Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a fisiopatologia da retinopatia diabética proliferativa usando tecidos derivados de paciente, cirurgicamente extirpado, fibrovasculares para cultura de tecido tridimensional nativa caracterização e ex vivo. Ex vivo modelo de cultura é também favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.

Resumo

Retinopatia diabética (DR) é a complicação microvascular mais comum de diabetes e uma das principais causas de cegueira em adultos de idade de trabalhar. Não atuais modelos animais de diabetes e retinopatia induzida pelo oxigênio desenvolvem as alterações progressivas de gama completa manifestadas na retinopatia diabética proliferativa humana (PDR). Portanto, a compreensão da patogênese da doença e fisiopatologia tem dependia em grande parte o uso de cortes histológicos e amostras de vítreos em abordagens que apenas fornecem informações de estado estacionário sobre os fatores patogênicos envolvidos. Aumentando a evidência indica que dinâmica célula-célula e célula-matriz (ECM) interações no contexto do microambiente que tridimensional (3D) são essenciais para os estudos mecanicistas e funcionais para o desenvolvimento de novos estratégias de tratamento. Portanto, formulamos a hipótese que o tecido patológico fibrovasculares cirurgicamente extirpado dos olhos com PDR poderia ser utilizado para confiantemente desvendar os mecanismos celulares e moleculares desta doença devastadora e testar o potencial para romance clínico intervenções. Nesse sentido, desenvolvemos um método inovador para 3D ex vivo cultura de excisada cirurgicamente paciente-derivado fibrovasculares tecido (FT), que servirá como um modelo relevante da fisiopatologia humana de PDR. Os FTs são dissecados em explantes e incorporados em matriz de fibrina para ex vivo cultura e 3D caracterização. Imunofluorescência de toda a montagem do FTs nativas e culturas de ponto de extremidade permite investigação completa da composição do tecido e processos multicelulares, destacando a importância da caracterização de tecido-nível 3D para descobrir as características relevantes de Fisiopatologia do PDR. Este modelo permite a avaliação simultânea dos mecanismos moleculares, celulares/tecido processos e respostas de tratamento no contexto complexo da dinâmicas interações bioquímicas e físicas dentro da arquitetura do tecido PDR e o microambiente. Desde que este modelo recapitula a fisiopatologia do PDR, também será favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.

Introdução

DR é uma complicação ocular grave de diabetes, uma doença que atingiu enormes proporções no últimos três décadas¹. Vinte anos após o diagnóstico, virtualmente todos os pacientes com diabetes tipo 1 e 60% dos pacientes com sinais presentes de tipo 2 diabetes de retinopatia, tornando diabetes por si só uma das principais causas de cegueira em adultos de idade²a trabalhar. De acordo com o nível de degeneração microvascular e danos isquêmicos, DR é classificada em RD não proliferativa (não-PDR) e DR proliferativa (PDR). A estágio final da doença, PDR, é caracterizada por neovascularização de isquemia e inflamação-induzida e fibróticas respostas do vitreoretinal interface. Em condições não tratadas, estes processos levará à cegueira devido à fibrose da retina, hemorragia vítrea, descolamento de retina tracional e de^3,de glaucoma neovascular⁴. Apesar dos avanços recentes, opções atuais do tratamento alvo apenas DR etapas, incluindo edema macular diabético e PDR, quando danos na retina tem já se seguiu. Além disso, uma grande proporção de pacientes do DR não beneficia do atual arsenal de tratamento, indicando uma necessidade urgente de melhoria terapias^4,5,6.

Vários outros eun vivo modelos doença/desenvolvimento e modelos animais diabéticos têm sido desenvolvidos até à data, mas nenhum deles recapitula a gama completa de características patológicas observadas em humanos PDR^7,8. Além disso, aumentando a evidência indica que respostas de tratamento estão firmemente conectadas para a composição de ECM, bem como o arranjo espacial e interação entre o microambiente celular e acelular⁹. Nós, portanto, para desenvolver um modelo clinicamente relevante de PDR humano, utilizando o material patológico FT que comumente é extirpado de olhos submetidos a vitrectomia como parte da gestão cirúrgica de PDR¹⁰.

Este manuscrito descreve o protocolo para o 3D ex vivo cultura e caracterização do PDR cirurgicamente extirpado paciente-derivado FT patológica. O método descrito aqui tem sido usado em uma recente publicação que demonstrou sucesso desconstrução da paisagem de tecido PDR 3D nativo e recapitulação das características da fisiopatologia PDR incluindo angiogênico e fibróticas respostas do anormal estruturas vasculares¹¹. Este modelo também revelou características inovadoras que não podem ser facilmente apreciadas de secções histológicas finas, tais como espacialmente confinado a apoptose e proliferação, bem como de formação vascular ilhéu¹¹. Fluido vítreo tem sido usado com sucesso por outros em culturas de esferoide endotelial 3D para avaliar seu potencial de angiogênico e a eficácia das moléculas de angiostatic¹². Quando combinado com um esferoide 3D linfática endothelial da pilha (LEC) em vitro brotando ensaio usando vítreo PDR como estimulante, nosso modelo revelou que a contribuição de ambos os vitreal solúvel fatores pistas, bem como locais dentro o tecido neovascular como ainda mal compreendidos LEC envolvimento no PDR fisiopatologia^3,11. Na gestão de PDR, vitreoretinal cirurgia é um procedimento rotineiramente realizado ainda mais desafiador. Como técnicas e instrumentações cirúrgicas estão vendo avanço contínuo e sofisticação, remoção oportuna e conservador do espécime proliferativa fibrovasculares não só melhora o resultado da visão, mas também fornece material de tecido inestimável para o investigação de respostas de fisiopatologia e tratamento de PDR nos aspectos complexos translacionais do microambiente tecido humano.

Protocolo

Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de revisão institucional e Comissão de ética do Hospital da Universidade de Helsínquia. Foi obtido o consentimento esclarecido assinado de cada paciente.

1. preparação de soluções, meios e equipamentos

1. Prepare os seguintes equipamentos anteriores à colheita dos tecidos fibrovasculares (FT) para assegurar o processamento rápido.
   1. Pinças de microdissection estéril-autoclave dois.
   2. Prepare 1 x tampão fosfato salino (PBS), dissolvendo 1 pré-pesados PBS comprimido (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO₄^-3) em 900 mL de água deionizada e mexa para dissolver. Ajuste o volume de água até 1 L e estéril-autoclave a solução pronta. Loja em RT.
   3. Junte-se a solução acima mencionada e equipamento em uma cesta, juntamente com um bisturi estéril de uso único, numa placa de cultura de célula estéril de 6 cm e 5 placas de cultura estéril 12-poços de célula.
2. Prepare um 6 mg/mL solução de fibrinogênio em novelos equilibrado sal solução (HBSS) dissolvendo-se 30 mg de fibrinogênio humano plasminogênio empobrecido em 5 mL de HBSS, usando um tubo de 50 mL, imergido em um banho-maria a 37 ° C, durante pelo menos 1 h.
   Nota: Esta solução pode ser mantida em banho-maria (37 ° C) para 7 h (máximo 10 h) antes do uso.
3. Preparar o ex vivo de meio de cultura com a adição de 5% de soro fetal bezerro (FCS) ou 5% de soro humano, suplemento de crescimento de células endoteliais de 0,4%, 10 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico, 1 μg/mL hidrocortisona e 50 μg/mL gentamicina para comercialmente disponível meio de crescimento de células endoteliais e manter em banho-maria a 37 ° C até o uso. Armazenar a 4 ° C por até um mês.

2. dissecção de tecidos fibrovasculares

1. Colete o tecido fibrovasculares (FT) que tem sido extirpado de seres humanos submetidos à cirurgia de vitreoretinal microincision trans-conjuntival, por 20 ou 23 calibre três portas pars plana vitrectomia como parte da gestão do vitreoretinal cirúrgica do PDR.
   Nota: O FT é extirpado usando segmentação e delaminação, cortar se necessário com micro-tesouras e removido da cavidade vítrea com um microfórceps, preensão do fim intra-ocular por cirurgião experiente do vitreoretinal. Extremo cuidado deve ser tomado para remover FT intacto, sem danos, sem causar danos às estruturas oculares, incluindo o nervo óptico ou arcada vascular temporal, onde o tecido neovascular patológico se encontra mais comumente. O tamanho do tecido excisado é variável, geralmente variando entre 3 e 50 mm².
2. Manter o FT em uma placa de cultura de células de 6 cm ou tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS estéril colocado no gelo molhado e transferir imediatamente para o laboratório para processamento de investigação.
   Nota: É essencial que a unidade de pesquisa (laboratórios) está fisicamente perto da sala de cirurgia do hospital (OR) minimizar os tempos de transferência do pequeno FT extirpado. Neste caso, a transferência leva menos de 5 minutos e os explantes são incorporadas dentro de fibrina normalmente em 1-1,5 h (máximo 2 h) após a remoção cirúrgica. O impacto de tempos de transferência mais na cultura 3D precisa ser testado.
3. Coloque o FT em um prato de cultura de células de 6 cm contendo 1 mL de PBS em temperatura ambiente (RT, 25 ° C) e adquirir imagens do tecido usando um microscópio de epifluorescência invertido com um objectivo de 5x.
   Nota: Imagens são adquiridas para documentação e avaliação qualitativa. Será possível observar o tamanho do tecido, densidade e composição geral (por exemplo, estruturas vasculares).
4. Corte o FT ~ 1 mm² peças sob um estereomicroscópio dissecação vertical, usando uma pinça estéril de bisturi e microdissection. Segure o tecido, bem submergido em PBS, utilizando uma pinça microdissection e realizar cortes claros usando um bisturi estéril. Evite rasgar FT, como isso iria alterar as estruturas nativas fibrovasculares.
5. Coloque cada pedaço individual em um poço de uma placa de cultura de células de 12 poços contendo 1 mL de PBS estéril.
   Nota: Se necessário, espalhe suavemente o FT na chapa, usando uma pinça microdissection, antes de realizar cortes.

3. carcaça gotas de Gel de fibrina na posição vertical para a caracterização da FT nativa e cultura Ex Vivo

1. Estéril-filtrar a solução de fibrinogênio pronto, preparada na etapa 1.2 com um filtro de 0,22 μm montada em uma seringa de 10 mL.
2. Prepare alíquotas da solução de fibrinogênio (25 μL por tubo de 1,5 mL) e mantenha em RT. Prepare uma alíquota para fibrina gel / cada pedaço FT obtidos após a dissecação, e um par de alíquotas extras para testar a fibrina formação de gel.
3. Prepare uma solução de HBSS contendo 4 unidades/mL de trombina e 400 μg/mL de aprotinina, chamado solução de outra vida TA e mantém na RT. Prepare tanto solução TA conforme necessário, dependendo do número de peças obtidas após a dissecação (25 μL de solução de TA é usado para cada Gel de FT/fibrin) e uma quantidade extra (por exemplo, 250 μL) para testar a formação de gel de fibrina e garantindo que a solução suficiente é disponível em toda a carcaça das gotas de gel de fibrina.
   Nota: A trombina é necessária para polimerização da fibrina, enquanto aprotinina é adicionada para prevenir a degradação da fibrina gel por proteases celulares expressados pelo FTs^13,14.
4. Testar o tempo de formação de gel de fibrina: Adicionar 25 μL de solução de TA para a solução de fibrinogênio 25 μL aliquotadas preparada no passo 3.2 e, com outra pipeta definida como 50 μL, misture o tubo pipetando e dispense em uma placa de cultura de célula de 6cm , formando uma gota na posição vertical.
   Nota: A formação de gel de fibrina deverá ter lugar em ~ 1 min. Se levar mais de 1,5 min, a concentração de trombina na solução TA preparada na etapa 3.3 pode ser aumentada pela adição de mais solução de trombina. Um décimo do volume da solução de trombina inicialmente usado podem ser adicionado, repetidamente, até a formação de gel de fibrina ocorre dentro de 1,5 min. O tempo de formação de gel de fibrina é crítico para a três dimensões da cultura, como gel de rápida formação (de 1,5 minutos) impede que a peça FT de afundar até o fundo do gel de fibrina e, assim, entrar em contato com a superfície de plástico 2D da célula placa de cultura, que pode levar à adesão celular 2D e consequência.
5. Pedaço FT um lugar no centro de um bem de uma placa de 24 usando uma pinça estéril e retire qualquer excesso PBS pipetando com uma pipeta de 0.5-10 μL para evitar a força de sucção sobre o FT. No caso o tecido mantém a pinça, usar uma pinça adicional para ajudar à colocar o pedaço de tecido sobre a placa.
   Nota: Géis FT/fibrina também podem ser convertidos em placa de 48 para reduzir o uso de reagentes. No entanto, isto é mais desafiador como o espaço é mais limitado e fibrina vai se espalhar-se em contacto com a parede bem.
6. Adicionar 25 μL de solução de TA para a solução de fibrinogênio 25 μL aliquotadas no passo 3.2, e com outra pipeta 50 μL mistura no tubo por pipetagem. Dispensa na parte FT colocado na placa de bem, e pipeta e descer 2 - 3 vezes a fim de incluir a peça FT dentro da gota vertical, fornecendo uma matriz circundante 3D para os pés.
   Nota: Certifique-se que a FT não é aspirado durante a pipetagem e que não há bolhas de ar são formadas. Certifique-se também que a mistura, dispensação e pipetagem são executadas rapidamente como o gel de fibrina se formará dentro de 1,5 min, como testado no passo 3.4. Se a carcaça géis de fibrina na placa de 48, use 20 μL de solução de fibrinogênio e 20 μL de solução de TA.
7. Repita as etapas de 3.5 e 3.6 para todas as peças da FT.
8. Permitir que o gel de fibrina solidificar por incubar as placas em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C numa atmosfera umidificada com 5% de CO₂.
9. Após 0,5-1 h, verifique se o gel de fibrina é completamente formado por cuidadosamente inclinar a placa. Prossiga para a etapa 3.10 quando o gel não se move quando a placa é inclinada, indicando que a formação de gel de fibrina é completa.
10. Sobrepor os géis FT/fibrina com ex vivo de meio de cultura (600 μL/poço em placa de 24) ou 300 μL/poço em placa de 48 suplementados com 100 μg/mL aprotinina. Pipete o meio suavemente por dispensa algumas.
    Nota: Aqui, aprotinina é usada para prevenir a degradação da fibrina gel por proteases celulares expressados pelo FTs^13,14. O ex vivo cultura meio Adicionalmente pode ser suplementado com fatores de crescimento recombinantes, como VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (ver Tabela de materiais)¹¹.
11. Coloque o FT ex vivo placa de cultura de volta para o 37 ° C, 5% CO₂ incubadora de cultura celular e cultura para o período de tempo desejado (por exemplo, 2 - 18 dias, cultura mais longo períodos precisa ser testado). Substitua 50% de médio porte com fresco ex vivo de meio de cultura em três dias.

4. "na Matrix" Imaging

1. Adquirir imagens de FT ex vivo de culturas no mesmo dia (dia 0) e em intervalos regulares (por exemplo, todos os dias), usando um microscópio de epifluorescência invertida, a fim de acompanhar o crescimento do 3D.
   Nota: As imagens obtidas podem ser usadas para a quantificação de consequência a FT como o comprimento total dos dois diâmetros perpendiculares através do explante¹¹.

5. nativo FT e Ex Vivo cultura ponto final

Nota: Os géis FT/fibrina podem ser cultivados ex vivo, para o período de tempo desejado (FT ex vivo culturas) ou fixo no mesmo dia (nativo FT) para o nativo de caracterização FT¹¹.

1. Corrigir o FT nativo ou o FT ex vivo culturas, substituindo o meio de cultura com 1ml/bem de paraformaldeído 4% em solução de PBS, por 1h no RT Para os nativos géis FT/fibrina, correção de 0.5-1 h após a adição do ex vivo cultura médio (se o gel de fibrina não ter sido embebido em médio, fixação irá danificá-los).
   Nota: Execute esta etapa na coifa como paraformaldeído é corrosivo, tóxico e cancerígeno.
2. Lave os géis FT/fibrina com três lavagens de 5 min em PBS (2 mL/poço).
3. Substituir a PBS com 2ml/bem de PBS contendo 0,02% de azida sódica e armazenar os géis de fibrina fixa a 4 ° C até o processamento adicional. Sele as placas com película de parafina para garantir que os geles FT/fibrina não seca, no armazenamento.
   Nota: Execute esta etapa na coifa como azida de sódio é tóxica.

6. mancha da imunofluorescência toda a montagem

Nota: Este protocolo dura 5 dias e pode ser interrompido com incubação durante a noite do local indicado. Não deixe que a fibrina géis seca em qualquer ponto. Todas as etapas são executadas no RT, salvo indicação em contrário.

1. Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo de coloração.
   1. Pós-fixação solução: preparar a solução de acetona: metanol 50: 50 pela mistura de quantidades iguais de acetona e metanol (por exemplo, 50 mL). Loja a-20 ° C. Prepare esta solução mais recente no dia antes da coloração. Esta solução pode ser armazenada em-20 ° C e ser usada para colorações subsequentes.
      Nota: Prepare esta solução na coifa, como acetona e metanol são inflamáveis e perigosos para a saúde.
   2. Solução de bloqueio: preparar um 15% bovina soro fetal (FBS), 0,3% octil etoxilato solução de fenol em PBS pelo primeiro adicionando 15% FBS de PBS. Adicionar octil fenol etoxilado e mexa até para dissolver. Loja a 4 ° C.
      Nota: Esta solução pode ser preparada em grande quantidade com antecedência, armazenados em 15 mL aliquotes a-20 ° C e descongelado antes da utilização, no dia quando o protocolo de coloração é iniciado. Use um aliquote recentemente preparada ou recém descongelado para cada protocolo de coloração.
   3. Solução de lavagem: preparar 1 L de PBS suplementado com 0,45% octil fenol etoxilado adicionando 4,5 mL de fenol octil etoxilato de 995,5 mL de PBS. Mexa até para dissolver. Loja em RT.
2. Levante as gotas cuidadosamente da placa usando uma espátula de aço inoxidável quadrado com arestas. Desanexe o droplet primeiro as bordas antes de levantar o centro e transferir para um poço de 12 placa contendo 1 mL de PBS.
   Nota: Realizar pós-fixação, lavagens e bloqueio de etapas neste formato de placa.
3. Fixe as gotas com 1 mL de solução de metanol: acetona gelada 50: 50 por ~ 1 min (fronteira de gotas vai ficar branca).
   Nota: Execute esta etapa na coifa, como acetona e metanol são perigosas para a saúde.
4. Enxágue com 3-5 lavagens em 2 mL de PBS (as gotas vão afundar na solução de PBS quando a reidratação é completa).
   Nota: Evite tocar as gotas com a ponta da pipeta, como, após a fixação pós são pegajosos de plástico. Em todo o protocolo, evite aspirar pós-fix, anticorpo, bloqueando e soluções de lavagem por sucção, como pode danificar ou destruir completamente as gotas. Em vez disso, incline o prato e Retire cuidadosamente a soluções usando uma pipeta μL de 500-5.000.
5. Centrifugue a solução bloqueio por 15 min em 21.000 x g e 4 ° C a fim de remover os resíduos.
   Nota: A solução pode ser aliquotada em tubos de 1,5 mL por centrifugação. A solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C e usada para todas as etapas subsequentes relevantes.
6. Incubar as gotas em 500 μL obstrui a solução por 2 h no RT
   Nota: Para reduzir o volume de solução utilizada de bloqueio, a placa pode ser inclinada sobre um suporte e pode ser usado como 300 μL de solução/gota.
7. Prepare a mistura de anticorpo primário (pelo menos 30 μL/gota) na diluição adequada no bloqueio de solução e centrifugar por 15 min a 21.000 x g e 4 ° C.
8. Transferir as gotas em volta (U)-placa de 96 poços de fundo, usando uma espátula com arestas redondas e incubar pelo menos 30 μL/gota da mistura de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
9. No dia seguinte, transferência das gotas em 12-poço da placa contendo 2 mL de solução/poço, de lavagem enxágue com três 5 min lava primeiro e, em seguida, com lavagens de nove 30 min. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
10. No dia seguinte, lavar três vezes com PBS e transferir as gotas em volta (U)-placa de 96 poços de fundo.
11. Durante as lavagens, prepare a mistura de apropriado fluoróforo conjugado anticorpo secundário (diluído 1: 500, pelo menos 30 μL/gota) no bloqueio de solução e centrifugar por 15 min em 21.000 x g e 4 ° C.
12. Transferir as gotas em uma rodada (U)-placa de 96 poços de fundo, usando uma espátula com arestas redondas e incubar pelo menos 30 μL da mistura de anticorpo secundário, por 4h em RT, protegido da luz.
    Nota: Execute todas incubação do subsequente e etapas de lavagem, protegidas da luz.
13. Transfira as gotas na placa de 12 contendo 2 mL de lavagem, solução/bem usando uma espátula com arestas redondas, enxaguar com três lavagens de 5 min primeiro e depois com quatro lavagens de 30 min. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
14. No dia seguinte, lave os géis com cinco lavagens de 30 min e então três vezes com PBS. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
15. No dia seguinte, transferir as gotas em uma rodada (U)-placa de 96 poços de fundo usando um núcleos de espátula e corante de contraste com arestas redondas incubando com 10 μg/mL Hoechst mancha nuclear (pelo menos 30 μL/gota) por 30 minutos em RT
    Nota: Suplementado com 4' de montagem, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para núcleos counterstaining Alternativamente pode ser usado. Nesse caso, este passo e passo 6.16 são ignorados, procedendo diretamente para a etapa 6.17.
16. Transferir as gotas para a placa de 12 contendo 2 mL de PBS/bem, usando uma espátula com arestas redondas e lavar três vezes com PBS.
17. Monte as gotas para uma lâmina de microscópio, como segue:
    1. Aplique uma camada estreita de meio de montagem rápida-endurecimento nas bordas de uma lamela em forma de quadrado 22 x 22 mm e deixe secar por ~ 1 minuto. Execute esta etapa para cada gota individualmente, para evitar endurecimento excessivo do meio de montagem.
       Nota: Execute esta etapa na coifa, como o meio de montagem rápida-endurecimento é perigoso para a saúde.
    2. Enxágue o droplet mergulhando em um poço de uma placa de 12 contendo 2 mL de água desionizada e transferir para uma lâmina de microscópio, usando uma espátula com arestas redondas. Remova o excesso de água usando um pequeno pedaço de papel absorvente.
    3. Dispense a 15 µ l de meio de montagem de antidesgaste não-endurecimento para a gota.
       Nota: Como alternativa, se não tiver sido usada mancha nuclear Hoechst, montagem meio contendo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pode ser usado.
    4. Delicadamente, posicione o tampa de vidro, com o meio de montagem rápida-endurecimento virado a corrediça microscópica, a gota e deixa-se.
       Nota: O meio de endurecimento rápido furarão ao slide microscópica e manter a gota no lugar.
18. Repita a etapa 6.17 para todas as gotas. Monte as duas gotas em cada lâmina de microscópio.
19. Deixe os slides secar ao ar livre em RT ~ 2 h e armazenar a 4 ° C durante a noite. Certifique-se que os slides são posicionados horizontalmente e protegidos da luz.
20. Imagem manchada nativo ou ponto de extremidade FT ex vivo de culturas usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma função de seccionamento óptica e 20x ou objectivo de x 40. Use a função de telha para capturar uma área maior do tecido de uma só vez.

Resultados

Compreensão mais profunda das propriedades de tecidos fibrovasculares PDR e expressão da proteína dependeu principalmente amostras de vítreos e fina histológica FT seções^3,15,16,17. Para desenvolver um método para investigação minuciosa da organização tecido 3D e multicelulares processos fisiopatológicos de PDR, partimos para utilizar o cirurgicamen...

Discussão

Considerando a importância do microambiente tecido relevantes para confiança funcional celular e moleculares resultados mecanicistas, é imperativo encontrar modelos experimentais adequados que fornecem este ambiente de tecido. O descrito neste documento ex vivo PDR cultura modelo para os FTs de fibrina-incorporado permite a investigação dos mecanismos da fisiopatologia PDR no contexto nativo, complexo e multicelular de amostras clínicas de PDR.

Passos críticos dentro do protoco...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT