Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Resumo

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Resumo

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção de moléculas de origem não-auto. Para este fim, eles estão equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect como o reagente de transfecção e os ácidos nucleicos transinfectados são muitas vezes reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Portanto, a transfecção muitas vezes resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio dos macrófagos. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários de urina, como macrófagos peritoneal (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA in vitro transcrito de modelos de DNA, como plasmídeos. Com esse protocolo simples, as taxas de transfecção de cerca de 50-65% para PM e cerca de 85% para BMDM são alcançadas sem citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes a geração de mRNA para transfecção a partir de construções de DNA, como plasmídeos e o procedimento de transfecção.

Introdução

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção, ingestão e degradação de micróbios, células apoptóticas e detritos celulares. Além disso, eles ajudam a orquestrar as respostas imunes, secretando citocinas e quimiocinas e apresentando antígenos às células T e células B. Macrófagos também desempenham papéis importantes em inúmeros outros processos, como cicatrização de feridas, aterosclerose, tumorigênese e obesidade.

Para ser capaz de detectar moléculas não-auto, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e moléculas fora do local, como padrões moleculares associados a danos (DAMPs), macrófagos são equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRR)¹. Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect² como o reagente de transfecção³ e os ácidos nucleicos transinfectados^4,5,6,7 muitas vezes são reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Por esta razão, a transfecção de macrófagos usando métodos químicos ou físicos⁸ geralmente resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio de macrófagos via piroptose, uma forma de morte programada de células líticas desencadeada após o reconhecimento de PAMPs citosólicos/ DAMPs como DNA ou^RNA9 estrangeiros . Transfecção biológica de macrófagos usando vírus como adenovírus ou lentivírus como vetores é muitas vezes mais eficiente, mas a construção de tais vetores virais é demorado e requer biossegurança nível 2 equipamento^10,11.

Assim, embora os macrófagos sejam objeto de intensa pesquisa, a análise de suas funções no nível molecular é dificultada porque uma das ferramentas mais importantes da biologia molecular, a transfecção de construções de ácido nucleico para expressão exógena de proteínas, não é aplicável. Isso muitas vezes força os pesquisadores a usar linhas celulares semelhantes a macrófagos semelhantes a macrófagos de macrófagos de boa-fé. As aplicações para a transfecção de construção de ácido nucleico incluem expressão de versões proteicas mutadas ou marcadas, superexpressão de uma proteína específica, reexpressão proteica em um respectivo contexto nocaute e expressão de proteínas de outras espécies (por exemplo. , Cre recombinando ou guia RNA e Cas9 para nocaute genético alvo).

Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários (geralmente difíceis de transfect), que são macrófagos peritoneal murine (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA geradoa a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. Importante, o mRNA transcrito in vitro gerado usando este protocolo contém os nucleosídeos modificados naturais 5-metil-CTPe pseudo-UTP que reduzem a imunogenicidade e aumentam a estabilidade^{4,6,7,12, 12}. Além disso, as extremidades de 5 do mRNA transcrita in vitro são desfosforilado pela fosfatase antártica para evitar o reconhecimento pelo complexo RIG-I^14,15. Isso minimiza o reconhecimento imunológico inato do mRNA transcrito in vitro. Com nosso protocolo fácil de executar, as taxas de transfecção entre 50-65% (macrófagos peritoneal (PM)) e 85% (BMDM) são alcançadas enquanto, importante, não há citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes (i) como o mRNA imunologicamente silenciado para transfecção pode ser gerado a partir de construções de DNA, como plasmídeos e (ii) o próprio procedimento de transfecção.

Protocolo

O isolamento de macrófagos de camundongos foi realizado de acordo com a Lei de Proteção animal da Alemanha, em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade de Colônia.

Nota: Realizar todas as etapas usando luvas. Realize todas as etapas de transfecção um capô de fluxo laminar para evitar a contaminação das células. Antes de trabalhar com mRNA, limpe todos os instrumentos, como pipetas e cada superfície com 70% de etanol e/ou um surfactante rnase-degradante(Tabela de Materiais). Certifique-se de que todos os tubos de reação são livres de RNAse e estéreis. Use apenas água estéril, livre de RNAase para diluições. Use exclusivamente dicas de pipeta com filtros. Mude as pontas da pipeta após cada passo de tubulação.

1. Geração do modelo de DNA

Nota: O modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando este protocolo deve conter uma seqüência promotor T7 para permitir a atracação da polimerase RNA. Se o plasmídeo contendo a seqüência de DNA da proteína de interesse já contém uma sequência de promotor T7 corretamente orientada diretamente a montante da seqüência de interesse, a linearização do plasmídeo (ver passo 1.1.) precisa ser realizada. Caso contrário, anexar um Promotor T7 para a seqüência de interesse por reação em cadeia polimerase (PCR, ver passo 1.2.).

1. Linearização dos plasmídeos contendo T7 promotor
   1. Linearize plasmids já contendo uma seqüência corretamente orientada T7 promotor por digestão com uma enzima de restrição corte a jusante do codon parada da seqüência de interesse. Caso contrário, a transcrição não terminará corretamente após a seqüência de interesse.
      Nota: É melhor usar enzimas de restrição deixando pontas contundentes ou 5' saliências.
   2. Confirme a linearização completa do plasmídeo por eletroforese de gel agarose de DNA plasmídeo não digerido versus digerido.
   3. Purify linearizado plasmid DNA antes de usar como modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando um kit de purificação de DNA(Tabela de Materiais).
2. Anexo do Promotor T7 por PCR
   1. Use uma cartilha para a frente contendo os seguintes componentes (na ordem indicada de 5 a 3'): cerca de 5 bp aleatório a montante do promotor (por exemplo, GAAAT); a sequência do Promotor T7 (TAATACGACTCACTATAG); dois Gs extras para maior eficiência de transcrição (GG); a parte específica da sequência de alvos que é homóloga para a sequência plasmídea em torno do codon inicial.
      Nota: Deve ser composto de: 3-6 bp a montante da seqüência KOZAK e começar codon, a seqüência KOZAK e começar codon (geralmente GCCACC ATG G), 12-18 bp a jusante do codon início. Se a seqüência de interesse ainda não contém uma seqüência KOZAK ou iniciar codon, estes podem ser anexados nesta etapa, simplesmente incluí-los na seqüência primer.
   2. Calcule o t_m da cartilha para a frente apenas levando em conta a parte homologous à sequência de destino.
   3. Para avaliar dimers / formação hairpin usar toda a seqüência primer, que facilmente pode exceder 50 bp.
   4. Use uma cartilha reversa localizada em algum lugar a jusante do codon da parada.
      Nota: Se a seqüência de interesse já não contém um codon stop, ele pode ser anexado nesta etapa, simplesmente incluí-lo na seqüência primer.
   5. Use as cartilhas para a frente e reversa para realizar um PCR usando uma polimerização de alta fidelidade com revisão(Tabela de Materiais).
   6. Confirme a geração de um único produto e tamanho amplicon por eletroforese de gel agarose (por exemplo, use um gel agarose de 1% e uma corrente constante de 100 V).
   7. Purifique o produto PCR antes de usar como modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando um kit de purificação de DNA.

2. geração mRNA

1. Descongele todos os componentes do kit de transcrição in vitro mRNA (veja a Tabela de Materiais). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g. Mantenha o gelo até usar.
2. Prepare a mistura de reação para transcrição in vitro mRNA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL na ordem seguinte (volume total de 40 μL): 20 μL de 10x ARCA/NTP mix (incluído no kit de transcrição in vitro mRNA); 0,25 μL de 5-metil-CTP (concentração final (f.c.) é de 1,25 mM; 50% do ctp total); 0,25 μL de pseudo-UTP (f.c. é de 1,25 mM; 50% do total utp); X μL de modelo de DNA; 2 μL de mistura de polimerase T7 RNA (incluída no kit de transcrição in vitro mRNA); Y μL de RNAse-livre H₂O.
   Nota: X é um volume contendo pelo menos 1 μg de DNA. Por exemplo, 1,6 μL de uma solução de ações de 625 ng/μL. Y é o volume de reposição para o volume total de 40 μL.
3. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g. Incubar a 37 °C por 30 min a 400 rpm em uma batedeira térmica para transcrição in vitro.
4. Em seguida, adicione 2 μL de DNase eu diretamente na mistura de reação para a remoção do DNA modelo. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
5. Incubar a 37 °C por 15 min a 400 rpm em uma batedeira térmica. Pegue um alibamento de 2 μL para o gel de controle (passo 3.3) e guarde a -80 °C.
6. Para o rejeito poli (A), adicione os seguintes componentes diretamente na mistura de reação anterior (a um volume final de 50 μL): 5 μL de 10x poli (A) buffer de reação polimerase e 5 μL de poli (A) polimerase (ambos incluídos no kit de transcrição in vitro mRNA). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
7. Incubar a mistura em 37 °C para 30 min em 400 rpm em um thermomixer. Pegue um alibamento de 2 μL para o gel de controle (passo 3.3) e guarde a -80 °C.
8. Para a desfosforisfolação das 5 ́-extremidades do mRNA, adicione os seguintes componentes diretamente no mix de reação anterior (a um volume final de 60 μL): 3 μL de H₂O livre de RNAse; 6 μL de 10x tampão de reação de fósforo antártico; 3 μL de fósforo antártico (15 unidades para 60 μL volume de reação). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
9. Incubar a mistura em 37 °C para 30 min em 400 rpm em um misturador térmico.
10. Fósforo antártico inativa calor por incubação a 80 °C por 2 min.
    Nota: Idealmente, use uma batedeira térmica separada, não espere até que o primeiro misturador atinja a temperatura desejada.

3. purificação mRNA

1. Purifique o mRNA transcrito in vitro usando um kit de purificação de RNA dedicado(Tabela de Materiais).
   1. Adicionar X μL de solução de elução para a mistura de reação mRNA do passo 2.10. Misture invertendo 5 vezes. Adicione 300 μL de concentrado de solução de ligação. Misture por pipetting suave 5 vezes.
      Nota: X é o volume de reposição a um volume total de 100 μL. Por exemplo, adicione a solução de elução de 40 μL ao mix de reação de 60 μL mRNA.
   2. Adicione 100 μL de etanol rnaase-livre. Misture por pipetting suave 5 vezes.
   3. Coloque uma coluna de filtro em um dos tubos de coleta fornecidos. Transfira a mistura de reação mRNA suavemente para o centro do filtro sem tocar no filtro. Centrífuga a 15.000 x g por 1 min à temperatura ambiente (RT).
   4. Levante cuidadosamente a coluna do filtro e descarte o fluxo no tubo de coleta. Coloque a coluna de filtro de volta para o mesmo tubo de coleta.
   5. Adicione 500 μL de solução de lavagem (não se esqueça de adicionar 20 mL de etanol rnaase-livre antes de usar a solução de lavagem pela primeira vez).
   6. Centrífuga em 15.000 x g para 1 min em RT. Repita etapas 3.1.4-3.1.6 para lavar mais uma vez.
   7. Centrífuga a toda velocidade (17.900 x g)por 1 min na RT para remover qualquer fluido residual da coluna de filtro. Retire cuidadosamente a coluna de filtro do tubo de coleta. Coloque a coluna de filtro em um novo tubo de coleta.
   8. Adicione 50 μL de tampão de elução no centro do filtro sem tocar no filtro. Incubar a 65 °C por 10 min em uma batedeira térmica.
   9. Centrífuga a 15.000 x g por 1 min na RT. Retire a coluna de filtro e descarte-a.
2. Medir a concentração e pureza do mRNA eluted, por exemplo, usando um espectrômetro de microvolume para medir a absorção em 260 e 280 nm.
   Nota: Uma relação A260/A280 de 1,8-2,1 é indicativa de mRNA altamente purificado.
3. Verifique a presença de um único produto, comprimento correto da transcrição e poli (A) que segue analisando os aliquots das etapas 2.5 e 2.7 pela eleforese do gel do agarose circunstâncias de denaturing (por exemplo, use um gel de agarose de 1.2% que contem 20 mM 3-(N-morpholino) ácido propanesulfonic [MOPS], acetato de sódio de 5 mM, 1 mM EDTA e 20% formaldeído e executado em 20 mM MOPS, 5 mM acetato de sódio, 1 mEDTA e 0,74 % formaldeído em 100 V corrente constante).
4. Guarde o mRNA purificado no tubo de elução a -80 °C até a transfecção. Se usar apenas quantidades baixas do mRNA para transfecção, em seguida, abitar o mRNA para evitar ciclos repetidos de congelamento-degelo.
   NOTA: mRNA pode ser armazenado a -80 °C por cerca de 1 ano.

4. Preparação de macrófagos

1. Eutanásia c57/bl6 camundongos (uso de ratos do mesmo sexo e de 6-24 semanas de idade) por luxação cervical.
   Nota: Os mesmos camundongos podem ser usados para isolamento de PM (passo 4.2) e geração de BMDM (etapas 4.3 e 4.4). Para o isolamento da PM usar pelo menos dois ratos. Se somente BMDM deve ser gerado um rato é geralmente bastante.
2. Enriquecimento imunológico de macrófagos peritoneal.
   1. Encha uma seringa de 10 mL com uma cânula de 0,9 x 40 mm com 8 mL de solhafilógico gelado (PBS) e 2 mL de ar. Lave a cavidade peritoneal com PBS. O ar formará uma bolha que minimiza o vazamento da PBS.
   2. Coletar rapidamente a lavagem peritoneal com a mesma seringa e transferir para um tubo de centrifugação cônica de 50 mL. Combine células peritoneal de vários ratos, se necessário. Mantenha a suspensão celular no gelo.
   3. Suspensão celular centrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 5 mL de 0.2% NaCl para 30 s para lyse glóbulos vermelhos.
   4. Adicionar 5 mL de 1,6% NaCl a um volume total de 10 mL para reconstituir condições isotônicas. Centrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C.
   5. Descarte o ácido supernatant e resuspenda a pelota celular em 97,5 μL de tampão de classificação de células magnéticas (MCS) (2 mM de etilediaminatetraacetic ácido [EDTA], 5% albumina de soro bovina [BSA] em PBS) por 1 lavage peritoneal (por exemplo, se três camundongos foram liberados, resuspendem em 292,5 μL ).
   6. Adicione 2,5 μL de contas paramagnéticas conjugadas a um anticorpo específico do CD11b por 97,5 μL de suspensão celular (por exemplo, adicione 7,5 μL a 292,5 μL).
   7. Incubar no gelo por 15 min em 150 rpm em um shaker orbital.
   8. Suspensão de célulacentrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C, descartar o supernatant e resuspender a pelota de célula em 1 mL de buffer MCS.
   9. Adicione 4 mL de tampão MCS a um volume total de 5 mL e lave as células suavemente tubulação para cima e para baixo três vezes.
   10. Repita os passos 4.2.8 e 4.2.9 duas vezes mais para um total de três etapas da lavagem.
   11. Durante a lavagem, coloque uma coluna ls em um separador de células magnéticas (ver Tabela de Materiais). Lave a coluna com 3 mL de tampão MCS.
       Nota: Evite quaisquer bolhas, pois estas podem entupir a coluna.
   12. Resuspenda a pelota de célula em 1 mL de buffer MCS. Adicione 3 mL de buffer MCS para um volume total de 4 mL, misture por pipetting cima e para baixo três vezes.
   13. Transfira os 4 mL de suspensão celular para a coluna LS enxaguada.
       Nota: Mais uma vez, evitar quaisquer bolhas como estes podem entupir a coluna.
   14. Espere até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Não adicione líquido adicional até que a coluna pare de pingar.
   15. Adicione 3 mL de buffer MCS na coluna. Em seguida, espere até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Repita o passo 4.2.15 mais duas vezes.
   16. Coloque a coluna LS em um tubo de centrifugação cônica de 15 mL. Aplique 5 mL de buffer MCS na coluna. Espere até 2 mL de fluido passou pela coluna, em seguida, usar o desentupidor para empurrar suavemente a fração restante para o tubo.
   17. Suspensão de célulacentrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatant.
   18. Resuspende a pelota celular em 1 mL de DMEM complementada com 10% de soro de vitela fetal inativado de calor (FCS) (DMEM+FCS).
   19. Determine o número de células viáveis contando em solução azul trypan em uma câmara de contagem neubauer e células de sementes em DMEM +FCS em placas de cultura.
       Nota: Semente PM em uma densidade de 100.000 pilhas/bem em uma placa inferior plana do microtiter. Não use placas tratadas com cultura de tecido, pois a PM não pode ser separada delas. Em vez disso, use placas não tratadas.
3. Geração de BMDM
   1. Retire a pele e os músculos das patas traseiras usando um par de tesouras. Lave cada perna por submersão curta em 70% de etanol.
   2. As pernas desaparam e abrem as duas extremidades do fêmur e da tíbia cortando com tesoura.
   3. Encha uma seringa de 5 mL cheia com uma cânula de 0,6 mm x 30 mm com 5 mL de endotoxina muito baixa (VLE) RPMI 1640 e jogue a medula óssea para fora dos ossos abertos em um prato de cultura.
   4. Combine a medula óssea de vários camundongos, se necessário, repetindo etapas 4.3.1-4.3.3. Transfira a medula óssea para um tubo de centrifugação cônica de 50 mL.
   5. Centrífuga a suspensão da medula óssea em 650 x g para 5 min a 4 °C e descartar o supernatant.
   6. Resuspenda a pelota celular em 5 mL de tampão de lyse de células vermelhas do sangue (8,3% NH₄Cl, 0,1 M Tris) e incubar por 5 min em RT para lyse os glóbulos vermelhos.
   7. Centrífuga a suspensão celular a 650 x g a 4° C por 5 min e descartar o supernatant.
   8. Resuspenda a pelota celular em 1 mL de VLE RPMI 1640 médio complementado com 10% FCS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% HEPES, 1% de piruvate de sódio e fator de estímulo de colônia de macrófagos recombinante de 10 ng/mL (M-CSF) (RPMI⁺⁺⁺⁺).
   9. Adicione 4 mL de RPMI⁺⁺⁺⁺⁺ a um volume total de 5 mL.
   10. Prepare 5 92 mm x 16 mm pratos de Petri não tratados com cams (veja a Mesa de Materiais)por mouse, canalizando 7 mL de RPMI⁺⁺⁺⁺ médio em cada prato.
   11. Transfira a solução de 1 mL de célula para os 5 pratos de cultura preparados e incubar a 37 °C e 5% CO₂.
   12. Após 4 dias, alimente as células adicionando 4 mL de RPMI⁺⁺⁺⁺⁺. Após 6-7 dias, as células da medula óssea são totalmente diferenciadas em BMDM.
4. Colheita de BMDM
   1. Retire completamente o meio dos pratos de cultura. Adicione 5 mL de 0,2 m MM EDTA quente em PBS para cada prato.
   2. Raspe suavemente a placa inteira com um raspador de células para separar o BMDM. Combine as suspensões celulares em um tubo de centrifugação cônica de 50 mL.
   3. Lave todos os 5 pratos novamente. Use o mesmo volume de 5 mL de 0,2 mM EDTA quente em PBS para todos os 5 pratos. Combine esta suspensão celular com a da etapa anterior.
   4. Centrífuga a suspensão celular em 650 x g para 5 min a 4° C e descartar o supernatant.
   5. Resuspender a pelota celular em 1 mL de VLE RPMI 1640 médio complementado com 10% FCS, 1% HEPES, 1% piruvato de sódio e 10 ng/mL recombinante M-CSF, mas sem antibióticos (RPMI⁺⁺⁺⁺).
   6. Determine o número de células viáveis contando em solução azul trypan em uma câmara de contagem neubauer e células de sementes em RPMI⁺⁺⁺⁺ em placas de cultura.
      Nota: Bmdm semente em uma densidade de 50.000 pilhas/bem máximo em uma placa inferior plana do microtiter. Não use placas cultura-tratadas do tecido porque BMDM pode mal ser destacado destes. Em vez disso, use placas não tratadas.

5. Transfecção de Macrófagos com mRNA

1. Calcule o volume necessário de buffer de transfecção mRNA.
   Nota: O volume de buffer de transfecção mRNA necessário depende do tamanho do poço: use 200 μL para transfecção em uma placa de 6 poços, 100 μL em uma placa de 12 poços e assim por diante. Adicione sempre um pouco de volume de reposição por causa da perda de pipetting (mas não demasiado, para impedir a diluição imprópria do mRNA). Por exemplo, use 450 μL em vez de 4 x 100 μL = 400 μL para transfect em 4 poços de uma placa de 12 poços.
2. Calcule o volume necessário de reagente de transfecção mRNA. O reagente de transfecção mRNA é adicionado a uma proporção de 1:50. Por exemplo, 9 μL de reagente de transfecção mRNA é necessário para um volume final de 450 μL.
3. Calcule a quantidade total de mRNA necessária. Pelo menos 100 ng por 100.000 macrófagos são necessários para transfecção eficiente, 200 ng funciona ainda melhor (por exemplo, 800 ng mRNA para transfect 400.000 macrófagos).
   1. Multiplique a quantidade calculada de mRNA necessária com o número total de poços que precisam ser transinfectados (por exemplo, 4 poços com 400.000 macrófagos cada: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA é necessário no total para todos os poços). Por exemplo, se o seu estoque de mRNA é 426,8 ng/μL, 7,49 μL são necessários para a transfecção ideal de 4 poços com 400.000 macrófagos cada.
4. Adicione o volume calculado de buffer de transfecção mRNA (passo 5.1.) menos os volumes para reagente de transfecção mRNA (passo 5.2) e o mRNA (passo 5.3) a um tubo de reação. Por exemplo, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL.
5. Descongele o estoque de mRNA e misture-o lançando suavemente do tubo de elução. Adicione o volume calculado de mRNA (passo 5.3) ao tubo de reação com buffer de reação mRNA (no exemplo apresentado acima: 7,49 μL em 433,51 μL).
6. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
7. Vortex o reagente de transfecção mRNA para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
8. Adicione o volume calculado de reagente de transfecção mRNA (passo 5.2) ao tubo de reação contendo o buffer de transfecção mRNA e o mRNA (no exemplo apresentado acima: 9 μL de reagente de transfecção mRNA).
9. Vortex a mistura de transfecção para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
10. Incubar por 15 min em RT.
11. Enquanto isso, substitua o meio cultural dos macrófagos por um meio de cultura fresco e quente (ver etapas 4.2.18. e 4.4.5).
12. Após a etapa de incubação 5.10, adicione a mistura de transfecção aos poços que contêm os macrófagos em um volume apropriado para o tamanho do poço (ver passo 5.1). Adicione a mistura de transfecção dropwise em um círculo de fora para o meio do poço.
13. Balance suavemente a placa, primeiro em uma vertical e depois em uma direção horizontal para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção no poço. Em seguida, incubar a 37 °C e 5 % CO₂. A síntese da proteína codificada pelo mRNA transinfectado começará logo após a transfecção. Para obter melhores resultados, incubar pelo menos 6 h.
14. Após a incubação, analise a eficiência da transfecção por microscopia (imuno)fluorescência, citometria de fluxo ou imunoblota^16,ou use os macrófagos transinfectados para o experimento de escolha.

Resultados

Usamos com sucesso este protocolo para gerar codificação de mRNA para variantes NEMO e IKKβ marcadas pela BANDEIRA para transfecção de macrófagos primários^16. Os plasmídeos codificando para o tipo selvagem marcado pela BANDEIRA (NEMO^WT)e o mutante C54/347A NEMO (NEMO^C54/374A)(ver a Tabela de Materiais)já contêm um promotor T7 na orientação correta (Figura 1A). Assim, s...

Discussão

Aqui apresentamos um protocolo para transfecção altamente eficiente de macrófagos primários geralmente difíceis de transfect com mRNA transcrita in vitro. É importante ressaltar que a transfecção dos macrófagos que utilizam este protocolo não induz a morte celular nem ativa a sinalização proinflamatória indicando que nem o reagente da transfecção nem o mRNA transinfectado são reconhecidos como não-eu.

A qualidade do mRNA é de importância fundamental para a transfecção bem-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
Recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C