Uma linha celular murine baseou o modelo da inibição CDK9 crônica para estudar defeitos não-genéticos difundidos do alongamento do transcriptional (TEdefinitivamente) nos cancros

Resumo

O protocolo detalha um modelo in vitro da carcinoma murino do alongamento defeituoso não-genético da transcrição. Aqui, a inibição crônica do CDK9 é usada para reprimar o alongamento produtivo do RNA Pol II ao longo dos genes de resposta pró-inflamatória para imitar e estudar o fenômeno TE^{definitivamente} superatendido, presente em cerca de 20% de todos os tipos de câncer.

Resumo

Nós temos relatado previamente que um subconjunto dos cancros é definido por desregulação transcricional globais com deficiências difundidas no alongamento da transcrição do mRNA (te)-nós chamamos tais cancros como te^{definitivamente}. Notavelmente, TE^{definitivamente} cânceres são caracterizados por transcrição espúria e processamento de mRNA defeituoso em um grande conjunto de genes, tais como INTERFERON/Jak/stat e TNF/NF-κB caminhos, levando à sua supressão. O TE^{definitivamente} SubType dos tumores na carcinoma renal da pilha e em pacientes metastáticos da melanoma correlacionou-se significativamente com a resposta e o resultado pobres na imunoterapia_. Dada a importância de investigar o te^{definitivamente} cânceres — como ele prenuncia um obstáculo significativo contra a imunoterapia — o objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro te^{definitivamente} mouse para estudar estes generalizada, não-genética anormalidades transcricional em cânceres e obter novas percepções, novos usos para as drogas existentes, ou encontrar novas estratégias contra esses cânceres. Nós detalham o uso da inibição CDK9 mediada flavopiridol crônica para revogar o fosforilação do resíduo do serina 2 no domínio da repetição do C-terminal (CTD) do polymerase II do RNA (RNA Pol II), suprimindo a liberação de RNA Pol II na transcrição produtiva Alongamento. Dado que o te^{definitivamente} os cânceres não são classificados nenhuma mutação somática específica, um modelo farmacológico é vantajoso, e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O uso de uma dose subletal otimizada de flavopiridol é a única estratégia eficaz na criação de um modelo generalizável de ruptura generalizada não-genética no alongamento da transcrição e defeitos de processamento de mRNA, imitando de perto o TE clinicamente observado ^{definitivamente} características. Conseqüentemente, este modelo de TE^{definitivamente} pode ser aproveitado para dissecar, fatores Cell-Autonomous permitindo os em resistir o ataque imune-negociado da pilha.

Introdução

Uma etapa chave-limitando da taxa na expressão de quase todos os genes ativos é a transição do RNA polymerase II (RNA Pol II) do promotor-pausando proximal ao alongamento produtivo^1,2. Dado que o desregulação epigenéticas do alongamento transcricional auxilia na progressão de malignidades humanas múltiplas definidas como te^{definitivamente}, conduzindo à sinalização suboptimal nos caminhos pró-inflamatórios da resposta que totalizam uma resposta pobre e o resultado à imunoterapia³, o objetivo abrangente deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro útil para estudar estas anomalias transcricional não-genéticas difundidas nos cancros. Nesta luz, o uso da inibição farmacológica crônica de CDK9 é uma estratégia eficaz para criar um modelo generalizáveis do rompimento generalizado não-genético no alongamento da transcrição e em defeitos de processamento do mRNA. A lógica subjacente ao uso da inibição CDK9 crônica é que ela AB roga fosforilação do resíduo de serina 2 no domínio de repetição do C-terminal (CTD) do RNA Pol II, reprisando assim a liberação de RNA Pol II em alongamento produtivo da transcrição. Além disso, TE^{definitivamente} cânceres, descritos anteriormente pelo nosso grupo³, não são classificados qualquer mutação somática específica. Conseqüentemente, um modelo não-genético (farmacológico) é vantajoso e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O método aqui detalha a geração e caracterização do modelo crônico de tratamento com flavopiridol de células cancerosas murinas. Este método interrompe demonstravelmente o alongamento da transcrição ao longo de genes caracterizados por comprimentos genóricos mais longos, com promotores poizados e expressões induzível tais como TNF/NF-κB e sinalização de interferon/stat, profundamente controlados ao nível de alongamento de transcrição^3,4,5. Globalmente, este modelo de linha de célula Murina otimizada de defeitos de alongamento transcricional — o único modelo ao nosso conhecimento para estudar os tumores recém-descritos do TE^{definitivamente} — impulsiona a resistência ao ataque imunológico antitumoral, tornando um sistema útil para explorar e examinar as vulnerabilidades de defeitos não genéticos em máquinas de transcrição de núcleo em cânceres vis-à-vis ataque de células imunomediadas.

Protocolo

O Comitê institucional de cuidados e uso de animais e o Comitê de biossegurança institucional da Fundação de pesquisa para crianças de Cincinnati aprovaram todos os procedimentos experimentais animais (protocolo IACUC #2017-0061 e protocolo IBC #IBC2016-0,016), e estes experimentos foram realizados de acordo com as normas descritas no guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. inibição crónica do RNA Pol II por tratamento com flavopiridol — estratégia básica

1. Células de melanoma de camundongo B16/F10 de semente em baixa densidade (0,2 x 10⁶) em uma placa de cultura de 10 cm em seu meio correspondente (meio de águia modificada de Dulbecco [DMEM], soro bovino fetal a 10% [FBS], 1% de penicilina e estreptomicina [Pen/Strep]) e incubar durante a noite em um 37 ° c, 5% co₂ umidificado incubadora.
2. No dia seguinte, lave as células com soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS) e adicione um novo lote de meios de cultura com uma dose subletal (estimada em 25 nM) de flavopiridol — um inibidor do fator de alongamento RNA Pol II p-TEFb (cyclin T/CDK9) — durante uma semana sem mais subculturação.
3. Após uma semana de tratamento com flavopiridol, realize ensaios confirmatórios para avaliar a capacidade do modelo de recapitular vários atributos de defeitos de alongamento transcricional observados nos cânceres de TE^{definitivamente} .

2. ensaio de immunoblot confirmatório para avaliar a função defeituosa do RNA Pol II e o prejuízo da via do interferon (IFN) e da sinalização do caminho do fator de necrose tumoral (TNF) do rato gerado TE^{definitivamente} modelo

1. Número de cultura igual (10⁵) de flavopiridol tratados células de melanoma de rato B16/F10 e células de melanoma de rato B16/F10 parental em dois conjuntos diferentes de 12 placas de poço (um conjunto para a caracterização funcional de RNA Pol II e o outro conjunto para a citocina estimulação) a 37 ° c em uma incubadora humidificada de 5% CO₂ durante a noite.
2. No dia seguinte, trate as células no conjunto de estimulação de citocinas com o mouse IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL), ou TNF-α (5 ng/mL) para 45 min a 37 ° c.
3. Agora, extraia a proteína das pilhas em ambos os conjuntos da caracterização funcional do citocinas e do RNA Pol II usando um amortecedor do lysis do ensaio da radioimunoprecipitação (Ripa) na seguinte maneira:
   1. Lave as células com 1X PBS e lise-a com 50 μL de tampão de Lise por poço. Raspe e, em seguida, pellet as células lisadas a 4 ° c, 21.130 x g.
   2. Meça a proteína em sobrenadantes de lisado celular usando um ensaio colorimétrico padrão para a concentração proteica Após solubilização de detergente (Bradford ou um ensaio similar).
4. Carregue a quantidade igual de proteína medida (15 μg) de cada amostra para funcionar em um gel do poliacrilamida do dodecil do sódio de 4% − 18% (SDS), e transfira-os para membranas do difluluoreto do polyvinylidene (PVDF).
5. Bloqueie as membranas de PVDF em 5% de leite seco em soro fisiológico com tampão Tris-polissorbato 20 (TBST) por 1 h seguido de uma incubação durante a noite a 4 ° c com anticorpos primários (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; total H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-actina 1:5000) em 5% de albumina sérica bovina.
6. Após o dia, lave as membranas de PVDF com 1x TBST durante 15 min à temperatura ambiente (RT), e incubar-os com anticorpos secundários apropriados (anti-Rat [1:5000] para RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II e p-SER5 RNA Pol II; anti-coelho (1:5000) para H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NFκB, e p-NFκB) para 50 min em RT. detecte os sinais da proteína usando a carcaça comercialmente disponível da peroxidase do rábano (HRP) com Chemiluminescence realçado.
   Nota: o β-Actin preliminar usado é HRP-conjugado, conseqüentemente pode ser desenvolvido sem um secundário.

3. ensaio confirmatório para avaliar defeitos de processamento de mRNA no rato gerado TE^{definitivamente} modelo

1. O número igual da semente (0,2 x 10⁶) de flavopiridol tratou pilhas do melanoma do rato de B16/F10 e pilhas de melanoma do rato de B16/F10 parental em 6 placas do poço em 37 ° c em uma incubadora humidificada de 5% co₂ durante a noite.
2. Extraia o RNA total das células cultivadas em 60% de confluência usando um reagente de extração de RNA ou Kit (tabela de materiais).
3. Esgote o rRNA do RNA extraído total da seguinte maneira:
   Nota: um protocolo de baixa entrada foi cooptado de um kit comercialmente disponível para esgotar o rRNA
   1. Ajuste um banho de água ou um bloco de calor a 70 − 75 ° c, e um outro banho de água ou bloco de calor em 37 ° c.
   2. Adicione o RNA total (100 − 500 ng em 2 μL de água nuclease-livre) com 1 μL de sonda seletiva de depleção de rRNA e 30 μL de tampão de hibridação em um tubo de microcentrífuga, misture suavemente por vortexing e incubar-os a 70 − 75 ° c por 5 min.
   3. Agora, transfira os tubos a um banho de água de 37 ° c/bloco de calor, e permita que a amostra esfrie a 37 ° c durante um período de 30 minutos.
   4. Ressuscitem os grânulos magnéticos da sonda de depleção de rRNA seletivo por vortexing e alíquota 75 μL de grânulos em um tubo de microcentrífuga 1,5 mL RNase livre.
   5. Coloc a suspensão do grânulo em um separador magnético por 1 minuto. permita que os grânulos se instalem. Aspirar suavemente e descartar o sobrenadante. Repita a lavagem dos grânulos mais uma vez adicionando 75 μL da água nuclease-livre e descartando o sobrenadante que segue a separação magnética.
   6. Suspender os grânulos lavados em 75 μL de tampão de hibridação e alíquota de 25 μL para outro tubo e mantê-lo a 37 ° c para uso posterior.
   7. Coloque os restantes 50 μL de grânulos num separador magnético durante 1 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender os grânulos em 20 μL de tampão de hibridação e mantê-lo a 37 ° c para uso posterior.
   8. Após o resfriamento da mistura de sonda de depleção de RNA/rRNA seletiva para 37 ° c por 30 min, centrifugue brevemente o tubo para coletar a amostra para a parte inferior do tubo.
   9. Transfira 33 μL da mistura de sonda de depleção de RNA/rRNA seletiva para as esferas magnéticas preparadas da etapa 3.3.7. Misture por vortexing de baixa velocidade.
   10. Incubar o tubo a 37 ° c durante 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Seguido por breve centrifugação para recolher a amostra para o fundo do tubo.
   11. Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pellet o complexo rRNA-Probe. Desta vez não descarte o sobrenadante. O sobrenadante contém RNA empobrecido por rRNA.
   12. Coloque o tubo de 25 μL de grânulos do passo 3.3.6 em um separador magnético por 1 min. aspirar e descartar o sobrenadante. Adicione o sobrenadante da etapa 3.3.11 ao novo tubo de grânulos. Misture por vortexing de baixa velocidade.
   13. Incubar o tubo a 37 ° c durante 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Centrifugue momentaneamente o tubo para recolher a amostra à parte inferior do tubo.
   14. Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pellet o complexo rRNA-Probe. Não descarte o sobrenadante. Transfira o sobrenadante (cerca de 53 μL) contendo ARN empobrecido de rRNA para um novo tubo.
   15. Meça a concentração do rendimento do RNA por um espectrofotômetro.
4. Use uma metade das amostras esgotadas por rRNA como entrada para grânulos magnéticos contendo oligo (dT) 25 para extrair polyA⁺ RNA da seguinte maneira:
   Nota: Este protocolo de isolar o RNA do mensageiro da cauda de Polya usando as seqüências do DT do oligo limitados à superfície de grânulos magnéticos foi cooptado de um jogo comercialmente disponível (tabela dos materiais).
   1. Ressuspender os grânulos de oligo dT no frasco por um breve vortexing por > 30 s e transferir 200 μL de grânulos de oligo dT para um tubo. Adicione o mesmo volume (200 μL) de buffer de ligação e ressuscitem.
   2. Coloque o tubo em um ímã por 1 min e descarte o sobrenadante. Agora, retire o tubo do íman e ressuspender as esferas de oligo dT lavadas em 100 μL de tampão de ligação.
   3. Ajuste o volume da amostra total de RNA de entrada rRNA esgotada para 100 μL com 10 mM de Tris-HCl pH 7,5. Agora, adicione 100 μL de buffer de ligação.
   4. Aqueça ao ° c 65 por 2 minutos para interromper estruturas secundárias do RNA. Agora, imediatamente coloque no gelo.
   5. Adicione o 200 μL do RNA total ao 100 μL de grânulos lavados. Misture completamente e permita a ligação girando continuamente em um rotor por 5 minutos em RT.
   6. Coloque o tubo no íman durante 1-2 min e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante.
   7. Retire o tubo do íman e adicione 200 μL de tampão de lavagem.
5. Meça a pureza e a concentração da polyA⁺ RNA extraída por um espectrofotômetro.
   Nota: uma relação 260/280 de 1.90 − 2.00, e uma relação 260/230 de 2.00 − 2.20 para todas as amostras do RNA são consideradas aceitáveis.
6. Use a metade restante das amostras esgotadas por rRNA da seção 3,3 como entrada para proteínas a colunas (fornecidas no kit de imunoprecipitação de RNA [RIP], tabela de materiais) para imunoprecipitados cinco-Prime tampado RNAs usando monoclonal 7-metilguanosina anticorpo da seguinte forma:
   Nota: Este protocolo de isolar m7G tampou o RNA do mensageiro usando um jogo comercialmente disponível da imunoprecipitação do RNA foi cooptado e modificado mais.
   1. Lave a proteína a grânulos magnéticos obtidos a partir do kit RIP de acordo com o protocolo do fabricante para pré-ligar o anticorpo para as contas.
   2. Transferência de 3 μg de 7-metilguanosina anticorpo (coelho IgG fornecido no kit pode ser usado o controle negativo) para os grânulos em um tubo de microcentrífuga suspenso em 100 μL tampão de lavagem do kit.
   3. Incubar com rotação de baixa velocidade por 30 min em RT. tubos de centrifugação brevemente e, em seguida, coloque os tubos em um separador magnético, retire e descarte o sobrenadante.
   4. Retire os tubos e adicione 500 μL de tampão de lavagem do kit e do vórtice brevemente. Centrifugue os tubos brevemente seguidos pela separação magnética mais uma vez, retire e descarte o sobrenadante.
   5. Repita o passo 3.6.4 novamente.
   6. Adicione ao redor 120 ng do rRNA esgotado (da seção 3,3) aos grânulos ligados do anticorpo da 7-methylguanosine pré-lavado. Adicionar 1 μL de inibidor de RNase. Incubar em RT para 1 − 1,5 h com agitação ligeira.
   7. Gire para baixo os grânulos em 300 x g para 10 s e remova o sobrenadante que contem o mRNA (non-7-methylguanosine) untampado a um tubo novo do microcentrifugador.
   8. Adicionar 100 μL de tampão de lavagem e lavá-lo mais duas vezes da mesma forma. Piscina o sobrenadante coletado no mesmo tubo de microcentrífuga rotulado de mRNA (não-7-metilguanosina) sem tampos. Guarde no gelo.
   9. Elute o mRNA tampado (7-methylguanosine) dos grânulos com 300 μL do tampão do lysis do Urea (ULB) que contem a ureia de 7 M, o SDS de 2%, o NaCl de 0,35 M, o EDTA de 10 milímetros e o Tris de 10 milímetros, pH 7,5 aquecendo os grânulos em 65 ° c por 2 − 3 minutos
   10. Misturar 300 μL das amostras eluidas (mRNA tampado e não tampado) com 300 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1; disponível comercialmente) (armazenado a 4 ° c). Misture bem invertendo e deixe por cerca de 10 min, em seguida, misture novamente suavemente.
   11. Centrifugue a 18.928 x g durante 2 min e Pipete cuidadosamente a camada superior para o tubo fresco e elimine a camada inferior.
   12. Adicionar 300 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1; armazenado a 4 ° c) nas amostras. Misture bem invertendo e Centrifugue então em 18.928 x g por 1 minuto. com cuidado, pipeta a camada superior a um tubo fresco e descarte a camada inferior.
   13. Adicionar 300 μL de 2-porpanol e 30 μL de acetato de sódio a 3 M (pH 5,2) ao RNA tampado e não tampado. Inverta a amostra algumas vezes e colocá-lo em-20 ° c por 20 h.
   14. Agora, Centrifugue as amostras em 18.928 x g por 10 min a 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante e adicione 500 μL de 70% de etanol.
   15. Centrifugue novamente a 18.928 x g durante 10 min a 4 ° c. Elimine cuidadosamente o sobrenadante e seque o pellet em RT por menos de 5 min. ressuscitem o pellet em água sem nuclease.
7. Meça a pureza e a concentração do rendimento do RNA por um espectrofotômetro. A relação 260/280 deve estar na escala de 1.90 − 2.00, e a relação 260/230 na escala de 2.00 − 2.20 para todas as amostras do RNA.

4. ensaio confirmatório para avaliar a resposta do rato TE^{definitivamente} modelo para a morte celular mediada FasL

1. Semente número igual (30.000 células) de flavopiridol tratados células de melanoma de rato B16/F10 e células de melanoma de rato B16/F10 parental numa placa de cultura 96-well no respectivo meio correspondente (DMEM), e incubar durante a noite num 37 ° c, 5% CO₂ humidificado Incubadora.
2. Trate as células em uma capa de cultura com diferentes concentrações de h_his6fasl (0.1 − 1000 ng/ml) na presença de 10 μg/ml anti-his anticorpo e incubar para 24 h em 37 ° c, 5% co₂ umidificado incubadora.
3. Remova as pilhas inoperantes lavando com tampão de PBS 1x. Fixar as células anexadas em 4% paraformaldeído por 20 min em RT. descarte o paraformaldeído a 4% (sem necessidade de lavagem), e mancha com solução de violeta cristalina (20% metanol, 0,5% cristal violeta em 1X PBS) por 30 min.
4. Retire o excesso de mancha delicadamente enxaguando as placas em água da torneira. Mantenha as placas para secar no RT.
5. Re-dissolver a violeta de cristal em 100 μL de 1x surfactante nonionic dissolvido em 1X PBS, e medir a densidade celular medindo a absorvência em 570 nm em um leitor de microplacas.

5. ensaio exploratório para avaliar a resposta do rato TE^{definitivamente} modelo de ataque de células T citotóxicas específicas do antígeno

1. Isolamento e ativação do ataque de células T citotóxicas OT-I CD8 + (CTL)
   1. Purify pilhas de CD8 + dos baços de OT-I TCR TG RAG-1 −/− ratos pela separação da pilha magnética usando um jogo de isolação da pilha de T CD8 do rato como segue:
      1. Colha dois baços de dois camundongos OT-I TCR TG RAG-1 −/− em meios completos de RPMI.
      2. Mash os baços em um filtro de 70 μm mantido em um tubo de 50 mL enchido com 20 mL de RPMI, usando a parte traseira de uma seringa até que somente a gordura esteja deixada para trás no filtro.
      3. Centrifugue o fluxo através de 220 x g por 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
      4. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) à pelota do baço da etapa de centrifugação anterior e Pipete a mistura durante 1 min.
      5. Neutralize a solução adicionando até 10 mL de RPMI.
      6. Centrifugador a 220 x g durante 5 min a 4 ° c. Descartar o sobrenadante e ressuscitará em 10 mL de RPMI.
      7. Pegue uma pequena alíquota para contar. Centrifugue o restante a 220 x g durante 5 min a 4 ° c.
      8. Para cada milhão de células contados, Ressuspender a pelota em 1 mL de buffer de sistema de separação magnética comercialmente disponível (buffer Mojo ou um buffer semelhante).
      9. Prepare um coquetel de anticorpos de volume 100 μL para cada 1 mL de células peletizadas na etapa 5.1.1.8. O coquetel de anticorpos inclui: biotina anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ e CD44.
      10. Adicione este cocktail às 1 mL de células peletizadas e mantenha-se no gelo durante 15 min.
      11. Adicionar 100 μL de grânulos magnéticos (streptavidin) a cada 100 μL do cocktail de anticorpos adicionado às células do baço com resuspensão de 1 mL. Mantenha no gelo por 15 min.
      12. Adicione 7 mL de amortecedor de sistema de separação magnética comercialmente disponível. Agora, alíquota aproximadamente 3 − 4 ml da mistura a um tubo fresco. Misture bem e corrigi-lo para o ímã por 5 min.
      13. Decantar o líquido (contém células CD8 +) a um tubo fresco no gelo. Agora, alíquota os 3 − 4 ml restantes da mistura da etapa 5.1.1.12 ao tubo e fixá-lo ao ímã por 5 min. decantar o líquido (segundo lote de células CD8 + isoladas) para o mesmo tubo contendo o primeiro lote de células CD8 + mantidas no gelo.
   2. Fibroblastos aderentes projetados para sementes APC-(MEC. B7. Sigova) linha para expressar um específico ovalbumina (OVA)-derivado, H-2KB-restrito peptídeo epítopo mapeado OVA257-264 (siinfekl), juntamente com a molécula co-estimulatória b 7.1, em 75.000 células por poço em 24-placas bem, a 37 ° c, 5% co₂ humidificada incubadora.
      Nota: o fibroblasto aderente utilizado é um presente do laboratório do Dr. Edith Janssen na CCHMC. A linha foi criada originalmente no laboratório do Dr. Stephen P. Schoenberger no Instituto La Jolla para alergia e Imunologia⁶.
   3. Após 24 h, lave a monocamada de APC uma vez com o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) comercialmente disponível com tampão de HEPES, piruvato de sódio, L-glutamina e glicose elevada), e adicione 0,5 x 10⁶ pilhas de OT-I CD8 + ingênuas (da etapa 5.1.1.13) em 2 ml de imdm suplementado com 50 mM β-ME, 2 mL de EDTA, 4 mM L-glutamina e HEPES e 10% FBS.
   4. Após 20 h, colher suavemente as células OT-I não aderentes (coletando a mídia no prato de cultura com células de OT-I flutuantes e granulação das células em 191 x g por 2 min; contar as células OT-i viáveis) e transferi-las para a cocultura.
2. Co-cultura de células CD8 + com células B16/F10-OVA
   1. Células CD8 + derivadas de sementes de OT-I em uma proporção de 1:1 (300.000 células cada) em uma cocultura com B16/F10 (faltando o ovalbumin do antígeno), B16/F10-OVA não tratada e células B16/F10-OVA pré-tratadas com flavopiridol (25 nM) por 1 semana, em pratos de 6 poços com DMEM completo mídia por 20 h a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ humidificada.
   2. Após 20 h, remova as células CD8 + derivadas de OT-I (coletando a mídia no prato de cultura com células CD8 + derivadas de OT-I flutuantes). Lave as células B16/F10-OVA aderentes em 1X PBS.
   3. Trypsinize os três grupos de células B16/F10-ova anexadas em 0, 5% EDTA contendo tripsina por 5 min. pellet as células tripsinizadas em 191 x g por 5 min.
   4. Manchar as células B16/F10-OVA colhidas incubando-as em PBS frio (contendo 0,5% de FBS e 0, 5% de azida sódica) com corante de viabilidade e anticorpos rotulados relevantes (viabilidade fixável coloração corante E780, rato AF647-conjugado CD8 e BV421-conjugated mouse CD45 ).
   5. Analisar a viabilidade dos três grupos de células B16/F10-OVA por citometria de fluxo.

Resultados

Aqui, fornecemos um esquema detalhado (Figura 1) para estabelecer um modelo te^{definitivamente} celular obtido por um tratamento subletal crônico (Figura 2) com flavopiridol a 25 nm. Na Figura 3, em 3 dias de tratamento com flavopiridol, células de ova B16 apresentam características parciais de te^{definitivamente} , mas após uma semana de tratamento, as células de ova B16/F10 m...

Discussão

O controle de alongamento do RNA Pol II surgiu como uma alavanca decisiva para a regulação da expressão gênica responsiva ao estímulo ao benefício das células malignas^5,7,8. Superar o promotor-a pausa proximal ao alongamento e subsequente produção de mRNA requer a atividade da quinase de P-tefb^9,10,11. Nosso modelo utiliza flav...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 well plates	Falcon	353043
20% methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-well plates	Falcon	351147
4–18% SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% dry milk	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosine antibody	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend	100727
antibiotic and antimycotic	Gibco	15240-062
anti-His antibody	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead staining dye e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	Dilution 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
total H3	Cell Signaling	4499	Dilution 1:2000
Tri reagent	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	Cell Signaling	12620S	Dilution 1:5000
β-ME	G Biosciences	BC98