Uso da imagem latente de ressonância magnética e dados da biópsia para guiar procedimentos da amostragem para o cancro da próstata Biobanking

Resumo

Este método envolve a utilização de dados diagnósticos clínicos para pacientes do cancro da próstata a fim guiar procedimentos da amostragem, quando o tecido para que segue o Prostatectomy radical. Isso supera as questões com métodos publicados anteriormente em torno da eficiência e disponibilidade de tecido fresco para uma ampla gama de aplicações a jusante.

Resumo

Métodos prévios para o tecido de próstata para, seguindo prostatectomia radical, geralmente envolveram amostragem aleatória. A fim de aumentar a eficiência, e permitir uma maior gama de aplicações a jusante, um método mais direcionado de amostragem de tecido prostático foi desenvolvido. Aqui nós usamos a imagem latente de ressonância magnética (MRI) e os dados da biópsia para alvejar áreas específicas do órgão para a amostragem. O método envolve o uso de um dispositivo de fatiamento da próstata previamente publicado que remova uma fatia transversal de 5 milímetros de uma região predeterminada da próstata, seguida pela remoção de biópsias do perfurador de 6 milímetros das áreas predeterminadas desta fatia. Essas amostras podem ser armazenadas congeladas ou fixas para fins de para, ou usadas imediatamente com 70% de confiança do conteúdo tumoral, em comparação com 10% de confiança na abordagem de amostragem aleatória. Isto permite o uso de todas as técnicas downstream padrão tais como a genômica, o proteômica ou o trabalho histológico, mas igualmente o trabalho que exige o tecido fresco tal como a imagem latente viva do tecido ou a cultura ex vivo.

Introdução

O acesso ao tecido do cancro da próstata humano da alta qualidade é uma exigência chave para conduzir a pesquisa eficaz no campo. Há um número de métodos existentes para a amostra de tecido prostático após prostatectomia radical para pesquisa. Tipicamente, estes envolvem o uso de biópsias de punção para tirar amostras aleatórias de uma fatia fresca, congelada ou fixa de tecido prostático, e confirmando retrospectivamente se o tumor está ou não presente em cada amostra por hematoxilina & eosina (H & E), conforme avaliado por um uropatologista^1,2,3,4,5. Uma revisão recente compilou uma visão geral desses métodos existentes⁶. Estes métodos são úteis para determinadas aplicações a jusante, onde o tecido pode ser armazenado e avaliado para o índice do tumor em uma data mais atrasada, tal como análises genomic da grande escala como o consórcio internacional do genoma do cancro (ICGC) e o Atlas do genoma do cancro (TCGA) ^4,7. Entretanto, estes métodos podiam ser melhorados em cima se nós fôssemos usar a imagem latente de ressonância magnética (MRI) e/ou dados da biópsia para alvejar áreas específicas da próstata para a amostragem. Isso melhoraria a metodologia de duas maneiras; em primeiro lugar, reduzindo o número de amostras de tecido coletadas, aumentando a eficiência e reduzindo a pressão sobre os departamentos de patologia e o custo do armazenamento, e em segundo lugar, permitindo que o tecido fresco seja usado imediatamente sem a necessidade de confirmação imediata de conteúdo tumoral, para novas tecnologias de ponta a jusante, como imagens de tecidos vivos, geração organóide ou cultura ex vivo. Esta necessidade da pesquisa conduziu ao desenvolvimento do método dos povos (amostras da próstata paciente para a pesquisa), e os resultados dos primeiros 84 casos biobanked usando povos foram publicados recentemente⁸. Uma variação desse método também foi publicada com um aparelho de corte impresso tridimensional (3D) e um molde específico para o paciente, a fim de facilitar a RM ex vivo no tecido pré e pós-fixação^9,10.

Protocolo

O protocolo adere às diretrizes locais e é aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa da UCL/UCLC Biobank (referência 15/YH/0311).

Nota: Como este método envolve a amostragem do tecido humano, todos os procedimentos locais em relação à ética e consentimento devem ser observados antes do início do protocolo. Os casos prostatectomia radicais podem ser incluídos se os dados de MRI e de biópsia estiverem disponíveis antes da cirurgia, com diâmetro do tumor ≥ 5 milímetros. os casos devem ser excluídos se a lesão do índice não é bem definida, isto é, somente as mudanças difusas são visíveis por MRI.

