Extração e análise de própolis verde de Taiwan

Resumo

Apresentamos um protocolo para usar etanol como solvente para extrair e caracterizar taiwanesa própolis verde que apresenta atividade antibacteriana.

Resumo

Própolis verde taiwanesa é rico em flavonoides, composição e apresenta uma ampla gama de atividades biológicas, tais como antioxidante, antibacteriano e uns anticâncer. Os compostos bioativos da própolis verde taiwanesa são propolins, ou seja, C, D, F e G. A concentração de propolins em Taiwan própolis verde varia de acordo com a época e a localização geográfica. Assim, é fundamental estabelecer um procedimento padrão e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. Aqui, apresentamos um protocolo que usa etanol extração, cromatografia líquida de alto desempenho e uma análise da atividade antibacteriana para caracterizar a qualidade da própolis verde taiwanesa. Esse método indica que as extrações de etanol 95% e 99,5% alcançar o rendimento máximo de matéria seca de própolis verde taiwanesa, produzindo, assim, as concentrações mais elevadas de propolins que têm propriedades antibacterianas. De acordo com esses achados, o presente protocolo é considerado confiável e reproduzível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa.

Introdução

Própolis é uma mistura de resina natural produzida pela espécie de abelha Apis mellifera. A própolis tem sido amplamente utilizada desde os tempos antigos em medicamentos de folk. Recentemente, um estudo relatou que a Própolis é benéfico para a prevenção de infecções microbianas e inflamação¹. Numerosos estudos têm demonstrado que os principais compostos bioativos na própolis são ésteres de ácidos fenólicos, flavonoides, composição p-cumarínico ácidos e ácidos de diterpenic^2,3. Até à data, foram identificados 10 derivados de flavanone composição da própolis verde taiwanesa através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)^4,5,6,7. O mais abundante entre estes é propolins C, D, F e G^5,7. Os efeitos biológicos consideráveis da própolis verde taiwaneses estão correlacionados com seu alto teor de propolins⁸.

As concentrações de compostos bioativos em Própolis variam muito, dependendo da época e a localização geográfica do que a Própolis é obtida. Própolis Europeu contém principalmente os flavonoides agliconas e fenólicos ácidos⁹. Os principais compostos bioativos em Própolis do Brasil são de composição p-cumarínico ácidos, tais como o artepillin C¹⁰. Um estudo demonstrou que a temporada é um fator crítico na determinação do teor total de propolin em Taiwan própolis verde¹¹. O conteúdo de propolin em Taiwan própolis verde é mais alto no verão (maio - julho) e menor no inverno¹¹. A propriedade anti-bacteriana da própolis tem sido amplamente considerada como um indicador de atividade biológica. Geralmente, as amostras de Própolis coletadas de várias regiões têm exibiu uma propriedade antibacteriana semelhante; por exemplo, é geralmente eficaz contra quase todas as bactérias gram-positivas e exibe um efeito antibacteriano limitado contra bactérias Gram-negativas^10,12,13. Interações sinérgicas entre os flavonoides na Própolis foram demonstradas para ter um efeito antibacteriano¹⁴. Da mesma forma, própolis verde taiwanesa foi relatado para ter um efeito antimicrobiano contra bactérias gram-positivas,¹⁵. Além disso, um estudo identificou também um efeito antimicrobiano de interações de propolins em Taiwan própolis verde⁸.

A caracterização dos compostos bioativos na Própolis é difícil porque sua composição química pode variar de acordo com sua fonte de origem. Portanto, é necessário estabelecer um método viável e repetível para determinação da qualidade da própolis verde taiwanesa. No entanto, nenhum procedimento padrão foi estabelecido para extração de própolis verde taiwanesa e posterior análise funcional. Foram propostos vários métodos que vària aplicam solventes orgânicos e inorgânicos por Própolis extração^{16,17,18,19,20}. Porque a Própolis é uma mistura lipofílica, estudos têm demonstrado que extração orgânica é melhor do que a extração inorgânicos^8,18,19. A concentração total de propolin em Taiwan própolis verde e suas propriedades antibacterianas são indicadores da qualidade da própolis verde taiwanesa. Assim, o objetivo deste estudo é apresentar um protocolo para usando o etanol como solvente para extrair e caracterizar as propriedades antibacterianas da própolis verde taiwanesa.

Protocolo

1. preparação de compostos extraídos de etanol

1. Pesar 10 g de própolis verde taiwanesa congelado, que foi recolhida de colmeias em Taiwan, de maio a julho, e triturá-lo usando o moedor de especiarias. Confirme que pedaços inteiros da própolis verde de Taiwan são moídas em um pó fino sem quaisquer partículas grandes.
2. Adicione 100 mL de diferentes concentrações de etanol (60%, 70%, 80%, 95% e 99,5%) e água para separar os frascos e misturar cada concentração com 10 g de própolis de chão.
3. Incubar a 25 ° C e agitar o frasco a 250 rpm por 48 h.
4. Filtre os extratos de etanol por papel de filtro com um tamanho de poro de 25 μm.
5. Reconstitua os filtrados para seu volume original (100 mL) com etanol a 95% usando um balão volumétrico.
6. Armazenar os extratos de etanol a-20 ° C.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. preparação dos extratos de etanol para HPLC

1. Concentre-se 10 mL de etanol extractos por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.
2. Asse a matéria seca a 45 ° C por 24 h.
3. Reconstitua a matéria seca com 10 mL de etanol a 95%.
4. Filtro de 1 mL de etanol extrai usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poro de 0,45 µm.
5. Filtrar novamente os extratos de etanol usando um filtro de seringa estéril com um tamanho de poros de 0,22 µm. O filtrado é coletado e pode ser analisado diretamente usando HPLC.

3. análise de conteúdo Propolin usando HPLC

1. Estabelecimento de curvas padrão de propolins
   1. Prepare 1 L de fase móvel de solução de metanol: água 88.8:11.2 (v/v).
   2. Preparar diluições em série de propolin padrão concentrações (C, D, F e G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL e 125 mg/mL, respectivamente) usando a solução de fase móvel como solvente.
   3. Injete 20 µ l de propolin concentrações padrão na coluna de fase reversa, sequencialmente, resultantes da concentração baixa para a alta concentração.
   4. Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.
   5. Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.
   6. Analisar os padrões de pelo menos 3 x.
   7. Plotar a resposta de medição (eixo y) contra a (eixo x) concentração usando cálculo folha software e criar uma curva padrão com a equação e o valor de R-quadrado.
2. Análise de extrato em etanol s
   1. Injete 20 µ l de etanol extratos obtidos da etapa 2.5 na coluna de fase reversa.
   2. Defina a coluna HPLC a 30 ° C e a taxa de fluxo de 1 mL/min.
   3. Definir o comprimento de onda do detector UV para 280 nm e o tempo de gravador para 20 min.
   4. Analisar os padrões de pelo menos 3 x.
   5. Calcule a concentração de propolin no extrato etanol, usando a equação para a curva padrão obtida passo 3.1.7 que usa a área do pico para cada propolin.

4. mínima concentração inibitória mínima análise concentração bactericida

Nota: O método de como é usado para avaliar a eficácia antibacteriana de propolins etanol-extraído da própolis verde taiwanesa.

1. Preparação de organismos de teste
   1. Descongelar as cepas bacterianas, Staphylococcus aureus e Escherichia coli e em seguida, a cultura-los em caldo tryptic soy e caldo nutriente, respectivamente, a 37 ° C por 24 h.
   2. Passagem do S. aureus usando caldo tryptic soy e Escherichia coli usando caldo nutriente para duas gerações e, em seguida, calcular unidades formadoras de colônia por contagem de colónias individuais em uma placa de ágar.
2. Preparação de etanol extratos para testes de atividade antibacteriana
   1. Concentre-se os extratos de etanol obtidos passo 1.5 por evaporação a vácuo a 40 ° C por 15 min.
   2. Reconstituir a matéria seca com dimetilsulfóxido (DMSO) e ajustar a concentração do extrato de 12,8 mg/mL.
   3. Fazer uma diluição serial (concentrações: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 e 640 µ g/mL) de etanol extrai usando o caldo.
3. Testes de concentração inibitória mínima
   1. Adicione 10 µ l de etanol diluído extratos desde 0.156 até 640.0 µ g/mL em uma placa de 96 poços.
   2. Usando caldo, ajustar o volume a 100 µ l e manter 5% DMSO em todas as diluições.
   3. Inocule a 100 µ l de cultura bacteriana (1 x 10⁶/mL) na placa de 96 poços.
   4. Inóculo de cultura contendo diferentes concentrações de etanol extrai a 37 ° C por 48 h.
   5. Analisar o crescimento bacteriano, de acordo com a turbidez e usando a densidade óptica (leitor de microplacas) em 590 nm para determinar a concentração inibitória mínima (CIM).
4. Concentração bactericida mínima testes de
   1. Semear 10 µ l de cultura líquida de cada poço de teste de MIC que não exibiu nenhum crescimento em uma placa de ágar.
   2. Incube a 37 ° C por 24 h.
   3. Determine a atividade bactericida, identificando a menor concentração que revelou não visível crescimento bacteriano. A concentração que elimina completamente o crescimento celular é considerada a concentração bacteriana mínima (MBC).

Resultados

Positivos dados representativos para a extração de etanol são apresentados na tabela 1. O rendimento de matéria seca de própolis verde taiwanesa foi positivamente associado com a concentração de etanol. Os extratos de etanol 95% e 99,5% tinham matéria seca mais elevada rendimento de própolis verde de Taiwan. O rendimento de matéria seca mais baixo de própolis verde taiwanesa ocorreu quando a água foi usada como o solvente de extração. Estes resultados indica...

Discussão

Um estudo relatou que a maceração, utilizando diferentes concentrações de etanol, poderia ser usada para extração de Própolis brasileira¹⁷; no entanto, o processo foi demorado¹⁷. Demorou pelo menos 10 dias para extrair os compostos bioativos, tais como conteúdo fenólico, de Própolis brasileira¹⁷. Alternativamente, extração de etanol em combinação com aquecimento a 37 ° C, 50 ° C ou 70 ° C durante 30 min foi proposta para a extração...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215