Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

Resumo

Aqui, descrevemos a implementação e interpretação dos resultados de um ensaio quantitativo de auto-renovação in vitro mammosphere.

Resumo

A glândula mamária é caracterizada por uma extensa capacidade de regeneração, uma vez que passa por enormes alterações hormonais ao longo do ciclo de vida de uma fêmea. O papel das células-tronco mamárias (MaSCs) é amplamente estudado tanto no contexto fisiológico/desenvolvimentico quanto no que diz respeito à carcinogênese mamária. Nesse aspecto, os estudos ex vivo focados em propriedades do MaSC são muito procurados. As culturas mammosphere representam um substituto da formação de órgãos e tornaram-se uma ferramenta valiosa para pesquisas básicas e translacionais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração de culturas mamoesferas primárias murina e a quantidade de propriedades de crescimento do MaSC. O protocolo inclui coleta e digestão de glândulas mamárias, isolamento das células epiteliais mamárias primárias (MECs), estabelecimento de culturas primárias de mamoesfera, passaging em série, quantidade de parâmetros de crescimento da mamosphere e interpretação dos resultados. Como exemplo, apresentamos o efeito da expressão de micmy constitutiva de baixo nível sobre mecs normais, levando a uma maior auto-renovação e proliferação.

Introdução

O isolamento e a cultura in vitro das células-tronco e progenitoras epiteliais mamárias tornaram-se essenciais para a compreensão de suas propriedades na biologia celular mamária. O rastreamento de linhagem elegante e os ensaios de transplante em série permitiram o estudo de células-tronco (SCs) e outros subconjuntos de tecidos no contexto de seu nicho in vivo. No entanto, essa abordagem é demorada e requer a geração de modelos de mouse repórter^1,2,3,4,5. Portanto, a cultura in vitro e a propagação de células-tronco mamárias (MaSCs), poupando características fundamentais de caule, ou seja, capacidade de auto-renovação e diferenciação, é um dos maiores desafios no campo. Nos últimos anos, o ensaio mammosphere tem sido amplamente utilizado para modelar tanto o tecido mamato normal e o crescimento do câncer de mama, para quantificar SCs normais ou câncer (CSCs) e avaliar a sua capacidade de auto-renovação como um repórter substituto de sua atividade em seu respectivo contexto in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

O ensaio mammosphere é uma abordagem eficiente e rentável, na qual as células epiteliais mamárias recém-isoladas (MECs) são cultivadas em condições não aderentes, com a premissa de que apenas os MaSCs sobreviverão e formarão esferas em suspensão, enquanto todos os outros tipos de células morrerão por anoikis. Além disso, a capacidade de formar várias gerações de mamoesferas em passagens não aderentes em série está relacionada à capacidade de auto-renovação dos MaSCs^6,9,11. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado de um ensaio quantitativo mammosphere, que foi inicialmente desenvolvido por Dontu e colegas⁷ como uma modificação do ensaio pioneiro neurosfera¹², permitindo o crescimento de SCs putativos em condições não-aderentes, livre de soro com a adição de fatores de crescimento adequados^7,12.

Protocolo

Os procedimentos in vivo foram realizados de acordo com a diretiva da UE 2010/63 e após a aprovação do nosso comité de ética institucional (Organismo para o Bem-Estar Animal --OPBA) e do Ministério da Saúde italiano (IACUC Numbers 762/2015 e 537/2017).