1. próstata cortando o aparelho

1. Compre o aparelho de corte da próstata (tabela de materiais). Como alternativa, imprima uma alça de lâmina usando uma impressora 3D como anteriormente publicada¹⁰.
   Nota: O dispositivo e as lâminas descartáveis usados aqui foram comprados o acordo de transferência material do Instituto da pesquisa do cancer, Londres, Reino Unido.

2. segmentação por tumor

1. Examine as notas clínicas para identificar a lesão do índice como indicado pela biópsia diagnóstica, por exemplo, posterior esquerdo.
2. Reveja imagens de MRI para medir a posição do tumor acima.
   1. Encontre a sequência em que o tumor é mais visível no plano axial, por exemplo, ponderado em T2.
   2. Percorra imagens axiais para encontrar a imagem onde o tumor é maior e imprima a imagem para referência.
   3. Na imagem coronal correspondente, medir a distância da base da próstata para a posição axial selecionada, e o comprimento total da próstata do ápice para a base (mm), e imprimir para referência.

3. coleção de Ppróstata

1. Verifique as notas do paciente para garantir o consentimento informado adequado foi obtido para este procedimento e quaisquer aplicações de investigação a jusante.
2. Após a prostatectomia radical, colete a próstata em um pote seco. Assegure-se de que nenhum formalina ou outro fixador estêve adicionado à próstata.
3. Transfira para um local estéril adequado para amostragem, por exemplo, uma capa de fluxo laminar em um laboratório de patologia.
4. Proceder à amostragem o mais rapidamente possível se o tecido fresco é necessário.
   Nota: Para determinadas aplicações (por exemplo, a avaliação do ADN que não deve degradar tão rapidamente quanto o RNA), pode ser apropriado refrigerar o espécime e tomar amostras no dia seguinte.

4. preparação do espécime

1. Prepare a capa do fluxo laminar e o instrumento de fatiamento da próstata de acordo com procedimentos locais da descontaminação, usando a técnica estéril. Aqui, pulverize 70% de etanol e limpe em todas as superfícies. Use agulhas e bipels estéreis de uso único. Use lâminas de fatiador até três vezes; Lave depois de cada uso em água quente e sabão, em seguida, spray e limpe com 70% etanol.
2. Pesar a próstata (g) usando uma escala padrão.
3. Tinta da próstata. Pinte o lado esquerdo com tinta azul e o lado direito com tinta preta. Cubra a cápsula completa e as vesículas seminais com tinta para denotar posteriormente as margens cirúrgicas.
   Nota: Os procedimentos de tinta podem variar localmente e podem ser modificados de acordo.

5. corte da próstata

1. Montar o aparelho de fatiamento inserindo as paredes perpendicularmente na base do suporte (Figura 1a).
2. Coloc a próstata de modo que a base e o vértice estejam enfrentando paredes opostas, com o lado do posterior para baixo e anterior acima. Coloc os pinos do ouro em torno da próstata. Empurre a próstata para dentro um pouco se necessário para obter um ajuste confortável, que irá apoiar a próstata durante o corte.
3. Meça o comprimento da próstata da base ao vértice, usando uma régua, e compare com o comprimento da próstata como medido por MRI. Se a próstata encolhido, aplique uma correção ad hoc à distância esperada da base à fatia transversal do alvo. Por exemplo, se o comprimento total da próstata na imagem de ressonância magnética for de 50 mm, mas quando medido com uma régua neste ponto tem encolhido para 45 mm, reduza a posição de fatiamento antecipada em 10%.
4. Medir a partir da base para a fatia transversal desejada. Escolha o pino que fica mais próximo a esta medida para cortar ao redor.
5. Vestindo luvas Chainmail para evitar ferimentos, segure o dispositivo de corte (Figura 1B), coloque as lâminas de cada lado do pino identificado e use o espaçador para manter as lâminas de 5 mm de distância. Tome a fatia lentamente e firmemente movendo as lâminas para baixo, para a frente e para trás com cursos longos (Figura 1C). Assegure-se de que uma fatia completa tenha sido separada antes de desmontar o aparelho.
6. Retire as paredes e os pinos e cuidadosamente retire a fatia para uma folha estéril de placa de cortiça usando luvas.

6. amostragem do tecido

1. Inspecione visualmente a fatia transversal e compare com a imagem axial de MRI. Em alguns casos, a área do tumor pode parecer mais pálida do que o tecido circundante.
2. Palpate a fatia transversal delicadamente. Em alguns casos, o tumor pode se sentir mais firme do que o tecido circundante.
3. Usando a imagem axial de ressonância magnética como guia, selecione uma ou mais áreas para amostragem.
4. Tome os socos da biópsia da área desejada do tecido.
   1. Usando um perfurador de 6 milímetros, empurre para baixo na área desejada do tecido.
   2. Torça o perfurador do tecido no ponto e para baixo de encontro à cortiça para assegurar a separação cheia e para usar um bisturi afiado para separar se necessário.
   3. Retire o perfurador e coloque em tubos/moldes, conforme necessário, ejectando usando o êmbolo.
   4. Repita para mais tumor e amostras benignas como exigido, com os socos estéreis separados da biópsia. Tinta os buracos onde os socos foram tomados em vermelho.
   5. Anote a posição de cada perfurador junto com o peso da próstata e todas as observações na cor/firmeza do tecido.

7. submissão da próstata para diagnósticos locais

1. Fixe a próstata à cortiça com agulhas estéreis do único-uso antes da fixação a fim impedir o encolhimento e o entortamento do tecido, que poderiam alterar a aparência das margens cirúrgicas.
2. Depois de fixar a cortiça, submeter a próstata para o departamento de histopatologia para diagnósticos clínicos padrão.

8. descontaminação de aparelhos

1. Descarte todos os equipamentos descartáveis em fluxos de resíduos biomédicos e/ou recipientes de Sharps como designados localmente.
2. Descontaminar a capota e o aparelho de corte de próstata de acordo com as avaliações de risco locais apropriadas ao tecido humano (por exemplo, pulverizando com 70% EtOH e limpando).

Resultados

O tecido de próstata fresco amostrado usando o método PEOPLE pode ser usado para uma variedade de técnicas downstream, incluindo sequenciamento genômico e cultura ex vivo. Os primeiros 59 casos amostrados usando esse método foram publicados anteriormente em comparação com uma versão anterior do método, juntamente com dados iniciais de downstream⁸. O tempo do primeiro fatiar a próstata para congelar/fixar as biópsias do perfurador aqui era aproximadamente 1 minuto, que foi mantido a um mínimo para evitar a degradação do RNA. O tempo da remoção da próstata ao fatiamento da próstata deve igualmente ser mantido a um mínimo, embora aqui este fêz exame de aproximadamente 20 minutos devido a nossos laboratórios do Theatre e da patologia que estão em posições diferentes.

Dependendo da aplicação a jusante, tipicamente pelo menos duas amostras são tomadas: uma de uma área do tecido do tumor antecipado e uma de uma área do tecido benigno antecipado. A medida chave do sucesso para o método de amostragem próprio é avaliar o índice do tumor em uma amostra dada.

Para a entrada no projeto dos genomas 100.000, uma seção manchada do tecido de H & e deve ser avaliada por um uropathologist, e a amostra deve conter pelo menos 40% de pilhas do tumor. Amostras que contenham menos de 40% de tumor ainda podem ser incluídas no projeto se forem macrodissecadas com sucesso. Dos primeiros 92 casos amostrados dessa forma, 64% continham pelo menos 40% de tumor e foram submetidos ao projeto genomes 100.000 sem macrodissecção. O DNA foi extraído e foi de rendimento e qualidade suficientes em todos os casos (tabela 1). Um subconjunto inicial de 59 dessas amostras foi publicado anteriormente em comparação com um método anterior⁸.

Para a cultura ex vivo, o tumor combinado e o tecido benigno devem ser de qualidade suficiente para resistir à cultura 72 h sem degradação significativa. As amostras múltiplas do tecido de um total de três pacientes foram cultivadas com sucesso⁸.

Figura 1: aparelho de fatiamento da próstata. Este aparelho foi obtido acordo de transferência de material do Instituto de pesquisa do câncer. (A) asparedes são inseridas perpendiculares à base, e os pinos dourados são inseridos na base que circunda a próstata (próstata não retratada). (B) as lâminas paralelas substituíveis são inseridas no punho da lâmina. (C) as lâminas passam entre os pinos de ouro, a fim de cortar uma seção de 5 mm da próstata. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	n (%)
Hit (> 40% tumor)	59 (64%)
Acerto parcial (5-30% tumor)	6 (7%)
Senhorita (0% tumor)	27 (29%)
Total	92 (100%)

Tabela 1: taxa de acerto tumoral. A taxa de batida do tumor foi determinada por um patologista do consultante que especializa-se no cancro de próstata, seguindo a revisão do tecido manchado de H & E. O índice da pilha do tumor de > 40% foi determinado para ser apropriado para a inclusão no projeto de 100.000 genomes, como por directrizes de Genomics Inglaterra.

Discussão

As etapas críticas dentro deste protocolo incluem a identificação da região do tumor para a amostragem, a medida da próstata, e a amostragem do tecido. Em primeiro lugar, a medição da RM para identificar a área correta da amostragem é fundamental. Demonstramos este método no vídeo que o acompanha; no entanto, também recomendamos a confirmação de medições com um radiologista em primeira instância. As notas clínicas desobstruídas que apontam o investigador para a área das imagens de MRI que contêm a lesão do índice são ideais. Em segundo lugar, a medida da próstata deve ser realizada com cuidado, assegurando-se de que a régua esteja prendida em um ângulo para medir o comprimento cheio da base ao vértice, paralelo ao anterior da próstata. Em terceiro lugar, as áreas do tumor devem ser confirmadas antes da amostragem inspecionando visualmente a fatia do tecido com relação à imagem original de MRI, palpando o tecido (em alguns casos a área do tumor pode sentir mais densa), e avaliando visualmente a cor do tecido (em alguns casos o tumor parecerá mais pálido do que o tecido benigno circunvizinho).

Este protocolo foi realizado na íntegra na UCL/UCLH por pesquisadores não-clínicos de pós-doutorado, um colega de patologia, consultores de patologia e técnicos de pesquisa. Em nossa experiência todos os passos do protocolo pode ser aprendido em menos de dez casos, independentemente do fundo técnico. No entanto, recomendamos a formação de um radiologista sobre a medição da RM e treinamento de um patologista em relação ao fatiamento em primeira instância. O protocolo pode ser modificado usando uma alça de corte impressa em 3D, conforme publicado anteriormente¹⁰.

As limitações potenciais da técnica incluem o risco de impedir no diagnóstico. Fatiar a próstata é um passo chave, que poderia impedir a classificação ou taxas de margem positiva se feito incorretamente. Há dois problemas potenciais aqui. Primeiramente, se toda a lesão do índice for removida e usada para a experimentação fresca do tecido imediatamente, o diagnóstico clínico rotineiro não será realizado para esta lesão e o paciente pode ser diagnosticado mal como tendo um cancro mais baixo da classe. Para evitar isso, o pesquisador deve discutir o plano amostral com o patologista consultor que revisará rotineiramente o caso, antes da amostragem, e concordará com o número e localização das amostras a serem tomadas. Os tumores pequenos podem ser excluídos localmente por esta razão. Em segundo lugar, se a cápsula prostática não é fixada corretamente para a placa de cortiça antes da fixação, isso poderia permitir que o tecido interno a protuberância para fora durante a fixação, alterando as margens cirúrgicas. Isto poderia conduzir a uma margem falsa positiva, onde o tumor restante pareça residir na cápsula puramente devido ao entortamento do tecido.

O significado desta técnica com respeito aos métodos existentes encontra-se principalmente com a segmentação do tumor. Uma série de métodos para amostragem de espécimes de prostatectomia radical foi publicada até à data; no entanto, todos estes dependem de uma abordagem de amostragem totalmente ou parcialmente aleatório^{1,2,3,4,5,6,7}. O uso de biópsia e, em particular, dados de RM aqui melhorou a eficiência, permitindo uma amostragem reduzida com maior confiança na obtenção do tecido tumoral⁸.

Futuras aplicações deste método permitem a adoção de uma gama mais ampla de técnicas a jusante do que com métodos de amostragem anteriores. Por exemplo, a disponibilidade do tecido fresco que tem uma probabilidade elevada de ser tumor significa que umas técnicas frescas mais caras e/ou labor-intensive do tecido podem ser utilizadas, porque muitas amostras não são exigidas para assegurar a presença de tumor. Isso pode incluir e não está limitado a, cultura ex vivo, ex vivo MRI, imagens avançadas e transcriptomics.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 mm biopsy punch	Fisher Scientific	13404607	Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples
Black Ink	Leica Biosystems	3801753	Tissue marking & margin dye
Blue Ink	Leica Biosystems	3801751	Tissue marking & margin dye
Chainmail hand glove	Arco	1456803	Chainmail gloves to protect hand during slicing
Cork board	Fisher Scientific	12396447	Cork board for pinning prostate to following sampling procedure
Needles	SLS (Scientific Laboratory supplies)	SYR6112	Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling
Prostate slicing aparatus	Insitute of Cancer Research, London	NA - must be obtained under MTA	A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins