Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.

Resumo

Uma plataforma para estudar o metabolismo do insecticida usando in vitro os tecidos da planta de chá foi desenvolvida. As folhas das plântulas de chá estéreis foram induzidas para formar calo solto nos meios basais de Murashige e Skoog (MS) com os hormônios vegetais 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 1,0 mg L^-1) e CINETINA (KT, 0,1 mg l^-1). Callus formado após 3 ou 4 rodadas de subculturação, cada um com duração de 28 dias. O calo frouxo (aproximadamente 3 g) foi inoculado então em meios líquidos B5 que contêm os mesmos hormônios de planta e foi cultivado em uma incubadora de agitação (120 rpm) no escuro em 25 ± 1 ° c. Após 3 − 4 subculturas, uma suspensão da pilha derivada da folha do chá foi estabelecida em uma relação da subcultura que varia entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco). Usando esta plataforma, seis insecticidas (5 μg mL^-1 cada Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, e omethoate) foram adicionados na cultura folha-derivada do chá da suspensão da pilha. O metabolismo dos inseticidas foi rastreado usando cromatografia líquida e cromatografia gasosa. Para validar a utilidade da cultura da suspensão da pilha de chá, os metabolitos do tiametoxam e do dimetoato atuais em culturas de pilha tratadas e em plantas intactas foram comparados usando a espectrometria maciça. Em culturas tratadas da pilha de chá, sete Metabolites de tiametoxam e dois Metabolites do dimetoato foram encontrados, quando em plantas intactas tratadas, somente dois Metabolites do tiametoxam e um do dimetoato foram encontrados. O uso de uma suspensão celular simplificou a análise metabólica em comparação com o uso de plantas de chá intactas, especialmente para uma matriz difícil, como o chá.

Introdução

O chá é uma das bebidas não alcoólicas mais consumidas no mundo^1,2. O chá é produzido a partir das folhas e gemas do Woodyperene Camellia sinensis L. as plantas de chá são cultivadas em vastas plantações e são suscetíveis a numerosas pragas de insetos^3,4. Os insecticidas do organophosphorus e do neonicotinóides são usados frequentemente como insecticidas sistemáticas⁵ para proteger plantas de chá das pragas tais como whiteflies, funis da folha, e alguma espécie do lepidóptero^6,7. Após a aplicação, estes insecticidas são absorvidos ou translocalizados na planta. Dentro da planta, esses inseticidas sistêmicas podem ser transformados por meio de reações de hidrólise, oxidação ou redução por enzimas vegetais. Estes produtos da transformação podem ser mais polares e menos tóxicos do que os compostos do pai. No entanto, para alguns organofosforados, as Bioatividades de alguns produtos são mais elevadas. Por exemplo, o acefato metaboliza-se nos metamidofos mais tóxicos^8,9, e dimetoato no ometoato^10,11. Os estudos metabólicos da planta são assim importantes para determinar o Fate de um insecticida dentro de uma planta¹².

As culturas de tecidos vegetais têm sido provadas como uma plataforma útil para investigar o metabolismo de pesticidas, com os metabólitos identificados semelhantes aos encontrados em plantas intactas^13,14,15. O uso de culturas de tecidos, particularmente culturas de suspensão celular, tem várias vantagens. Em primeiro lugar, experimentos podem ser realizados livres de microrganismos, evitando assim a interferência da transformação de pesticidas ou degradação por micróbios. Em segundo lugar, a cultura do tecido fornece materiais consistentes para o uso a qualquer hora. Em terceiro lugar, os metabolitos são mais fáceis de extrair das culturas do tecido do que das plantas intactas, e as culturas do tecido têm frequentemente menos compostos interring e uma mais baixa complexidade dos compostos. Finalmente, as culturas do tecido podem mais facilmente ser usadas para comparar uma série de metabolismo dos insecticidas em um único experimento¹⁶.

Neste estudo, uma suspensão da pilha derivada das folhas do plantlet estéril-crescido do chá foi estabelecida com sucesso. A cultura de suspensão de células de chá foi então utilizada para comparar os comportamentos de dissipação de seis inseticidas sistêmicas.

