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Resumo

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Resumo

Genes de virulência bacteriana frequentemente são regulados a nível transcricional por múltiplos fatores que respondem a sinais ambientais diferentes. Alguns fatores agem diretamente sobre os genes de virulência; outros controlam patogênese ajustando a expressão dos reguladores a jusante ou a acumulação de sinais que afetam a atividade do regulador. Enquanto o regulamento tem sido estudado extensivamente durante o crescimento em vitro , relativamente pouco se sabe sobre como a expressão gênica é ajustada durante a infecção. Tal informação é importante quando um produto do gene específico é um candidato para a intervenção terapêutica. Abordagens transcriptional como RT-PCR em tempo real, quantitativo e RNA-Seq são maneiras poderosas para examinar a expressão do gene em um nível global, mas sofrem muitos desafios técnicos, incluindo baixa abundância de RNA bacteriano comparado ao RNA do hospedeiro e amostra degradação por RNases. Avaliar o Regulamento usando repórteres fluorescentes é relativamente fácil e pode ser multiplexado com proteínas fluorescentes com propriedades espectrais únicas. O método permite a célula única, spatiotemporal análise de expressão gênica em tecidos que apresentam tridimensional arquitetura e physiochemical gradientes complexos que afetam redes de regulação bacterianas. Tais informações são perdidas quando dados são calculados sobre a população em massa. Aqui, descrevemos um método para quantificar a expressão gênica em patógenos bacterianos in situ. O método baseia-se no processamento do tecido simples e observação directa da fluorescência das proteínas de repórter. Vamos demonstrar a utilidade deste sistema, examinando a expressão de Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), cujo produto gênico é necessário para evasão imune e virulência completa ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp é fortemente expressos em abcessos renais e revelar expressão de gene heterogêneo devido em parte à aparente regulação espacial da atividade de promotor nuc em abcessos totalmente engajado com a resposta imune. O método pode ser aplicado a qualquer bactéria com um sistema genético manipulável e qualquer modelo de infecção, fornecendo informações valiosas para o desenvolvimento de drogas e estudos pré-clínicos.

Introdução

Bactérias respondem às novas condições fisiológicas e alterações no estado nutricional de seu ambiente expressando diferencialmente genes necessários para adaptação e sobrevivência. Por exemplo, patógenos oportunistas colonizam o corpo superfícies em relativamente baixa densidades e muitas vezes são inofensivos. No entanto, uma vez que a bactéria penetrou barreiras físicas e químicas, deve lidar com as Counter-defesas de célula imune do hospedeiro e disponibilidade de nutrientes restrita1. Por exemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente um terço da população assintomaticamente, mas é também a causa do devastador de pele e infecções de tecidos moles, osteomielite, endocardite e bacteriemia2. O sucesso de S. aureus como um patógeno é frequentemente atribuído à sua flexibilidade metabólica, bem como um arsenal de fatores de virulência associada a superfície e secretada que permitem que a bactéria escapar na corrente sanguínea e replicar em tecidos periféricos 3,4,5. Porque o anfitrião a morte devido à doença estafilocócica é um beco sem saída evolutivo e transmissão de limites a novos hospedeiros6, o compromisso com a produção de factor de virulência deve ser cuidadosamente controlado.

Uma complexa rede de regulação das proteínas e responde RNA não-codificante para uma variedade de estímulos ambientais, incluindo celular, densidade, fase de crescimento, fatores associados neutrófilos e disponibilidade de nutrientes, para garantir que os genes de virulência são expressos nas hora exacta e localização dentro do hospedeiro, tecidos7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, o sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS) regula a expressão de vários fatores de virulência através da quinase do sensor (PEA) e a resposta regulador (SaeR)14. Pea é autophosphorylated em um resíduo de histidina conservada em resposta a sinais (por exemplo,, humana neutrófilos peptídeos [HNPs], calprotectin) de acolhimento a8,15,16. O grupo de fosforilo é então transferido para um resíduos de aspartato na SaeR, ativando-o como uma proteína de ligação a DNA (SaeR ~ P)17. O TCS SaeR/S regula mais de 20 genes que contribuem para a patogênese incluindo fibronectina proteínas (FnBPs) e leucocidinas estafilococos coagulase14,18,19,20. Metas podem ser classificadas em alvos de alta afinidade e baixa afinidade do gene, que possam induzido como o nível de SaeR ~ P levanta-se quando exposto a suas sugestões21. A atividade de SaeR/S é controlada por outros reguladores da expressão gênica, como o sistema de sensoriamento de quórum Agr, repressor de proteína de toxinas (Rot) e a alternativa fator sigma B (SigB)22,23,24.

NUC é um gene de virulência Sae-dependente em Staphylococcus aureus e codifica thermonuclease (Nuc), que é essencial para escapar do neutrophilic extracellular traps (redes) e para divulgação durante o curso de infecção25,26. A expressão do nuc é também fortemente indiretamente reprimida pelo CodY na presença de aminoácidos de cadeia ramificada e GTP27e diretamente reprimida pela proteína estafilocócica regulador acessório SarA28,29 , cuja actividade é influenciada pelo oxigênio (estado de redox) e pH30. Dado que sae e nuc mutantes são atenuados em modelos do rato de infecção, há interesse em desenvolver intervenções químicas que inibem a sua correspondente atividades26,31. Apesar disso, não há nenhuma informação sobre sua regulação durante a infecção.

Repórteres fluorescentes tem sido usados para monitorar e quantificar a expressão do gene no nível da célula única. Neste documento, apresentamos um método para a quantificação dos S. aureus expressão gênica durante a infecção que, quando combinadas com in vitro transcriptome análise e poderosas técnicas de imagem como a ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), pode revelar como bacteriana fisiologia está regulamentada no vivo e a abundância relativa de nutrientes em determinados nichos. O método pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano com um sistema genético tractable.

Visão geral do vetor Integrativa do genoma.

O genoma Integrativa vector pRB4 contém 500 pares de bases cada das regiões a montante e a jusante do pseudogene do S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar o recombination homologous. pRB4 é derivado de backbone sensíveis à temperatura pMAD vetor contendo a gaveta de resistência de eritromicina (ermC) e beta-galactosidase thermostable gene bgaB para rastreio de azul/branco, recombinants32. A construção de engenharia repórter também contém um marcador de resistência de cloranfenicol (gato) para a seleção após a integração do genoma e eliminação do plasmídeo, bem como locais de EcoRI e SmaI para fundir a região reguladora de interesse para verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (Figura 1). É conhecido que a escolha do sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade do repórter e muitas vezes requer otimização empírica33. Assim, um RBS não é fornecido. Aqui, o sítio de ligação do ribossomo nativo é usado para fornecer um padrão mais natural da expressão do gene, mas outros sites podem ser utilizados.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Georgetown e institucional Cuidado Animal.

1. geração da estirpe repórter fluorescentes

  1. Digeri o vetor de pRB4 Integrativa do genoma sequencialmente com enzimas de restrição EcoRI e SmaI. Seguindo o protocolo do fabricante, configurar uma digestão durante a noite com SmaI usando 1 µ g de pRB4 a 25 ° C e então prosseguir com a segunda digestão durante 1h a 37 ° C, adicionando EcoRI, a mistura de reacção. Inactivar as enzimas incubando a 65 ° C por 20 min.
  2. PCR amplificar a região reguladora de interesse do DNA genômico (neste caso, um par de base ~ 350 fragmento de DNA contendo região promotora thermonuclease [nuc]), incorporando um local de restrição EcoRI 5' e um local de restrição de SmaI 3'. A sequência de reconhecimento SmaI deve ser em-frame com o códon de início translacional. Neste estudo, a PCR foi realizada utilizando um Polymerase do DNA de alta-fidelidade de acordo com as recomendações do fabricante com oRB015 para a frente da primeira demão (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') e inverter a cartilha oRB016 ( 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). A temperatura do recozimento foi de 53 ° C. Purifica o fragmento resultante usando um kit de limpeza PCR seguindo as instruções do fabricante.
  3. Digerir o produto resultante da PCR com EcoRI e SmaI como realizado no passo 1.1 e ligate o fragmento de DNA digerido nos mesmos sítios do pRB4 usando T4 DNA ligase conforme recomendado pelo fabricante para gerar a construção integrativa. Introduzir a mistura de ligadura em Escherichia coli e confirme a sequência de construção.
  4. Electroporate a construção para cepa S. aureus RN4220 conforme descrito anteriormente34. Em breve, usar 1 µ g de plasmídeo com 70 µ l de células competentes-electro (Ω 100, 25 µF e 2,3 kV) em caldo B2 (1% [w/v] hidrolisado de caseína, extrato de levedura 2,5% [w/v], 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0.5% [w/v] glicose). Seleccione a resistência de eritromicina (Emr) na temperatura permissiva (30 ° C) em ágar tryptic soja (TSA) suplementado com eritromicina (5 µ g mL-1) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µ g mL-1). As transformants resultantes são azuis devido a atividade de β-galactosidase plasmídeo-codificado.
    Nota: Transferência de DNA em isolados clínicos é extremamente difícil devido a uma forte restrição-modificação barreira35. Assim, RN4220 de S. aureus foi usado como um destinatário intermediário da construção de fusão porque é restrição deficiente e altamente transformável.
  5. Transferência do plasmídeo para S. aureus USA300 estirpe de interesse usando eletroporação ou transdução mediada por fago36 na temperatura permissiva. Em breve, propaga o bacteriófago de11 Φ partículas sobre a estirpe de doador utilizando placas TSA contendo 5 mM CaCl2 durante a noite a 30 ° C e em seguida esterilizar por filtração com filtros de seringa 0,45 µM de acetato de celulose. Use lysates para transduce cepa S. aureus LAC Emr.
    Nota: LAC é um isolado clínico amplamente utilizado que foi anteriormente feito Em sensível pela passagem serial em meio TSB para curar a estirpe do pUSA03 nativo do plasmídeo que confere Emr 37,38.
  6. Integre a construção por dois, eventos de recombinação homóloga sucessivas o cromossomo conforme descrito anteriormente,32. Os recombinantes são resistentes ao cloranfenicol (Cmr) em placas TSA contendo 5 μg mL-1 de cloranfenicol, eritromicina-sensíveis (Erms) e não mais azul.
    Nota: Quando possível, Re-Introduza a fusão marcada USA300 via transdução fago-negociada para evitar a acumulação de mutações associado a estirpe in-vitro passagem39 e temperatura turnos.

2. animais de infecção: Preparação do inóculo, infecção sistêmica e processamento de tecido

  1. Preparação do inóculo bacteriano
    1. Raia S. aureus estirpes de interesse para isolamento em placas de ágar sangue de um estoque de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C para 16 – 24 h confirmar hemolíticos fenótipos com base na sua capacidade de lisar células vermelhas do sangue (hemácias) e forma limpar zonas transparentes.
    2. Inicie culturas durante a noite por inocular colônias única de todas as estirpes de 4 mL de caldo tryptic soja (TSB) em tubos de vidro estéril. Gire os tubos a 37º C por 16-24 h em um rolo de tubo fixado em aproximadamente um ângulo de 70° e 70 rotações por minuto [RPM].
    3. Use um espectrofotômetro para medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) das culturas da etapa 2.1.2. Utilize o meio estéril como uma referência de óptica (em branco). Diluir essas células para um OD600 de 0,05 em 25 mL de estéril Tryptic Soy caldo (TSB) em separado, 125 mL DeLong frascos (frasco de 5:1 a relação do volume) e incubar as culturas em um banho de água (para transferência de calor adequada às culturas), agitando a 280 RPM e definir a 37 ° C.
      Nota: O crescimento do inóculo pode ser realizado de várias formas; é apresentado um método para o cultivo de células para fase exponencial. Independentemente disso, é importante usar consistentemente o mesmo método para preparar as células para inoculação.
    4. Em um OD de600 de ~ 1, re-dilua as células em meio fresco para uma partida de OD600 de 0,05 para garantir as células atingir fase exponencial e que fatores que se acumulam durante a incubação durante a noite tenham sido reduzidos para níveis de fase exponencial.
    5. Recolher as células durante a fase exponencial (OD600 ~0.6–0.8) por centrifugação a 3.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    6. Lave as pelotas duas vezes em volume equivalente de estéril 1 x fosfato salino (PBS, pH 7,4).
    7. Suspender as células em 1X PBS (pH 7,4) a uma concentração de 1 x 108 formadoras de unidades (CFUs) mL-1 , ou conforme apropriado para a desejada experiência.
      Nota: é importante determinar a relação entre OD600 e CFU mL-1 para cada microrganismo de interesse porque alterações de tensão-dependente do tamanho da célula e forma podem afetar as propriedades de espalhamento de luz e, finalmente, o dose de infecção.
  2. Preparação dos animais e infecção bacteriana
    1. ACCLIMATE ratos por 7 dias na dieta purificada AIN-93. A dieta é formulada para proporcionar uma nutrição adequada, reduzindo o tecido autofluorescência associada ao consumo de ingredientes à base de plantas usadas em mouse padrão chow40.
      Nota: Camundongos C57/BL6 fêmeas (6-8 semanas de idade) são usados aqui, mas a cepa de rato e o sexo vão depender do estudo.
    2. Antes da infecção, dilate as veias de rabo de rato com água morna.
    3. Infectar animais por injetar 100 µ l de inóculo bacteriano através de cauda-veias para produzir uma infecção sistêmica. Salvar uma parte alíquota do inóculo inicial se realizando citometria de fluxo (ver secção 4).
    4. Monitorar os animais diariamente e avaliar o seu estado de saúde usando um sistema de monitoramento, revisto e aprovado por de um cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.
    5. Permitir que a infecção ao progresso para a duração desejada. Aqui, as experiências são terminados 3 dias pós infecção.
      Nota: Nestas condições, abcessos consistem em uma comunidade de abscesso estafilocócica de bactérias, cercada por depósitos de fibrina e rodeado por camadas concêntricas de células do sistema imunológico5,41.
  3. Colheita de órgãos e processamento de tecido
    1. Eutanásia dos animais por inalação de CO2 e deslocamento cervical como um método secundário e realizar a necropsia.
    2. Colheita de rim (à direita) e outros órgãos vitais (pulmões, coração, fígado, baço) e transferir para tubos de polipropileno de 15 mL contendo formol a 10% [v/v] armazenados em buffer. Prosseguir com estes órgãos para a etapa 2.3.4 abaixo.
    3. Transfira o rim esquerdo para um tubo resistente ao impacto de estéril de 2 mL contendo ~ 500 µ l de grânulos de silicone de 2 mm e 1 mL estéril 1X PBS (pH 7,4). Prosseguir com este órgão para etapa 4.2.
    4. Permitir que os órgãos da etapa 2.3.2 corrigir no escuro à temperatura ambiente com agitação suave ou rotação pelo menos 24 horas, mas não mais de 48 horas.
    5. Incorporar os órgãos em tecido claro congelamento médio e armazenar os tecidos a-80 ° C.
    6. Usando um criostato, seção tecido em fatias de 10 µm de espessura.
    7. Seque as seções sobre uma lâmina de vidro previamente limpos, carregada por 20 min na escuridão, aplique meio de difícil montagem com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha e lamela. Curar os slides montados à temperatura ambiente durante a noite e transferir a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.

3. processamento de imagem e microscopia Confocal de varredura a laser

  1. Examine os slides montados para localizar lesões usando laser apropriado para o repórter fluorescente sendo usado. Neste caso, o verde (GFP), vermelho (tdTomato), e azul fluorescência (DAPI) sinais são usados.
  2. Adquirir a imagem usando o objetivo apropriado para a visualização de células individuais (por exemplo, normalmente x 20 ou 40 x de objectivos é usados).
  3. Medir as intensidades de fluorescência nas imagens confocal.
    1. Abra a imagem confocal em Image J e ajustar o brilho/contraste para visualizar corretamente o sinal de fluorescência da lesão.
    2. Definir a região de interesse e usando a opção de limiarização , definir os limites superior e inferior de fluorescência, se necessário.
    3. Definir o centroide selecionando área → valor médio cinza → centroide → limitar-se ao limite de na imagem J. guia Analyze
    4. Extraia o valor de intensidade de fluorescência de centroide ou medir a intensidade de fluorescência média em uma determinada lesão por unidade de área (fluorescência de média intensidade, IFM) para as boas práticas agrícolas e tdTomato. Aqui, utilizaram-se áreas de2 µm.
      Nota: Uma segunda análise cega minimiza o preconceito quando é conhecida a identidade da amostra.
    5. Plotar os dados e realizar as análises estatísticas adequadas para cada comparação.

4. fluxo Cytometry Analysis

  1. (Opcional) Determinar a atividade de fusão do inóculo no dia da infecção (da seção 2.2.3)
    1. A 899 µ l de 1X PBS estéril (pH 7,4) adicionar 100 µ l de cada inóculo e mancha de 1 µ l de ácido nucleico permeant de membrana (ver Tabela de materiais). Como um controle, certifique-se de incluir uma amostra sem mancha de ácido nucleico.
    2. Execute a citometria de fluxo em todas as amostras.
      Nota: Para a primeira experiência, é útil incluir um controle único vetor para a fusão de interesse para determinar a tensão adequada para usar. Uma clara separação entre amostras positivas e negativas é essencial para a análise dos dados, indicando o repórter é bem acima do sinal de fundo.
    3. Para identificar a população bacteriana, trama eventos usando ácido nucleico mancham (eixo y) e encaminhar a dispersão (eixo x).
    4. Desenhe uma porta de inclusão em torno de eventos que são ambos os ácidos nucleicos mancha positiva e o tamanho correto da bactéria baseada o forward scatter (entre 0,5 a 2,0 µm para S. aureus).
      Nota: Se rigoroso ao identificar esta população como é fundamental para incluir eventos que são claramente dentro destes parâmetros. Certifique-se de que este portal exclui todos os eventos para os controles negativos sob outras condições. Neste estudo, aproximadamente 70% da população celular conheceu esses requisitos em análise.
  2. Análise de amostras de tecido após o sacrifício:
    1. Eutanásia em animais, colher os rins esquerdos (consulte a etapa 2.3) e transferência em grânulo batendo tubos contendo 1 mL de 1X PBS estéril (pH 7,4) e 250 µ l de grânulos de borosilicato de 2 mm.
    2. Perturbar os tecidos para liberar as células bacterianas. Para os rins, use um homogeneizador para romper as células. Aqui, três 30 s rajadas a 6800 rpm com 1 min períodos no gelo molhado entre os ciclos de refrigeração foram usadas para minimizar o aquecimento de amostras.
    3. Pelota o restos de tecido maiores por centrifugação a 250 x g durante 3 min numa mesa microcentrifuga resfriado a 4 ° C.
      Nota: Normalmente, há um sedimento celular no fundo do tubo e uma camada de detritos flutuantes na parte superior. A camada aquosa média contém as células bacterianas.
    4. Transferência de 10 µ l da camada aquosa em um tubo de microcentrifuga limpa 1,5 mL contendo 1 µ l de ácido nucleico mancha em 989 µ l de PBS (total de volume de 1 mL).
    5. Execute a citometria de fluxo, usando os mesmos parâmetros de aquisição de dados e gating quanto os inóculos iniciais.
      Nota: Contagem de células bacterianas será muito baixa, porque a amostra contém principalmente restos de tecido. A opção de "Portão ao vivo" também pode ser usada se as células são mancha de ácido nucleico positiva e tamanho-dependentes quando dados são carregados no aplicativo. Isto também ajudará a analisar mais dos eventos alvo e reduzir o tamanho do arquivo. Quase 1 milhão de eventos por exemplo são contados, mas mais contagens de evento podem ser necessárias dependendo da gravidade da infecção e o tamanho do tecido analisado.
    6. Análise de dados: Determinar quer dizer intensidade fluorescente (IFM) para cada fluoróforo numa determinada amostra usando os portões de inclusão determinados no ponto 4.1.4. Normalize as amostras no software de análise de fluxo para contagens de evento. 10.000 contagens são geralmente suficientes na análise.
      Nota: Não é incomum encontrar amostras que contêm menos do que este número de eventos, já que este é dependente da gravidade de infecção e formação de abscesso. Usando essa abordagem, 500-40.000 eventos são normalmente encontrados em tecidos infectados.

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Resultados

Desenvolvemos um plasmídeo derivado pMAD32 que pode entregar qualquer repórter construção de fusão para o cromossomo por recombinação homóloga de cruzamento duplo (Figura 1). Esta construção permite a análise quantitativa de qualquer região reguladora que suporta a produção de proteína GFP e sinal fluorescente acima do fundo. O plasmídeo confere resistência ampicilina (Apr) para a manutenção e propagação...

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Discussão

Doenças infecciosas bacterianas são um crescente problema de saúde em todo o mundo devido à aquisição de resistência aos antibióticos determinantes46. Porque a adaptação a ambientes de host é essencial para o crescimento e sobrevivência durante a infecção, estratégias visando programas de expressão do gene que aumentam a aptidão do patógeno podem ser útil terapeuticamente. Um desses programas é o conjunto de genes controlados pelo sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS), mo...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Alexander Horswill Agradecemos o presente da fusão de tdTomato - PsarAP1e Karen Creswell para ajuda com análise de citometria de fluxo. Agradecemos também a Alyssa King para aconselhamento sobre análise estatística. Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH exploratório/Developmental Research Award (grant AI123708) e fundos de inicialização da faculdade para SRB. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e interpretação ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5% sheep bloodHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 MiceCharles RiverNA
ChloramphenicolSigma-AldrichC-0378
confocal laser scanning microscopeZeissNA
cryostat microtomeThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
ErythromycinSigma-AldrichE5389
Flow AnalyzerBecton DickinsonNA
glass beadsSigmaZ273627
Miniprep, plasmidPromegaA1220
orbital shaking water bathNew Brunswick InnovaNA
PCR purificationQIagen28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)Cellgrow46-013-CM
Plate readerTecanNA
Precellys 24 homogenizerBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Restriction EnzymesNew England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptaseNew England BioLabsE6300L
Sanger SequencingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero clear tissue freezing mediumMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus microscope slidesFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Syringe, FilterVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membrane permeant nucleic acid stain
TetracyclineSigma-AldrichT7660
Tryptic Soy BrothVWR90000-376
UV-visible spectrophotometerBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1500

Referências

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