1. Murine Mammary Gland Collection e Digestão

1. Para um experimento típico, sacrifique 8-10 semanas de idade ratos fêmeas virgens por inalação de CO_2. Dependendo dos objetivos do experimento, use 5-30 camundongos. Coloque os ratos em placas de dissecação um capô. Use agulhas para esticar os membros dianteiros e lavar a pele do animal com etanol.
2. Levante a pele com fórceps e realize uma incisão vertical a partir do nível da área pélvica e movendo-se até o colo do útero, deixando o peritônio intacto. Para evitar romper a pele ou o peritônio, use uma tesoura de borda redonda.
3. Cuidadosamente separar a pele do corpo com movimentos suaves da tesoura através do eixo lateral do corpo.
4. Uma vez que a pele é totalmente separada da área torácica e abdominal, realizar quatro incisões em todos os quatro membros do animal e fixar a pele com agulhas. Use a tesoura e fórceps para separar totalmente o corpo do animal da pele estendida.
5. Use os fórceps para levantar suavemente as almofadas de gordura mamárias que agora estão totalmente expostas e cuidadosamente desafiá-los da pele com a ajuda da tesoura. Colete as glândulas mamárias torácicas e abdominais inferiores de cada rato e mergulhe-as na sostena tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), em um tubo cônico de 50 mL. Recolher até 20 glândulas por tubo. Mantenha os tecidos no gelo.
   Nota: Se necessário, as glândulas podem permanecer no gelo durante a noite. Este é um ponto de parada seguro. As seguintes etapas devem ser executadas circunstâncias estéreis.
6. Prepare e filtre o meio de digestão: o meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementado com glutamina de 2 mM, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 200 u/ml colagem e 100 μg/mL hyaluronidase (ver Tabela de Materiais).
7. Transfira até 20 glândulas para uma placa de Petri de 100 mm e pique o tecido usando um bisturi ou tesoura curva. Evite transferir grandes volumes de DPBS para o prato.
8. Adicione 10 mL de digestão média para cada placa de Petri e transferir o tecido picado para um tubo cônico de 50 mL, usando uma pipeta sorológica de 25 mL.
9. Selar os tubos com parafilme e colocá-los em um rotador. Defina o rotador a uma velocidade baixa (0,03 x g)e incubar por 2,5 h a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO₂.
10. Inspecione visualmente a suspensão antes de prosseguir para os próximos passos. Se grandes pedaços de tecido permanecerem não digeridos, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min.
    Nota: Como alternativa, a digestão pode ser realizada durante a noite a 37 °C, 5% CO₂, usando uma mistura de enzimas colanase/hialuronidase suave^13.

2. Isolamento de MECs primários de murine

1. Pare o rotador e retire os tubos da incubadora. Ajuste uma ponta P1000 na abertura de uma pipeta serológica de 5 mL. Se a suspensão passar pela ponta P1000, prossiga para os próximos passos. Caso contrário, prolongue a incubação a 37 °C por mais 30 min.
2. Centrífuga a 100 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender a pelota de cada tubo em 3 mL de DPBS.
   Nota: A baixa velocidade de centrífuga permite a remoção de linfócitos e células de tecido adiposo. A manipulação suave é necessária para evitar desalojar a pelota nesta etapa.
3. Filtrar a suspensão celular em cada tubo separadamente, usando 100, 70 e 40 filtros de células μm. Em cada etapa de filtragem, lave os filtros com 2 mL de DPBS antes de coletar a passagem.
   Nota: A partir deste ponto, as suspensões celulares podem ser agrupadas e processadas juntas.
4. Centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e resuspender as células no volume restante de DPBS.
5. Vá para o glóbulo vermelho (RBC) lyse adicionando um volume igual de amônio-cloreto-potássio (ACK) lysis buffer (ver Tabela de Materiais). Misture por pipetting e incubar no gelo por até 5 min.
6. Adicione 10 mL de DPBS e centrífuga a 300 x g,por 5 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o supernatant e inspecionar visualmente a pelota. Se a pelota é branca, prossiga para o próximo passo. Caso contrário, repita o passo de lyse RBC (passo 2,5).
7. Resuspenda a pelota celular em 1-5 mL de mídia mamosphere: mamária células epitelia média basal (MEBM), complementada com glutamina 2 mM, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, 5 μg/mL insulina, 0,5 μg/mL hidrocortisona, 2% B27, 20 ng/mL epidérmica fator de crescimento (EGF), 20 ng/mL fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF) e 0,4 IU/mL heparin (ver tabela de materiais).

3. Serial Mammosphere Re-revestimento

1. Para o estabelecimento de culturas mamosphere, placa as células em cultura não-tecidotratados (adesão ultra-baixa) 6-bem placas em uma densidade de 200.000 células viáveis / mL em mamosphere médio. Incubar as células por 7-10 dias a 37 °C, 5% CO₂.
2. Prepare e filtre a solução poli-HEMA de 1% em 95% de etanol (ver Tabela de Materiais). Casaco ultra-baixa adesão de 6 pratos de poço para as seguintes passagens, adicionando 400 μL de 1% de solução poli-HEMA por poço e permitindo que o etanol seque completamente. Para melhores resultados, repita o revestimento duas vezes.
   Nota: O uso de placas não revestidas durante a primeira passagem permite a remoção seletiva de fibroblastos da cultura.
3. No final da cultura de 7 a 10 dias, recolher as mamoesferas primárias de todos os poços e centrífugas em 300 x g, por 5 min a 4 °C.
4. Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides.
   Nota: Uma incubação curta (2-5 min) da pelota da esfera em um volume baixo (0.2-0.5 mL) do trypsin ou do Accutase em 37 °C, 5% CO_2,pode ser usada para facilitar a dissociação mecânica. Prepare mammosphere médio fresco (passo 2.7) para o revestimento de cada passagem.
5. Resuspenda em 1-5 mL de mammosphere fresco médio e contar as células viáveis. Se aplicável, divida as células em grupos de tratamento ou condições de cultura.
6. Placa 20.000 células viáveis/mL em placas de adesão ultra-baixa revestidas de poli-HEMA de 6 poços e incubada a 37 °C, 5% CO₂.
   Nota: Mammospheres atingir seu tamanho máximo dentro de 5-7 dias após o revestimento celular. Quando possível, distribua as células de cada amostra ou condição para vários poços para obter réplicas técnicas. A densidade de revestimento deve ser mantida baixa para evitar a agregação celular. Um máximo de 20.000 células/mL é recomendado para placas de 6 poços e 5.000 células/mL para placas de 24 poços.
7. Após 5-7 dias, conte o número de esferas por poço. Isso pode ser feito manualmente, usando um microscópio equipado com uma lente de ampliação 10x ou usando análise de imagem digital (ver passo 4).
8. Recolher as mamoesferas de cada poço separadamente e centrífuga em 300 x g, por 5 min em 4 °C.
9. Decantar cuidadosamente o supernatant e proceder à dissociação mecânica das mamoesferas usando uma pipeta P200 com dicas filtradas. Pipeta por aproximadamente 100 vezes e inspecionar visualmente a suspensão para a presença de grandes esferóides.
10. Resuspenda em 1 mL de mammosphere fresco médio e conte as células viáveis. Piscina as células de cada amostra ou condição e repita etapas 3.6-3.10. Registre o número de células banhadas e o número de esferas e células contadas por poço para cada passagem. Proceder à etapa 5 para o cálculo de crescimento cumulativo.

4. Enumeração da esfera usando a análise digital da imagem (DIA)

1. No final de cada passagem, escaneie toda a superfície de todos os poços e adquira imagens das esferas usando uma câmera digital montada em um estereoscópio. Salve as imagens como arquivos .tif.
2. Importe as imagens de estereoscópio como uma sequência de imagem usando o ImageJ^14. Defina a escala e o tipo de imagem para 8 bits.
3. Duplice a pilha de imagens e selecione Subtrair Background do processo de guia na barra do menu. Verifique as opções Fundo claro e deslizamento parabolide e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.
4. Selecione ajustar e, em seguida, limite da imagem da guia da barra do menu. Ao clicar em Aplicar,uma janela de diálogo intitulada Converter Stack to Binary aparecerá. Selecione padrão como método e luz como pano de fundo. Verifique o limite de cálculo da caixa para cada imagem e clique no botão OK.
5. Selecione sequencialmente os comandos Watershed, Abra e Corrmoa da lista Binária o processo de guia da barra de menu. Processe todas as imagens da pilha clicando no botão Sim da caixa de diálogo que aparece.
   Nota: Esses processos permitem a segmentação visual de objetos que tocam, suavizam objetos e remoção de pixels da borda dos objetos.
6. Selecione a função Analisar partículas do menu Analise. Defina o limite de tamanho mínimo em 10.000 μm² e circularidade entre 0,50 e 1,00. Selecione a opção Elipses do menu drop-down show. Verifique Resumo, Excluir nas bordas e In situ Show e clique no botão OK. Processe todas as imagens da pilha.
7. Inspecione visualmente a correspondência das elipses com esferas e, se necessário, corrija a contagem de partículas em conformidade. Resuma as contagens de todos os quadros de cada poço para obter a contagem total de mamoesferas por poço.

5. Cálculo da Curva de Crescimento Cumulativo

Nota: O número de mamoesferas contadas em cada poço no final de cada passagem (P_N)reflete o número de células iniciando a mamoesfera semeadas no início do P_N.

1. Para cada passagem (P_N),registre o número de células banhadas e o número de células e esferas contadas por poço. Calcule o tamanho da esfera no final de cada passagem:
   tamanho da esfera P_N (células / esfera) = células contadas P_N / esferas contadas P_N
   Nota: O tamanho da esfera em P_N é uma medida do potencial proliferativo de cada célula iniciando mamosphere semeada em P_N.
2. Inferir o número de esferas banhadas dividindo o número de células banhadas para P_N pelo tamanho da esfera calculado no final da passagem anterior (P_N-1):
   esferas banhadas P_N = células banhadas P_N / esfera tamanho P_N-1
   Nota: Por convenção, o tamanho da esfera é assumido estável durante a primeira passagem da cultura (ou seja, esfera tamanho P₀ = esfera tamanho P_1). Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, use o tamanho médio da esfera no P_N-1 como denominador.
3. Calcule o número cumulativo de células e esferas para cada poço por passagem:
   número acumulado P_N = (contagem P_N / banhado P_N)X número cumulativo_P-1.
   Nota: Por convenção, número cumulativo P₀ = P₁banhado. Se vários poços forem usados como réplicas técnicas, calcule o número cumulativo médio por amostra ou condição para cada passagem.
4. Trace os pontos de dados em uma escala semilogarítica. Exibir o número de passagem (P₀ a P_N)no eixo x (escala linear) e o número cumulativo de células ou esferas no eixo y (escala logarítica).
5. Ajuste uma tendência exponencial-linha aos pontos de dados e calcule o coeficiente da determinação (R²⁾para medir o goodness do ajuste.
   Nota: A linha de tendência instalada nos pontos de dados deve aproximar-se de uma curva exponencial, como esperado para uma população celular que cresce ou morre com uma taxa constante. R² leva valores entre 0 e 1, com valores mais próximos de 1 indicando um melhor ajuste.
6. Retratam a equação da linha de tendência como uma função exponencial natural para inferir a taxa de crescimento (GR) da cultura:
   y = y₀ e^{(GR) x}, onde y₀ é o valor de y quando x = 0.

Resultados

Myc superexpressão em MECs normais, leva a um aumento da freqüência de células iniciando mamoesferas. Isto é conseguido através de um mecanismo duplo: Myc aumenta a taxa de divisões simétricas MaSC e a freqüência de reprogramação de progenitores em novos MaSCs¹¹. Para testar o efeito da baixa expressão constitutiva de Myc, usamos o modelo de camundongo transgênico Rosa26-MycER, no qual a atividade myc pode ser induzida por 4-hidroxitamoxifen (4-OHT)¹⁵. Primeiro chapeado os MECs em placas de adesão ultra-baixa de 6 poços para remover fibroblastos, na ausência de 4-OHT. Após a primeira passagem, dividimos a cultura em dois: dois poços foram mantidos sem tratamento (controle) e dois poços foram tratados com 200 nM 4-OHT (MycER). Contamos a esfera e o número de células de 5 passagens consecutivas para três experimentos independentes(Tabela 1). Os números cumulativos de células e esferas por passagem são mostrados na Tabela 2. A indução com 4-OHT leva ao aumento da esfera e das taxas de crescimento celular, como mostrado na Figura 1.

Figura 1: Resultados representativos. Esfera cumulativa (A)e células (B)curvas de crescimento de controle e mammospheres MycER. O desvio médio e padrão de 3 experiências independentes é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

		1 o revestimento			2º revestimento			3º revestimento			4º revestimento			5o revestimento
		Células banhadas	Contagem celular	Contagem da esfera	Células banhadas	Contagem celular	Contagem da esfera	Células banhadas	Contagem celular	Contagem da esfera	Células banhadas	Contagem celular	Contagem da esfera	Células banhadas	Contagem celular	Contagem da esfera
Exp1 Exp1	Controle	77,000	50,000	31	65,000	58,500	41	57,000	30,000	32	30,000	22,000	5	22,000	0	0
		77,000	81,000	41	65,000	55,000	23
	MycER MycER	77,000	31,0000	193	80,000	375,000	323	80,000	380,000	217	80,000	220,000	223	80,000	170,000	155
		77,000	110,000	142	80,000	505,000	396	80,000	270,000	149	80,000	290,000	194	80,000	250,000	160
Exp2 Exp2	Controle	75,000	75,000	71	60,000	17,000	34	28,000	45,000	29	45,000	13,000	2	13,000	0	0
		75,000	47,000	45	60,000	11,000	47
	MycER MycER	75,000	200,000	188	80,000	225,000	277	80,000	230,000	155	80,000	210,000	211	80,000	100,000	95
		75,000	250,000	192	80,000	202,500	283	80,000	305,000	185	80,000	160,000	237	80,000	100,000	133
Exp3 Exp3	Controle	82,500	130,000	121	80,000	45,000	105	80,000	110,000	86	80,000	58,500	75	58,500	58,500	78
		82,500	125,000	177	80,000	71,250	42
	MycER MycER	82,500	325,000	457	80,000	610,000	327	80,000	367,000	309	80,000	500,000	260	80,000	115,000	146
		82,500	475,000	463	80,000	455,000	392	80,000	415,000	204	80,000	470,000	295	80,000	185,000	161

Tabela 1: Números de esferas contadas e números de células banhadas e contadas em cada passagem.

Tabela 2: Cálculo de números de esferas banhadas e números cumulativos de esferas e celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. (Clique direito para download.)

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a descrição quantitativa das propriedades de crescimento do MaSC in vitro. Como exemplo, apresentamos o efeito da expressão míctica constitutiva de baixo nível nos MaSCs normais de urina. Esta abordagem, no entanto, pode ser igualmente aplicada a vários contextos. As células primárias humanas ou murine, bem como linhas celulares estabelecidas, podem ser cultivadas em condições independentes de ancoragem para estabelecer culturas mamoesferas que podem ser seriamente passagens. A superexpressão gênica e a interferência de RNA podem ser facilmente introduzidas no protocolo com a adição de um passo de transdução viral no final da primeira passagem (após o passo 3.5). Alternativamente, as células podem ser infectadas em adesão e, em seguida, banhadas como mamoesferas.

Um aspecto crítico do ensaio apresentado aqui é a densidade celular de semeadura, que deve ser baixa o suficiente para evitar a geração de agregados interferindo com a interpretação dos resultados^16,17. A morfologia das mamoesferas pode ser informativa para resolver essa ambiguidade. Apenas esferas compactas e redondas devem ser enumeradas no final de cada passagem. Tanto a circularidade dos esferóides como o tamanho devem ser levados em consideração. Utilizando o processo automatizado do DIA, esta etapa é assegurada com os limites adequados de forma objetiva e absoluta. Muitas vezes, os progenitores formarão estruturas acinares ou pequenos aglomerados de células que devem ser excluídos das contagens da mamosfera. Como regra geral, usamos um limiar de 100 μm de diâmetro. Finalmente, deve ser tomado cuidado para evitar a transferência de mammopsheres intactos ou não totalmente dissociados de uma passagem para a próxima. Por outro lado, o excesso de tubulação levará ao aumento da morte celular. Assim, se tais dificuldades forem encontradas, recomendamos o uso de trippsinização leve ou tratamento accutase e passar as esferas dissociadas através de um filtro de 40 μm para garantir a geração de suspensões unicelulares.

A eficiência de formação de esferas (SFE) tem sido usada alternativamente, como substituto da quantidade SC ou CSC ex vivo em culturas mamosphere. SFE é de fato uma medida de células-tronco como em uma determinada população celular. No entanto, representa uma abordagem menos consciente, uma vez que fornece informações apenas em pontos distintos do tempo. O cálculo dos números da esfera cumulativa e a geração de curvas cumulativas de crescimento, em vez disso, possibilita a inferência da taxa de crescimento da cultura a partir do passo inicial de semeadura celular até que a cultura esgote ou, no caso de culturas imortalizadas, para o número desejado de passagens. A avaliação das propriedades de crescimento permite a avaliação do desvio do crescimento exponencial através do coeficiente R² e, em uma segunda etapa, a avaliação do próprio valor gr.

Importante, curvas cumulativas do crescimento da mammosphere podem ser usadas para avaliar o efeito de inibidores pequenos da molécula ou de outras drogas quimioterápicas seletivamente no nível^6,11de CSC. Ao contrário das mamoesferas primárias normais, que funcionalmente esgotam em 5-7 passagens, as mamoesferas tumorais tendem a se expandir indefinidamente. Esse recurso está vinculado à capacidade ilimitada de autorenovação do CSC. Os efeitos sobre a proliferação e a auto-renovação do CSC podem ser dissociados através da geração de curvas de crescimento de células tumorais e mamoesferas, respectivamente. Espera-se que um efeito específico do CSC resulte em uma diminuição da taxa cumulativa de crescimento da mamoesfera, com ou sem efeito sobre a taxa de crescimento cumulativo das células^6,11.

Finalmente, outra área de interesse é a do tecido adulto SC reprogramação. Mammospheres totalmente crescidos consistem em uma população de células fenotipicamente heterogêneas, em que apenas uma pequena fração retém características semelhantes às de tronco, incluindo a capacidade de iniciação da mamoesfera e regeneração da glândula mamária após o transplante in vivo^6,9,11,18,19. Os progenitores mammary podem ser isolados assim usando ensaios in vitro da etiqueta-retenção^6,9,11 ou, ex vivo, usando marcadores de superfície estabelecidos^2,3. Notavelmente, progenitores mamárias não sobrevivem à anôikis e são incapazes de formar mamoesferas. A expressão forçada de Myc foi mostrada conferir o potencial da iniciação do mammosphere aos progenitores mammary isolados como PKHneg^11,tendo por resultado a geração de uma cultura que possa ser passagem indefinidamente. Da mesma forma, a interferência de reguladores negativos da reprogramação fisiológica pode ser testada usando o mesmo ensaio. Neste contexto, um problema comum que pode surgir é o número limitado de entrada celular. Se a entrada da célula for inferior a 10.000 células, recomendamos a semeadura em placas de 24 poços (no máximo 5.000 células viáveis/mL). No entanto, as condições de cultura independente de ancoragem podem ser provadas como muito duras para marcar a reprogramação, especialmente nos casos em que o efeito de reprogramação não é imediato. Nesses casos, o uso de uma matriz de suporte e culturas organóides tridimensionais poderia ser mais apropriado^20.

No geral, o ensaio mammosphere é uma opção rentável que pode ser facilmente empregado para marcar propriedades semelhantes a caules em populações mec normais e tumorais. A abordagem quantitativa tomada neste protocolo facilita as comparações entre culturas realizadas em diferentes condições ou expostas a diversos estímulos. Quando seguido rigorosamente, ele fornece um sistema de modelo ex vivo relativamente simples que permite a desacoplamento dos múltiplos jogadores que definem propriedades de haste in vivo, oferecendo a possibilidade de estudos mecanicistas mais detalhados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysis buffer	Lonza	10-548E	Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.
B27	Invitrogen	17504-044	B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.
bFGF	Peprotech	100-18B	Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.
Collagenase	Sigma	C2674	Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.
DMEM	Lonza	12-614F	Dulbecco's modified Eagle's medium
DPBS	Microgem	S17859L0615	Dulbecco's phosphate buffered saline
EGF	Tebu-Bio	AF-100-15	Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.
Glutamine	Lonza	17-605E	L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.
Heparin	PharmaTex	34692032	Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.
Hyaluronidase	Sigma	H4272	Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Insulin	SAFCBiosciences	91077C	Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Low attachment 6-well plates	Corning	351146	Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.
MEBM	Lonza	CC-3151	Mammary epithelial cell growth basal medium
Penicllin-Streptomycin mixture	Lonza	17-602F	Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.
Poly-HEMA	Sigma	P3932	Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use.