Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Resumo

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

Resumo

O rato é amplamente utilizado como um organismo modelo para estudar as doenças biliares. Para avaliar o desenvolvimento e a função do sistema biliar, diversas técnicas são usadas, incluindo a química do soro, a análise histológica, e a imunomarcação para marcadores específicos. Embora essas técnicas possam fornecer informações importantes sobre o sistema biliar, muitas vezes não apresentam um quadro completo de defeitos de desenvolvimento do ducto biliar (BD) em todo o fígado. Isto é em parte devido à habilidade robusta do fígado do rato para drenar a bilis mesmo nos animais com prejuízo significativo no desenvolvimento biliar. Aqui nós apresentamos um método simples para calcular o número médio de BDs associados com cada veia portal (picovolt) nas seções que cobrem todos os lóbulos de ratos mutantes/transgenic. Neste método, os fígados são montados e seccionados de forma estereotipado para facilitar a comparação entre vários genótipos e condições experimentais. Os BDs são identificados por meio de microscopia de luz de colangiócitos corados por citoqueratina e, em seguida, contados e divididos pelo número total de PVs presentes na seção hepática. Como exemplo, mostramos como esse método pode distinguir claramente entre camundongos de tipo selvagem e um modelo de rato da síndrome de Alagille. O método aqui apresentado não pode substituir técnicas que visualizem a estrutura tridimensional da árvore biliar. No entanto, oferece uma maneira fácil e direta de avaliar quantitativamente o desenvolvimento de BD e o grau de formação de reação ductular em camundongos.

Introdução

A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ^1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem biliar adequada. Além disso, um número de doenças sindrômica e não-sindrômica resultam no escassez de BDS intrahepatic³. Além disso, uma série de doenças hepáticas agudas e crônicas dão origem às chamadas reações ductulares no fígado, que são definidas como a presença de um número significativo de células que expressam marcadores biliares, mas não necessariamente surgem de células biliares ou forma patente BDs⁴. Na síndrome de Alagille do transtorno multisistema (algs), a haploinsuficiência do entalhe ligante jagged1 (JAG1) resulta em má formação de BD e colestase^5,6. Nosso laboratório demonstrou recentemente que uma linha Jag1 heterozygous previamente gerada⁷ do rato é um modelo animal de BD escassez em algs⁸. Neste modelo do rato de algs, os colangiócitos estão ainda atuais. No entanto, eles não conseguem se comprometer com a incorporação em maduro, patentes BDs⁸. Conseqüentemente, a análise do fígado em um modelo de BD escassez exige mais do que a presença ou a ausência aparente de cholangiocytes. É importante avaliar com precisão o grau em que os BDs maduros estão presentes no fígado.

Na patologia anatômica, existem métodos quantitativos aceitos para avaliar se a BD escassez existe⁹. Por exemplo, estudos sobre algs em pacientes humanos frequentemente quantificam a razão BD para veia porta (PV) analisando pelo menos 10 vasos portais por biópsia hepática^9,10. A análise da forma e a presença ou ausência geral de BDS de patentes, combinadas com a química sérica, podem fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de BD em camundongos^11,12,13. No entanto, os camundongos podem perder um número significativo de BDs com apenas um aumento modesto no nível de bilirrubina sérica⁸. Assim, um método quantitativo que avalia o número de BDS presentes por PV pode fornecer uma medida mais direta do grau de BD escassez em camundongos. Em um relatório recente, nós quantificamos o número de BDs por o picovolt através de todos os lóbulos do fígado e relatamos uma diminuição significativa na relação do BD ao picovolt em Jag1 +/- animais⁸. No decorrer de nossa análise, observamos que, apesar da significativa variação do grau de resposta inflamatória e das reações ductulares, a relação BD com PV não mostra muita variabilidade⁸. Além disso, a quantificação da relação BD para PV permitiu demonstrar que a remoção de uma cópia do gene glicosiltransferase Poglut1 em Jag1 +/– animais pode melhorar significativamente a sua BD escassez⁸. Em um fundo Jag1 +/+ , a perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares resulta em um aumento progressivo nos números de BD, o que é modesto (20-30%) no P7, mas torna-se proeminente em adultos⁸. Mais uma vez, esta técnica permitiu-nos mostrar que, mesmo em P7, o aumento da densidade de BD nesses animais é estatisticamente significante. Da nota, a densidade aumentada do BD neste genótipo em quatro meses da idade foi validada com a análise do molde da resina também. ⁸ estas observações e outros relatórios que mediram a densidade do BD em modelos diferentes do rato de algs^14,15 alertaram-nos incorporar este método em nossa estratégia total para analisar defeitos biliares em vários mutantes e camundongos transgênicos.

Aqui, detalhamos uma técnica direta que pode ser usada para examinar o grau de BD escassez em modelos de camundongo de doença hepática (Figura 1). Neste método, a cocoloração com marcadores de colangiócitos citoqueratina (CK) 8 e CK19 (a seguir CK de largo espectro, wsCK) é usada para visualizar BDs e colangiócitos não incorporados no fígado do mouse. Um anticorpo de encontro ao actínio alfa-liso do músculo (αSMA) é adicionado à mancha para etiquetar embarcações. A análise sistemática da relação BD para PV em uma seção que abrange todos os lóbulos hepáticos assegura que um grande número de PVs seja analisado para cada genótipo. Como nosso método depende da quantificação de BDs e PVs em imagens 2D, não é adequado para estudar os efeitos de uma determinada mutação na estrutura 3D da árvore biliar ou a integridade das pequenas condutas biliares. Não obstante, fornece uma estratégia simples e objetiva para que os investigadores avaliem o desenvolvimento biliar no rato.

Protocolo

Todos os animais foram alojados em uma instalação de barreira animal no Baylor College of Medicine por diretrizes institucionais de cuidado animal e uso do Comitê e protocolos de animais aprovados.

1. coleção do tecido do fígado do rato

1. Preparação do rato para a colheita do fígado
   1. Eutanizar o rato usando isoflurano.
   2. Realize luxação cervical do mouse para garantir a morte.
   3. Faça uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica.
   4. Expor toda a superfície ventral do fígado.
2. Coleção do fígado do rato
   1. Com cuidado, com tesouras pequenas, corte através dos ligamentos que conectam o fígado a outros órgãos no abdômen.
   2. Corte através do BD comum para separar o fígado do intestino.
   3. Remova com cuidado o fígado segurando na vesícula biliar e coloc imediatamente em um tubo de 50 ml enchido a três quartos por paraformaldeído de 4% (PFA).

2. fixação e incorporação do fígado em parafina

1. Fixação
   1. Fixar o tecido hepático para 48 h em 4% PFA a 4 ° c.
   2. Lave o tecido com 70% de EtOH por 1 h a 4 ° c.
   3. Lave o tecido duas vezes com 95% EtOH para 1 h cada a 4 ° c.
   4. Lave o tecido duas vezes com 100% EtOH para 1 h cada a 4 ° c.
2. Limpar
   1. Lave o tecido hepático com agente de compensação (tabela de materiais) três vezes por 30 min cada em temperatura ambiente.
      Nota: O fígado deve sentir-se rígido após a terceira lavagem.
3. Incorporação em parafina
   1. Coloque a fita de tecido em um molde de tecido em cera de parafina para 3 laves, 30 min cada. A cera deve ser pré-aquecida a 60 ° c.
   2. Encha o molde do tecido com a cera de parafina à altura de três quartos e mantenha-o em um bloco de aquecimento em 60 ° c.
   3. Coloque o fígado no molde com o lado ventral virado para cima.
   4. Retire cuidadosamente o molde do bloco de aquecimento.
   5. Coloc a parte superior da gaveta no molde e parte superior fora com a parafina líquida quente.
   6. Permita que o molde e o bloco esfriem à temperatura ambiente durante a noite.
      Nota: Os blocos do tecido podem agora ser armazenados na temperatura ambiente.

3. seccionamento do tecido hepático

1. Preparação do bloco de corte
   1. Coloc o molde no gelo por 5 minutos antes de remover o bloco do molde.
   2. Coloc o bloco no gelo com um papel de tecido do laboratório atual entre o bloco e o gelo.
   3. Mantenha o bloco no gelo quando não seccionamento para melhores resultados de fatiamento do tecido.
2. Seccionamento dos blocos de fígado
   1. Usando um micrótomo, comece por seccionamento através do lado superficial, dorsal do fígado. As secções devem ser 5 μm.
   2. Verifique as seções superficiais um microscópio de dissecção para garantir que as seções não sejam cortadas ou dobradas.
   3. Tome uma seção do fígado que inclui o lobo caudado.
      Nota: Para alguns blocos, você terá os lóbulos esquerdos, medial, direito e caudado na mesma fatia do tecido.
   4. Para aqueles blocos onde todos os quatro lóbulos não estão presentes no mesmo slide, continue a fatiar até que os lóbulos esquerdos, medial e direito estejam presentes no mesmo slide.

4. immunohistochemistry para wsCK e αSMA

1. Processamento de lâminas para imunohistoquímica
   1. Selecione um slide por genótipo a ser analisado.
   2. Lave o slide por 15 min em xileno, 100% EtOH, 95% EtOH e, finalmente, 70% EtOH (3 x 5 min em cada solução).
   3. Lave a lâmina durante 5 min em H₂O deionizado.
   4. Mergulhe a corrediça na solução da recuperação do antígeno (pH Tris-baseado, elevado).
   5. Aqueça pressão em uma panela de pressão por 3 min a 10 psi.
   6. Deixe a corrediça arrefecer até à temperatura ambiente (aproximadamente 35 min).
2. Bloqueando as secções de tecido
   1. Usando um PAP Pen, delinear as seções no slide.
   2. Aplique solução salina tampão fosfato (PBS) + 0,1% Tween para cobrir a seção duas vezes, 5 min cada.
   3. Faça o tampão de obstrução misturando o soro normal da cabra (NGS) em 1:50 em PBS + 0,3% Triton. Para ter o suficiente tampão para o bloqueio e a aplicação preliminar do anticorpo, 100 μL por a seção são suficientes.
   4. Aplique 100 μL de solução de bloqueio por secção.
   5. Incubar as lâminas cobertas com a solução de bloqueio a 4 ° c durante 1 h.
3. Coloração para wsCK e αSMA
   1. Diluir anticorpos CK8 e anti-CK19¹⁶ (estudos de desenvolvimento hybridoma Bank, Troma-I e TROMA-III, respectivamente) 1:20 no bloqueio de buffer para manchar para wsck. Diluir o anticorpo anti-αSMA¹⁷ (tabela de materiais) para 1:200 no mesmo buffer.
   2. Aplicar 100 μL da solução de anticorpos diluídos contendo todos os três anticorpos para cada secção.
   3. Incubar as lâminas cobertas com a solução de anticorpos a 4 ° c durante a noite.
   4. Lave as lâminas com PBS + 0,1% Triton três vezes, 5 min cada.
   5. Diluir anticorpos secundários (anti-Rat-Alexa488 e anti-mouse-Cy5) 1:200 em PBS + 0,3% Triton.
   6. Aplique 100 μL da solução de anticorpos secundários contendo ambos os anticorpos secundários às lâminas.
   7. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
4. DAPI coloração nuclear e montagem
   1. Lave as lâminas três vezes, 5 min cada.
   2. Aplique 100 μL de DAPI (1:3000) a cada seção por 10 min.
   3. Aplique o meio de montagem Antifade (tabela de materiais) nas lâminas e coloque uma lamínula de vidro em cima das secções de tecido. Deixe as lâminas a 4 ° c durante a noite. Sele os slides no dia seguinte.
   4. Armazene as lâminas a 4 ° c e a imagem dentro de 1 semana de montagem.