Este protocolo detalhado é pretendido fornecer alguma orientação de modo que os investigadores possam estabelecer uma plataforma da cultura do tecido de planta útil para estudar o Fate metabólico de xenobióticos no chá.

Protocolo

1. cultura do calo do chá

Nota: as folhas estéreis foram derivadas de linhas de plânteria cultivadas in vitro, desenvolvidas pela primeira vez no grupo de pesquisa¹⁷. Todos os procedimentos até a seção 5 foram conduzidos em uma capa estéril do fluxo laminar, à exceção do tempo da cultura em uma incubadora.

1. Ajuste o pH dos dois meios (Murashige e Skoog [MS] meio basal e o meio líquido B5 de Gamborg) para 5,8 antes de autoclavagem (121 ° c, 20 min).
2. Corte ao longo da veia média de uma folha estéril usando tesouras e, em seguida, subdivida cada metade em pequenos pedaços de cerca de 0,3 cm x 0,3 cm em uma placa de Petri.
3. Coloc os explantes estéreis (as partes pequenas da folha) em meios básicos do MS que contêm os hormones de planta 2,4-D (1,0 MGS L^-1) e KT (0,1 magnésio l^-1). Seis explantes podem ser colocados em um balão de 300 mL contendo 100 mL de MS de meios basais.
4. Cultura os explantes acima da folha em uma temperatura constante de 25 ° c no escuro. Após 28 dias, selecione a primeira geração de calo induzido e transfira para a garrafa fresca (uma subcultura). Adquira o calo frouxo e friável após 3 − 4 subcultures.

2. cultura da suspensão da pilha de chá

1. Corte os calos vigorosos, friáveis e frouxos do meio contínuo em partes pequenas (escala aqui 0.5 − 2 milímetros) usando uma lâmina cirúrgica estéril circunstâncias estéreis.
2. Pesar cerca de 3 g dos pequenos pedaços de calo. Coloque o calo em um balão de 150 mL contendo 20 mL de meio líquido B5 suplementado com 2,4-D (1,0 mg L^-1) e KT (0,1 mg l^-1).
3. Cultura a suspensão da pilha líquida em uma temperatura constante (25 ± 1 ° c) em uma incubadora de agitação em 120 RPM no escuro.
4. Após 7 a 10 dias de cultivo, retire os frascos de cultura e deixe-os ficar por alguns minutos.
5. Tome todo o sobrenadante como material de semente para a subcultura ao meio fresco (a relação da subcultura do líquido da mãe da suspensão ao meio fresco variou entre 1:1 e 1:2). Remova os calos precipitados, grandes.
6. Obtenha a cultura final da suspensão celular bem cultivada após 3 − 4 ciclos de subcultura de 28 dias cada.

3. ensaio de cloreto de trifenilo tetrazólio de viabilidade celular

1. Mate uma amostra de células vivas a 100 ° c por 10 min como uma célula de controle antes da coloração da viabilidade.
2. Centrifugue toda a cultura da suspensão da pilha por 8 minutos em 6000 x g. Retire o sobrenadante antes de suspender as células em 2,5 mL de tampão salino com tampão fosfato (PBS) (pH 7,3), e agitar por 1 min à mão.
3. Adicionar 2,5 mL da solução de cloreto de tetrazólio de 0,4% de trifenilo (TTC) e agitar à mão novamente.
4. Incubar a mistura durante 1 h numa incubadora permanente (30 ° c).

4. tratamento e amostragem de culturas de suspensão de células de chá com inseticidas

