPSC empregando a cocultura de células estromais OP9 murinas que expressam o ligante de entalhe humano DLL1 é um método bem estabelecido para produzir células T in vitro^6,7. Em camundongos e humanos, esse sistema de cocultura pode diferenciar consistentemente o IPSC, recapitulando, assim, eventos de desenvolvimento do estágio blastocisto até a fase de linhagem de células T imaturos^6,7. Apesar desses avanços biotecnológicos, a diferenciação fisiológica após o estágio positivo duplo CD4⁺CD8⁺ (DP) ainda é difícil de alcançar. Uma das razões é que in vivo CD4⁺CD8^- e CD4^-CD8⁺ single positivo (SP) células t são gerados no Thymus, um órgão responsável pela maturação e seleção de células t que têm antígeno-especificidade estrangeira, mas Não auto-reactividade⁸. Esses processos seletivos são definidos como seleção positiva e negativa, respectivamente. No entanto, a maioria dos mecanismos moleculares necessários para amadurecer as células T no timo ainda não está totalmente compreendida, dificultando a reconstrução do processo in vitro. Na tentativa de superar esse obstáculo fisiológico, vários grupos estimularam o complexo TCR usando anticorpos anti-CD3 ou peptídeos agonistas. Estas técnicas in vitro geram produtos celulares que expressam marcadores de células T-chave, como CD3, CD8αβ, TCRαβ e CD62L, mantendo ainda a especificidade do antígeno tumoral. Infelizmente, as células T geradas por estes métodos extrathymic constituem uma população heterogénea larga das pilhas caracterizadas pela seleção positiva incompleta, innate-como características, matança não específica de TCR, incapacidade para a formação da memória, e efeitos antitumorais não persistentes in vivo^8,9,10,11. Estas anomalias levantaram as preocupações que tais pilhas puderam provocar uma variedade de efeitos secundários, incluindo o Lymphoma e as anomalias da pele e do osso, se usado para aplicações terapêuticas^12,13,14 .

Para recriar os sinais fisiológicos que faltam nos sistemas de diferenciação in vitro atuais, T-iPSC antígeno-específico do tumor foi diferenciado usando um Thymus colhido. O sistema fetal clássico da cultura do órgão do timo (ftoc), que foi projetado estudar o desenvolvimento intrathymic de pilhas de t, foi melhorado usando um sistema da cultura 3D que produziria com sucesso as pilhas de t que completaram a instrução Thymic. Estas pilhas de T borne-Thymic, que foram designadas como emigrantes Thymic iPSC-derivados (iTE), exibiram Propriedades ingênuas-como¹⁵. a iTE mostrou a proliferação, a formação da memória, e os efeitos antitumorais adequados em um modelo do rato de encontro aos tumores estabelecidos da melanoma B16. Este artigo descreve detalhadamente o protocolo deste novo sistema FTOC utilizando um sistema de cultura 3D (Figura 1).

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidado animal e uso do Instituto Nacional do câncer (NCI) e realizados de acordo com as diretrizes da NIH.

1. preparação de células OP9/DLL1 para co-cultura com iPSC

1. Cultura OP9/DLL1 células em meios OP9 (α-meio essencial mínimo [α-MEM] + 20% não-calor inativado soro bovino fetal [FBS] + 1x penicilina-estreptomicina + ácido ascórbico [50 ng/mL] e mono-tioglicerol [100 nM]) a 37 ° c. Quando as células OP9/DLL1 atingem 80 – 95% de confluência, lavar uma vez com 1x magnésio, cálcio, e fenol vermelho fosfato livre tampão salina (doravante referido como PBS).
2. Adicionar 4 mL de 0, 5% de tripsina e incubar por 5 min a 37 ° c. Em seguida, adicione 4 mL de mídia OP9, dissociar a camada celular por pipetagem para fazer uma única suspensão celular.
3. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° c, aspirar o sobrenadante e ressuscite em 12 mL de meios de OP9.
4. Placa 2 mL de suspensão celular OP9/DLL1 em um novo prato de Petri de 10 cm de cultura celular e adicione 8 mL adicionais de mídia OP9. Repita a passagem a cada 2 – 3 dias.
   Nota: A qualidade das condições de FBS e cultura é fundamental para manter a expansão das células OP9/DLL1 sem perder sua capacidade de suportar a diferenciação do iPSC. Portanto, recomenda-se pré-avaliar o lote de FBS e passagem consistentemente em 80% confluência para evitar a diferenciação celular e senescência. Também é importante fazer estoque congelado suficiente de células OP9/DLL1 e descongelar um novo estoque a cada 4 – 6 semanas.