5. imagem e quantificação de BDs

1. Seções do fígado da imagem latente
   1. Antes da imagem latente, cegar-se ao genótipo da amostra com a ajuda de um membro do laboratório. Assegure-se de que todos os arquivos de imagem sejam desprovidos de genótipo ou outras informações específicas de identificação além de um número de animal/amostra.
   2. Usando um microscópio fluorescente, tomar 20x imagens em 1x zoom de cada seção e garantir que cada PV através do fígado é imaged. Inclua os lóbulos esquerdos, medial, direito e caudado.
      Nota: Costumamos encontrar 60-90 tratos portal por animal, dependendo do tamanho do fígado.
   3. Para identificar os PVs, procure por αSMA mais coloração wsCK. Estruturas que são αSMA positivo, mas falta de coloração wsCK não são estruturas portais.
2. Identificação e contagem de BDs
   1. Crie uma planilha com as seguintes colunas: número de animal/amostra, número da imagem, número de PVs e número de BDs.
   2. Passando por cada imagem, identifique e registre o número de PVs por imagem.
   3. Identificar BDs de patente em cada imagem pela presença de colangiócitos (wsCK +) em torno de um lúmen definível. As estruturas devem ser distintas e separadas por mesenquime de outras células wsCK +.
   4. Conte cada patente BD e coloque na mesma coluna que o número da imagem.
   5. Faça isso para cada imagem tirada de um PV.
   6. Calcule a soma de todos os PVs e todos os BDs na amostra de fígado.
   7. Calcule a relação BD para PV para a amostra de fígado.

Resultados

Nós documentamos previamente defeitos biliares em Jag1 +/- Animals, um modelo do rato de algs⁸. Para determinar a relação BD com PV, nós seccionamos os fígados do mouse p30 e os cortinos para CK8 e CK19 (wsCK), juntamente com o marcador vascular αSMA. Nós então imaged todos os PVs em cada um dos lóbulos do fígado. Como mostrado na Figura 2a, definimos PVS como vasos manchados de αsma que têm coloração de wsck adj...

Discussão

A análise do desenvolvimento e reparo da BD em camundongos é uma importante ferramenta para estudar a patogênese e o mecanismo de distúrbios colestáticos. Além, o desenvolvimento de terapias novas é na parte dependente em cima de estabelecer um phenotype reprodutível e preferivelmente quantificáveis. A fenotipagem atual em modelos de mouse geralmente envolve química sérica, histologia hepática e imunocoloração para marcadores específicos do tipo celular. Embora essas técnicas gerem informações valiosas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein	11695-6776-2
Desiccator	Bel-Art	16-800-552
10% PFA	Electron Microscopy Sciences	15712
50 mL tube	ThermoScientific	339653
70% Ethanol	Decon Laboratories	2401
95% Ethanol	Decon Laboratories	2801
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
HistoChoice	VWR Life Sciences	H103-4L	clearing agent
Omnisette Tissue Cassette	Fisher HealthCare	15-197-710E
Macrosette	Simport	M512
Paraplast X-TRA	McCormick Scientific	39503002	Parrafin
Tissue Mold	Fisher Scientific	62528-32
Microtome	Microm	HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Xylene	Fisher Scientific	C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval	Vector Laboratories	H-3301
Pressure Cooker	Instant Pot	Lux Mini
Mini Pap Pen	Life Technologies	8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	J.T. Baker	X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)	J.T. Baker	X198-07
Normal Goat Serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-III	Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA	Sigma Aldrich	A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488	ThermoFisher	A21208
anti-mouse-Cy5	Jackson Immunoresearch	715-175-151
DAPI	Vector Laboratories	H-1000
22 x 50 mm2 micro cover glass	VWR Life Sciences	48393 059
Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Kimwipes	Kimtech Science	05511
VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Antifade Mounting Medium