1. Adicionar uma alíquota de 400 μL de solução de stock esterilizada por filtro (500 μg mL^-1) de quatro neonicotinóides (tiametoxam, acetamipride, imidaclopride e imidaclothiz) ou dois organofosforados (dimetoato e ometoato) nas culturas de suspensão celular, Respectivamente.
   Nota: se o objetivo é comparar os comportamentos xenobióticos, use o mesmo lote mãe de suspensões celulares para testar os diferentes compostos.
2. Cultura das amostras de suspensões celulares com inseticidas em temperatura constante (25 ± 1 ° c) e velocidade da incubadora de agitação (120 rpm). Tome as amostras (ver passo 4,3 ou 4,4) em 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 e 75 dias.
3. Para testar uma amostra contendo um neonicotinóide, retire uma alíquota de 1 mL da cultura celular homogênea, coloque-a em um tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mL e centrifugue a 4000 x g por 2 min.
   1. Passe os sobrenadantes através de uma membrana de filtro de tamanho de poros de 0,22 μm antes da análise por cromatografia líquida de alta eficiência-ultravioleta (HPLC-UV) e cromatografia líquida de ultra alto desempenho-massa quadrupolar de tempo de voo (UPLC-QTOF) espectrometria (tabela de materiais).
4. Para testar uma amostra contendo um organofosfato, retire uma alíquota de 500 μL da cultura celular e coloque em um tubo de centrífuga de 35 mL ou um tubo de centrifugação de plástico de 1,5 mL (Prepare a última amostra como a de neonicotinóide).
   1. Adicionar 0,1 g de cloreto de sódio e 5 mL de acetona/acetato de etilo (3:7, v/v) no tubo de centrifugação de 35 mL das amostras de 500 μL.
   2. Vórtice as misturas por 1 min, e depois permitir-lhes descansar por 10 min.
   3. Tomar 2,5 mL do sobrenadante em um tubo de vidro de 10 mL e evadir-se para Near-dryness usando um evaporador de nitrogênio a 40 ° c.
   4. Dissolver o resíduo com 1 mL de acetona, vortex por 1 min, passá-lo através de uma membrana de filtro de 0,22 μm antes da análise por cromatografia gasosa-detector fotométrico de chama (GC-FPD).

5. preparação da amostra da planta de chá intacta com insecticidas

Nota: o ensaio da planta do chá intacto foi conduzido em um sistema hidropônico usando mudas de chá cultivadas em 50 mL de uma solução nutritiva (30 NH₄+, 10 não₃-, 3,1 PO₄-, 40 K⁺, 20 CA^{2 +}, 25 mg^{2 +}, 0,35 FE^{2 +}, 0,1 B ^{3 +}, 1,0 Mn^{2 +}, 0,1 Zn^{2 +}, 0, 25 UC^{2 +}, 0, 5 mo⁺, e 10 Al^{3 +}, em mg L^-1)¹⁸. Uma estufa experimental estava um ciclo claro-escuro (12 h da luz e 12 h da escuridão) em 20 ° c na Universidade agricultural de Anhui.

1. Coloque cinco plantas em um pote de plástico de 4 L por 15 dias.
2. Adicione 0 ppm (controle) ou 100 ppm de tiametoxam ou dimetoate em vasos plásticos, respectivamente.
3. Prepare a amostra de planta intacta de acordo com o método anterior, exceto para presoaking¹⁹, e depois analise com espectrometria de massas para um espectro de massa exato.

6. análise do instrumento

1. Análise de HPLC do comportamento metabólico de neonicotinóides
   1. Use um HPLC-UV (tabela de materiais) para detectar o índice e os produtos metabólicos de tiametoxam e de acetamipride em um comprimento de onda de 254 nanômetro, e de imidaclopride e de imidaclothiz em 270 nanômetro nas amostras da seção 4,3.
      Nota: a condição HPLC-UV foi a mesma do estudo anterior¹⁹.
2. Análise do GC do comportamento metabólico de organofosforados
   1. Detecte o conteúdo de dimetoato e ometoato em amostras da seção 4,4 por um GC-FPD usando uma coluna quiral (tabela de materiais).
   2. Use o nitrogênio como o gás de portador e ajuste a taxa de fluxo em 1,0 mL min^-1.
   3. Ajuste a temperatura inicial para 120 ° c, e segure-a por 5 min. aumente a temperatura para 150 ° c a 30 ° c Min^-1 e segure por 3 min. aumente para 170 ° c a 10 ° c Min^-1 e segure por 7 min. Finalmente, aumente para 210 ° c a 30 ° c Min^-1 e depois Segure por 5 min.
   4. Ajuste a temperatura da injeção a 200 ° c no modo splitless; Ajuste a temperatura do detector a 250 ° c.
   5. Defina o volume de injeção para 1 μL.
3. Análise de UPLC-QTOF dos metabolitos do insecticida na cultura de pilha
   1. Detecte os metabolitos dos insecticidas na cultura de pilha (amostras da seção 4,3) usando o UPLC-QTOF com uma coluna C18 (tabela dos materiais).
   2. Defina a vazão para 0,2 mL min^-1. Defina o volume de injeção para 10 μL.
   3. Para as amostras tratadas com neonicotinóides, defina a fase móvel inicial para 85% A (5 mM de água de formato de amónio) e 15% B (acetonitrila). Sobre 10 minutos, aumente a fase móvel B a 38% e retorne a 15% sobre 1 minuto, preensão por 9 minutos.
   4. Para as amostras tratadas com organofosfato, defina a fase móvel inicial para 55% A (0,1% de água de ácido fórmico) e 45% B (acetonitrila). Sobre 5 minutos, aumente a fase móvel B a 70%, a seguir retorne a 45% de B sobre 0,5 minutos, preensão para o minuto 2,5.
   5. Defina os parâmetros de operação QTOF da seguinte forma: temperatura do gás, 325 ° c; gás de secagem (nitrogênio), 10 L min^-1; temperatura do gás da bainha, 350 ° c; fluxo de gás da bainha, 11 L min^-1; tensão capilar, 4000 V; tensão do bocal, 1000 V; fragmentor tensão, 100 V para inseticidas neonicotinóides ou 110 V para inseticidas organofosforados; tensão do skimmer, 65 V; operando em modo de íon positivo.
   6. Defina o instrumento para o espectro de digitalização completo e o modo MS/MS de destino.
   7. Processe os dados usando ferramentas de massa precisas; Inferir os metabólitos sem produtos padrão da anotação MS/MS, bem como a literatura^{12,15,20,21,22}.
4. Análise de UPLC-Orbitrap dos metabolitos do insecticida no extrato intacto da planta
   1. Detecte os metabolitos dos insecticidas no extrato intacto da planta usando a espectrometria maciça de UPLC-Orbitrap (tabela dos materiais).
   2. Defina os parâmetros de operação da espectrometria de massas (tabela de materiais) da seguinte forma: pressão de gás da bainha, 35 ARB; temperatura do gás, 300 ° c; tensão do bocal, 3,5 KV; temperatura capilar, 350 ° c.
   3. Ajuste os programas da eluição como acima (etapas 6.3.3 e 6.3.4) para a análise de UPLC-QTOF da cultura de pilha.

Resultados

A indução de calo de folhas colhidas de árvores de chá cultivadas em campo e de folhas excisadas de plântulas de chá cultivadas in vitro em ambiente estéril foi comparada através da medição de contaminação, escurecimento e indução após 28 dias de cultivo em MS Media ( Figura 1a). O crescimento do calo foi registrado aos 20, 37, 62 e 90 dias de cultura (Figura 1b). O calo derivado das folhas cultivadas in vitro most...

Discussão

Este artigo apresenta o processo detalhado de estabelecimento de um modelo de metabolismo de pesticidas no tecido vegetal do chá, incluindo a seleção de explantes, a determinação da viabilidade celular, e o estabelecimento de uma cultura de suspensão de células de chá com alta metabólica Atividade. Todas as partes de um tecido vegetal podiam ser usadas para iniciar o calo em um ambiente esterilizado²⁵. As folhas de chá foram escolhidas para a iniciação do calo neste estudo, não soment...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetamiprid (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	46717	CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%)	Tedia	AS1122-801	CAS No: 75-05-8
Agar	Solarbio Science & Technology	A8190	CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	525	CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%)	Dr. Ehrenstorfer	109217	CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	91029	CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%)	Toronto Research Chemical	I275000	CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)	Solarbio Science & Technology	K8010	CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%)	Dr. Ehrenstorfer	105491	CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)	Solarbio Science & Technology	P8070	CAS No: 25249-54-1
Sucrose	Tocris Bioscience	5511	CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	20625	CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%)	Solarbio Science & Technology	T8170	CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)	Guangzhou Saiguo Biotech	D8100	CAS No: 94-75-7
chiral column	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632	Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC)	Shimadu	2010-Plus	Paired with Flame Photometric Detector (FPD)
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1260	Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column	Waters	186003539	Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)	Agilent	1290-6545	Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC)	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive Focus	Connected to a Orbitrap mass spectrometer