2. diferenciação in vitro de iPSC em células T imaturas

1. No dia 0, comece a cocultura do iPSC em OP9/DLL1 pratos confluentes.
   1. Colher IPSC como uma única suspensão de células por tripsinização (5 min em 0, 5% tripsina a 37 ° c), recolher as células, e centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 ° c.
   2. Aspirar o sobrenadante e ressuscite células em 1,0 x 10⁵ IPSC por 10 ml de mídia OP9. Placa 1,0 x 10⁵ IPSC para um prato CONFLUENTE OP9/DLL1 10 cm.
      Nota: OP9/DLL1 10 cm pratos são usados para diferenciação iPSC quando atingem 90 – 100% confluência. As diferenças na confluência podem afetar a eficiência da diferenciação do iPSC.
2. No dia 3, aspirar mídia antiga e substituir com 10 mL de mídia OP9 fresco.
3. No dia 6, células de passagem.
   1. Lave cada prato confluente de 10 cm OP9 com 10 mL de PBS. Adicionar 3 mL de 0, 5% de tripsina por prato e incubar por 3 – 5 min à temperatura ambiente (RT).
   2. Adicione 4 mL de mídia OP9 e colete células por pipetagem suave. Passar as células através de um filtro de células de 100 μm e centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
   3. Reressuscite as células em 10 ml de meios de diferenciação (OP9 Media com 5 ng/ml mouse Flt3 ligante [FLT3L] e 5 ng/ml mouse Il-7) e placa de suspensão de células para um novo 10 cm OP9/DLL1 prato confluente.
4. No dia 9, aspirar a mídia antiga e substituir com 10 mL de mídia de diferenciação fresca.
5. No dia 11, quando os cardiomiócitos são observados em colônias de iPSC, separar mecanicamente células não aderentes por pipetagem e filtrar através de um filtro de células de 100 μm. Girar a 300 x g por 5 min a 4 ° c.
   1. Aspirar o sobrenadante e ressuscite em 24 mL de meios de diferenciação. Placa iPSC em uma placa OP9/DLL1 6-well confluente (4 mL/poço).
6. No dia 15, colete todas as células não aderentes e filtre através de um filtro de células de 40 μm.
   1. Girar a 300 x g por 5 min a 4 ° c.
   2. Continue a passar as células não aderentes a cada 3 – 4 dias, repetindo o passo 2.5.1.

3.3D cultura de órgãos tímicos para gerar iTE

1. Lobos Thymic fetal do rato da colheita e implante de linfócitos endógenos pelo tratamento do Desoxiguanosina (dguo) como descrito previamente¹⁶.
2. No dia 7 do tratamento dGUO, tome quatro novos pratos de 10 cm e encha cada um com 20 mL de mídia completa (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamina + 1x piruvato de sódio + 1x meio essencial mínimo com aminoácidos não essenciais (MEM-NEAA) + 1x penicilina-estreptomicina + [1:1000] etanol 2-mercapto).
3. Transfira todas as membranas de nitrocelulose com lóbulos tímicos em prato de 1 10 cm. Separe os lóbulos individuais da membrana com fórceps, permitindo que eles sejam submergidos em meios de comunicação. Descarte as membranas. Incubar por 1 h em RT.
4. Transfira os lóbulos tímicos para um novo prato de 10 cm com mídia completa e incubar por 1 h em RT. Repita este passo mais 2 vezes.
5. Usando fórceps, fixe os lóbulos tímicos ao prato (um de cada vez), e com a outra mão faça uma incisão profunda de 100 – 200 μm no centro e estendendo a metade do diâmetro do lóbulo para facilitar a migração do progenitor de célula T no lóbulo.
6. Transfira os lóbulos tímicos para um novo prato de 10 cm preenchido com meios de diferenciação completos (mídia completa + 5 ng/mL mouse IL-7 + 5 ng/mL mouse FLT3L + 5 ng/mL SCF).
7. Opcionalmente, se usando placas de cultura 3D com grades de nível inferior e superior, preencha ambas as grades com PBS estéril para evitar a evaporação e secagem das gotas penduradas.
8. Transfira 30 μL de mídia completa contendo um lóbulo tímico tratado com dGuo da etapa 3,6 em cada poço da placa de cultura 3D.
9. Colete células t de linhagem não aderentes (células T imaturas derivadas de iPSC) da cocultura OP9/DLL1 (dias 16-21) (etapa 2.6.2) e ressuscite em células de linhagem 2 – 5 x 10³ T por meio de 20 μL de mídia.
10. Adicione 20 μL de suspensão de células de linhagem T a cada lobo tímico na placa de cultura 3D. Incubar durante a noite a 37 ° c com 5% CO_2.
11. Defina o Pipet P200 para 30 μL e aspirar a mídia após a pipetagem várias vezes de cada poço para remover todas as células que cercam os lóbulos tímicos. Descarte a mídia e adicione 30 μL de mídia completa. Repita este procedimento 5 – 7 vezes para remover quaisquer células T imaturos extra que não migram para os lóbulos. Altere 25 – 30 μL de mídia diariamente depois disso.
12. Confirme a formação de um halo de emigrantes Thymic derivados de iPSC (iTE) em torno dos lóbulos que começam no dia 4 – 5 pela microscopia de luz.
13. Colete a iTE diariamente por meio de pipetagem sem interrupção do lobo. Mude a mídia todos os dias e continue a coleta até aproximadamente 12 dias.
14. A iTE colhida está pronta para ser usada para análises moleculares (figura2, figura 3, figura 4e Figura 5) ou experimentos de transplante in vivo.

4. preparação de células apresentadoras do antígeno (APC)

1. Sacrifique um rato C57BL/6 pela deslocação cervical e coloc em uma esteira do soaker do laboratório como descrita acima.
2. Retire o baço e coloque-o sobre um filtro de células de 100 μm. Comprima o baço no filtro usando um êmbolo de seringa de 12 mL para fazer uma suspensão de uma única célula.
3. Transfira a suspensão da pilha através de um filtro estéril da pilha de 40 μm. Centrifugue a suspensão em 300 x g por 5 min a 4 ° c para pellet as células.
4. Aspirar o sobrenadante e ressuscigar a pelota da pilha em 2 mL do tampão do lysis do amônia-cloreto-potássio (ACK) para excluir glóbulos vermelhos (RBC). Incubar por 5 min em RT.
5. Saciar o tampão de Lise ACK adicionando 10 mL de PBS. Pellet as células por centrifugação em 300 x g por 5 min a 4 ° c.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuscite a pelota da pilha em 10 mL de meios completos e transferência a um prato de Petri estéril de 10 cm.
7. Irradiar esplócitos com 3500 RAD usando um dispositivo de irradiação (γ-radiação) para evitar a proliferação celular.
8. Retorne imediatamente as pilhas irradiadas a uma incubadora e a uma cultura de 37 ° c durante a noite.
9. Use células irradiadas como APC ou congelar no banqueiro celular.

5. pulsando APC com antígeno

1. Conte o APC irradiado vivo usando um hemocitômetro de Neubauer e um corante azul do Tripan. Incubar APC com peptídeos (hgp100) ou nucleoproteínas durante 30 min a 37 ° c.
2. Lave o APC duas vezes com 10 mL de PBS para remover qualquer peptídeo extra.
3. Conte a iTE e misture com o APC em uma relação 1:1 em meios completos com 100 IU IL-2 e 5 ng/mL IL-7. Alíquota 100 μL da mistura de células (concentração total: 1 x 10⁶ células/ml) em cada poço de um acessório ultra baixo U inferior 96 placa de poço e cultura para 48 h em 37 ° c.
4. Após 48 h, transfira pilhas a uma placa nova usando uma pipeta e uma passagem multicanal cada 2 – 3 dias depois disso.
5. No 3º dia, analisar o perfil de secreção de citocinas por coloração das células com anticorpo intracelular e analisar por citometria de fluxo (Figura 3).
   1. Adicionar 0,67 μL/mL de inibidor de transporte proteico (por exemplo, GolgiStop) e incubar a 37 ° c durante 6 h para aumentar o acúmulo intracelular de citocinas. Lave com 10 mL de PBS.
   2. Reressuscita as células em 3 mL de PBS frio (4 ° c) e adiciona lentamente 1 mL de solução de paraformaldeído frio a 4% (PFA).
   3. Após 10 min, gire para baixo as células em 300 x g por 5 min a 4 ° c, descarte o sobrenadante e lave com 10 ml de PBS.
   4. Reressuscitem as células em 1 mL de PBS + 1% de FBS + 0,1% de surfactante não iônico e coloque em 4 ° c por 10 – 15 min.
   5. Adicione anticorpos, proteja amostras da luz e coloc em 4 ° c por 30 minutos.
   6. Gire as células a 300 x g por 5 min a 4 ° c, descarte o sobrenadante e lave com 10 ml de PBS.
   7. Gire para baixo as pilhas em 300 x g para 5 minutos em 4 ° c e as pilhas do Ressuspender em 1 ml de PBS. As células estão prontas para serem analisadas em um citometro de fluxo.

Resultados

Os thymuses fetal co-cultivados foram seccionados para analisar se as pilhas iPSC-derivadas da linhagem de T podem migrar nos lóbulos Thymic. Os lóbulos do controle unseeded tiveram uma arquitetura do tecido caracterizada por um astrocyte-como o Web epithelial Thymic¹⁷, implantado de pilhas CD3⁺ endógenas. Por outro lado, lóbulos tímicos semeados com células T imaturas derivadas de iPSC foram repovoadas com células mononucleares CD3⁺ , indicando a migração de células t imaturas derivadas de IPSC para os lóbulos (Figura 2a).

Células T que migraram e amadureciam dentro do microambiente tímico subsequentemente egressos como iTE. Para testar sua caracterização fenotípica, a análise cytometric do do fluxo de C57BL6 thymocytes, pmel IPSC-pilhas de T imaturas derivadas (extrathymic), e as pilhas que egressos dos lóbulos Thymic (iTE) foram executadas. As pilhas de T de extrathymic em OP9/DLL1 mostraram pilhas de t de CD4⁺CD8⁺ (DP) e pilhas de t CD8αSP sem expressão do marcador positivo MHC-i da seleção, visto que o iTE teve uma população desobstruída do phenotype da pilha de CD8αSP MHC-i⁺ t, indicando seus passagem bem sucedida através da seleção positiva antes de egressing dos lóbulos Thymic. iTE consistentemente expressa MHC-I e CD62L, que são marcadores associados à alta competência proliferativa, produção de citocinas, sobrevida periférica e homing linfóide^18,19,20. Este phenotype é consistente com os timócitos do SP de m2 que são a população a mais madura de únicas pilhas de T positivas no timo²⁰, que sugere que o iTE transição através de um programa desenvolvente Thymic normal (Figura 3). Para monitorar a eficiência da geração do iTE, as pilhas que tinham egressos dos lóbulos Thymic individuais foram isoladas. No 7º dia, os lóbulos tímicos geraram uma média de 1 x 10³ CD8SP ao vivo CD-7^{+ CD3 +} iTE por dia (Figura 3B). Uma taxa similar de produção de iTE é observada do dia 6 ao dia 12 da cocultura 3D Thymic.

A ativação e o secretion antígeno-dependentes dos citocinas foram analisados para observar as propriedades funcionais de pilhas de T imaturas thymically educadas IPSC-derivadas. Na presença de um peptídeo irrelevante (nucleoproteína), a Pmel-iTE não liberou quantidades significativas de TNF-α, IL-2 ou IFN-γ. Quando estimulado com o peptídeo cognato para as células T de Pmel (hgp100), a Pmel-iTE lançou quantidades robustas de TNF-α e IL-2, ao mesmo tempo em que também produz baixas quantidades de IFN-γ (Figura 4), indicando que a iTE com formação thymicamente pode reconhecer seu peptídeo cognato e secretam citocinas efetoras com um perfil que assemelha-se àquele de emigrantes Thymic recentes naturais (RTE).

Para examinar as diferenças transcricional entre as células de linhagem T derivadas de iPSC diferenciadas em OP9/DLL1 com ou sem educação tímica (i.e., iTE versus células T extrathymic), a análise de RNA-Seq foi realizada nessas duas populações e comparada ao de células de linhagem DP T diferenciadas usando OP9/DLL1 (DP) e células T de CD8⁺ pmel primárias ingênuas. A expressão de 102 genes que desempenham papéis cruciais na Ontogenia de células T, ativação de anti-thymocyte e formação de memória foram analisados^15,20,21,22. Uma análise de componentes principais dessas quatro populações estudadas demonstrou que as células T de DP e CD8SP foram geradas de forma extratimicamente agrupadas, enquanto a iTE se aglomerou mais perto de células T ingênuas (Figura 5). Coletivamente, esses dados demonstram que a iTE tem um fenótipo mais próximo das células T ingênuas do que as células de linhagem T geradas por métodos extratimpicos.

Figura 1 : Visão geral esquemática da diferenciação de iPSC para iTE usando OP9/DLL1 e cultura Thymic 3D. O protocolo envolve três etapas distintas de diferenciação; (Esquerda) de células IPSC a células de linhagem HEMATOPOIÉTICAS em OP9/DLL1 (dia 0 a 6), (médio) de células de linhagem hematopoiéticas a células t IMATURAS em OP9/DLL1 com citocinas (dia 6 a 16 – 21) e (direita) de células t imaturas (dia 16 – 21) a iTE usando um sistema de cultura Thymic 3D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Immuno-Histochemistry de lóbulos Thymic semeado com as pilhas de T imaturas iPSC-derivadas. Parte superior: coloração de H & E de um lóbulo Thymic com e sem semeadura de pilhas de T imaturos iPSC-derivadas. Do segundo de cima para baixo: imagens confocais dos lóbulos seccionados manchados com DAPI (núcleo), CD3 (célula T), e mesclar. Barras de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3 : a mostra do iTE um phenotype borne-Thymic da pilha de T. (A) FACS análises de timocitos, células T extrathymic (sistema de COCULTURA OP9/DLL1) e pmel-iTE. As células ao vivo foram bloqueadas em CD45⁺congênicas. As populações CD8 SP foram analisadas para a expressão CD62L e MHC-I. (B) número médio de CD8SP CD de 2, 7ite produzida durante a noite por lobo 7 dias após a pré-semeadura. Os dados foram coletados em 12 experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 4 : iTE produzem várias citocinas por estimulação antígeno-específica. Análises FACS da produção intracelular de citocinas por iTE. a iTE foi cocultivada com APCs pré-carregada com peptídeo irrelevante (nucleoproteico) ou cognato (hgp100) por três dias. Os números mostrados nos quadrantes superiores direito indicam as porcentagens de iTE produzindo a citocina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 5 : A análise de todo-transcriptome revela uma mudança na expressão gênica de iTE em direção a uma ⁺ Programa de células T. Análise do componente do princípio (PCA) de dados do RNA-Seq do DP, do SP CD8 extrathymic, do iTE, e de pilhas T ingênuas. (Análise de 102 genes relacionados à diferenciação Thymic usando a base de dados pública GSE105110) ¹⁵. please estale aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Discussão

Usar T-iPSC para regenerar pilhas de T antígeno-específicas do tumor pode superar muitos dos obstáculos atuais de ACT gerando pilhas novas com persistência melhorada. Embora vários métodos que usam o sistema de cocultura OP9/DLL1 tenham sido relatados para gerar células CD8 SP⁶,^7,10,13 que expressam moléculas CD8 e tcrs antígeno-específicos do tumor, Gene global os testes padrões da expressão e a análise funcional mostram que estas pilhas CD8 extrathymically regeneradas do SP são diferentes das pilhas T ingênuas (Figura 4). Aqui, nós descrevemos um sistema Thymic da cultura 3D que possa gerar emigrantes Thymic IPSC-derivados (iTE) com fidelidade elevada e homogeneidade do T-IPSC murino. iTE assemelham-se a pilhas T ingênuas no teste padrão global da expressão de gene e na funcionalidade, tal como a formação da memória e in vivo anti-tumor efeito de encontro ao tumor estabelecido¹⁵.

O sistema clássico de FTOC é uma maneira de recapitular a seleção Thymic in vitro. Tem sido usado para estudar o desenvolvimento intratímico de timócitos²³, e há alguns relatos de ftoc sendo usado para gerar RTE²⁴. No entanto, o sistema FTOC tem várias limitações. Para lidar com a falta de oxigênio em uma cultura de órgãos artificiais, vários grupos usaram uma cultura semiseca baseada em membrana²³, ou sistemas de cultura de submersão de alta oxigênio²⁵. No entanto, nenhum método atual pode gerar constantemente uma população homogênea de células T pós-tímicas. Para superar as limitações do sistema FTOC clássico, projetamos um sistema de cultura Thymic 3D que fornece melhorias técnicas sobre os métodos convencionais¹⁵. Por exemplo, usando nosso método da cultura Thymic 3D, a troca máxima do oxigênio e a ausência de stress mecânico do superfície-lóbulo mantêm os lóbulos Thymic em um ambiente mais fisiológico. Adicionalmente, a cultura a longo prazo permite que as pilhas de T maduras saída naturalmente dos lóbulos Thymic. Finalmente, a observação em tempo real e a micromanipulação permitem a troca de mídia e uma coleção constante de iTE sem perturbar fisicamente os lóbulos tímicos. Assim, o método da cultura Thymic 3D fornece melhorias técnicas significativas assim como uma avenida para estudar T-pilhas ingênuas thymically selecionadas que não era previamente disponível.

Há diversos pontos chaves para a geração bem sucedida de iTE usando este sistema Thymic da cultura 3D. A qualidade das condições de FBS e cultura é fundamental para manter a expansão das células OP9/DLL1 sem perder sua capacidade de suportar a diferenciação do iPSC. Conseqüentemente, nós recomendamos a pre-avaliação do lote de FBS assim como consistentemente de em 80% confluência para impedir a diferenciação e a senescência da pilha. Adicionalmente, uma cultura OP9/DLL1 confluente é exigida para a diferenciação in vitro de IPSC em pilhas de T imaturas, porque as diferenças na confluência podem afetar sua eficiência. Finalmente, a idade embrionária de lóbulos tímicos é crucial para a geração de iTE. Recomendamos o uso de E 14,5-15,5 lóbulos tímicos.

Tal como com qualquer novo protocolo, este método tem limitações e está sujeito a melhorias. A técnica de cultura aqui apresentada gera aproximadamente 1000 iTE por lobo tímico por dia por um período de duas semanas. Aumento da geração de iTE pode ser possível com outras modificações, incluindo a otimização da concentração de oxigênio, volume de mídia e tipo de placa de cultura 3D. A adição ou remoção de citocinas, bem como alterações na concentração de citocina, também podem contribuir para a melhoria do rendimento de iTE.

Dado que o sistema de cultura Thymic 3D apresentado aqui pode gerar emigrantes Thymic em um sistema completamente ex vivo , esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de projetos de pesquisa imunológicos e adoptivos da transferência de pilha including, mas não limitado a T diferenciação de pilha, maturação borne-Thymic da pilha de T, e geração de pilhas de T antígeno-específicas do progenitor hematopoietic ou das pilhas de haste. Embora este método não seja diretamente aplicável a amostras humanas, a iTE e o sistema de cultura tímica 3D possuem grande potencial para elucidar os mecanismos moleculares de seleção positiva e negativa e podem facilitar a criação de um sistema de cultura que permita a geração de células T ingênuas de tipo antígeno-específicas clinicamente relevantes para ACT.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
2-deoxyguanosine	Sigma-Aldrich	312693-72-4
2-Mercaptoethanol (1,000x)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A8960
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific	R21001
FBS	Gemini	100-500
Flt-3 ligand	R&D Systems	427-FL
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
hgp100	Genscript	282077-1, KVPRNQDWL
Interleukin-2	R&D Systems	402-ML
Interleukin-7	R&D Systems	407-ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
MEM powder	Gibco	61100061
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
Nucleoprotein	Global Peptides	ASNENMETM
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A1113803
RPMI 1640	Gibco	11875093
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
Stem Cell Factor (SCF)	R&D Systems	455-MC
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant	STEMGENT	03-0011-100
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-062
Cell Culture Vessels and others
10 cm dish	Corning, Inc.	353003
12 mL Syringe	Covidien Monoject	22-652-090
6 well plate	Corning/Coster	3516
Cell strainer 100 μm	Fisher Scientific	22-363-549
Cell strainer 40 μm	Fisher Scientific	22-363-547
Forceps	DUMONT	0108-5PO
Lab soaker mat	Versi-Dry	Cat. EF2175CX 74018-00
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam)	Whatman	WHA7408004 ALDRICH
Perfecta3D Hanging Drop Plate	Sigma-Aldrich	HDP1096
U Bottom 96 well plate	Corning/Coster	3799
Experimental Cell lines
CD3-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
MEF-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)	ATCC	SCRC-1040; RRID:MGI:5007926
OP9/N-DLL1	Riken Bioresource center	Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220
Pmel-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
Experimental mouse models
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl	Charles River	Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564
C57BL/6N	NCI/Charles River	N/A
Pmel-1 mice	Overwijk et al.	J Exp Med 198(4):569-80
Antibodies
Anti-aTCR	Biolegend	109202; RRID:AB_313425
Anti-CD3	abcam	ab11089; RRID:AB_369097
Anti-CD4	BD Biosciences	553730; RRID:AB_395014
Anti-CD44	BD Biosciences	559250; RRID:AB_398661
Anti-CD45.1	BD Biosciences	553775; RRID:AB_395043
Anti-CD45.2	BD Biosciences	553772; RRID:AB_395041
Anti-CD62L	BD Biosciences	560516; RRID:AB_1645257
Anti-CD69	BD Biosciences	552879; RRID:AB_394508
Anti-CD8a	BD Biosciences	557959; RRID:AB_396959
Anti-CD8b	BD Biosciences	550798; RRID:AB_393887
Anti-H-2Kb	BD Biosciences	553570; RRID:AB_394928
Anti-IFN-g	BD Biosciences	557998; RRID:AB_396979
Anti-IL-2	BD Biosciences	554428; RRID:AB_395386
Anti-TCRb	Thermo Fisher Scientific	35-5961-81; RRID:AB_469741
Anti-TCRVb13	BD Biosciences	553204; RRID:AB_394706
Anti-TNFa	BD Biosciences	557644; RRID:AB_396761