Mapeando a homogeneidade regional e a conectividade funcional do córtex visual na fMRI em estado de repouso

Resumo

Apresentamos um protocolo de análise de dados de ressonância magnética funcional para investigar alterações espontâneas da atividade neural em pacientes com retinite pigmentosa usando um método combinado de homogeneidade regional e conectividade funcional.

Resumo

Um método combinado de homogeneidade regional (ReHo) e conectividade funcional (FC), um tipo de método de ressonância magnética funcional não invasiva (fMRI), tem sido usado para avaliar alterações síncronas da atividade neuronal na retinite pigmentosa (RP). O objetivo deste estudo é descrever nosso método para análise de sincronizações intra e inter-regionais de alterações na atividade neuronal em pacientes com FR. As vantagens do método combinado ReHo e FC são que ele é não invasivo e suficientemente sensível para investigar mudanças na atividade neuronal cerebral síncrona in vivo. Aqui, 16 pacientes com RP e 14 controles saudáveis com idade e sexo Dois testes t de amostra foram realizados para comparar ReHo e FC entre os grupos. Nossos resultados mostraram que a desconexão da rede visual e a reorganização da via retino-tálamo-cortical e do fluxo visual dorsal ocorreram nos pacientes com FR. Aqui, descrevemos os detalhes desse método, seu uso e o impacto de seus principais parâmetros passo a passo.

Introdução

A ressonância magnética funcional (fMRI) é um método não invasivo que pode ser usado para investigar alterações na função e estrutura cerebral in vivo. A homogeneidade regional (ReHo) e a conectividade funcional (FC) são frequentemente usadas para avaliar as sincronizações intra e inter-regionais da atividade cerebral. ReHo, uma metodologia de fMRI em estado de repouso, é usada para calcular a similaridade entre a série temporal de um determinado voxel e seus vizinhos mais próximos, o que reflete a sincronização local das atividades cerebrais¹. FC é usado para investigar a semelhança entre séries temporais regionais espacialmente remotas².

A tecnologia fMRI pode oferecer uma avaliação objetiva da função visual no contexto do tratamento de doenças oculares. Aqui, apresentamos um protocolo metodológico que combina os métodos ReHo e FC para compartilhar essa experiência e apoiar a disseminação de nossa expertise. No presente trabalho, utilizamos o protocolo ReHo e FC em indivíduos com retinite pigmentosa (RP) e controles saudáveis (HCs) para elaborar os detalhes do procedimento. A FR é uma doença ocular hereditária grave caracterizada por visão noturna prejudicada e perda progressiva da visão ^3,4. A mutação genética é o principal fator de risco para RP. A morte de células fotorreceptoras de bastonetes e cones leva à perda da visão periférica e, finalmente, à cegueira em pacientes com RP. Estudos prévios de neuroimagem mostraram anormalidades estruturais e funcionais no córtex visual e na via visual de pacientes com FR5,6,7. Além disso, a imagem por tensor de difusão foi usada para investigar a integridade dos feixes de fibras da substância branca. Os pacientes com FR apresentaram coeficiente de difusão aparente, autovalor principal e autovalor ortogonal significativamente maiores, bem como anisotropia fracionada significativamente menor nos nervos ópticos, em relação aos HCs⁸.

Aqui, nosso objetivo foi a exploração de sincronizações intra e inter-regionais da atividade neuronal. Investigamos se os valores médios de ReHo e os valores médios de FC estavam correlacionados com variáveis clínicas em pacientes com FR. Nosso método pode permitir que os pesquisadores obtenham informações importantes sobre o mecanismo neural da perda de visão periférica em pacientes com RP.

Protocolo

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética médica do Hospital Renmin da Universidade de Wuhan. Todos os participantes preencheram um termo de consentimento por escrito.

1. Classificação e triagem dos participantes

1. Inscreva disciplinas RP e HCs intimamente pareadas em idade, sexo e educação.
2. Certifique-se de que todos os participantes atendam aos seguintes critérios: 1) capaz de ser escaneado com um scanner de ressonância magnética (por exemplo, sem marca-passos cardíacos ou dispositivos metálicos implantados); 2) sem claustrofobia; 3) sem doenças cardíacas, hipertensão ou doenças cerebrais.

2. Aquisição de dados de fMRI

NOTA: Um scanner de ressonância magnética de 3 T com bobina de cabeça de oito canais é usado neste protocolo.

1. Peça a cada participante para remover objetos de metal antes de entrar na sala do scanner de ressonância magnética após uma verificação final de segurança.
2. Instrua o participante a deitar-se na cama e certifique-se de que a linha orbitomeatal esteja perpendicular à cama. Em seguida, coloque almofadas de espuma na região temporal bilateral da cabeça para evitar o movimento da cabeça e forneça tampões para os ouvidos para reduzir o ruído do scanner.
3. Instrua o participante a deitar em repouso, manter os olhos fechados sem adormecer e não pensar em nada em particular durante o escaneamento.
4. Ajuste a posição da cabeça do participante através da luz de posicionamento. Certifique-se de que o cursor de posicionamento do eixo esteja paralelo ao canto lateral e que o cursor de posicionamento sagital coincida com a linha média da face. Em seguida, mova a cama para fazer com que o cursor de posicionamento do eixo fique 2 cm acima ou abaixo das sobrancelhas do participante.
5. Notifique o participante sobre o início da sessão de verificação. Usando o console de digitalização, inicie a varredura do localizador estrutural para determinar a posição da cabeça dos participantes no scanner e permitir o planejamento de varreduras estruturais e funcionais subsequentes.
6. Realize fMRI com as seguintes sequências e parâmetros.
   1. Realizar ressonância magnética tridimensional do volume cerebral (3D-BRAVO) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição (TR)/tempo de eco (TE) = 8,5 ms/3,3 ms; espessura = 1,0 mm; sem lacuna de interseção; matriz de aquisição = 256 x 256; campo de visão = 240 x 240 mm²; e ângulo de inversão = 12°.
   2. Obtenha imagens funcionais usando imagens ecoplanares gradientes dependentes do nível de oxigenação sanguínea (EPI-BOLD) com os seguintes parâmetros: TR/TE = 2.000 ms/25 ms; espessura = 3,0 mm; gap = 1,2 mm; matriz de aquisição = 256 x 256; campo de visão = 240 x 240 mm²; tamanho do voxel = 3,6 x 3,6 x 3,6 mm³; e 35 cortes axiais.
7. Fique de olho na condição do participante durante a varredura, instrua-o a se mover o mínimo possível e pare de escanear se o participante sentir algum desconforto.
8. Remova o participante do scanner e peça ao participante para se sentar cuidadosamente no final do experimento.

3. Pré-processamento de dados e preparação de software

NOTA: As imagens funcionais analisadas neste protocolo são pré-processadas pelo SPM8 e pela caixa de ferramentas para Processamento e Análise de Dados para Imagens Cerebrais (DPABI, http://rfmri.org/dpabi)⁹ com base no MATLAB 2013a. Execute as etapas de pré-processamento a seguir separadamente para cada sessão de fMRI.

1. Abra o software DPABI no terminal MATLAB clicando em dpabi, escolha DPARSF 4.3 Advanced Edition e importe a pasta "FunRaw" (Figura 1).
   NOTA: A pasta FunRaw contém o arquivo DICOM para cada participante.
2. Clique em FunRaw para importar os arquivos de varredura fMRI para o DPABI com um esquema de numeração consistente (por exemplo, "sub0001", "sub0002", etc.). Selecione o diretório de trabalho e os diretórios EPI e T1 iniciais e continue a selecionar todos os parâmetros desejados nas etapas 3.3 a 3.9 antes de clicar em Executar na seção 4.
3. Digite os parâmetros: Pontos de temporização = 240 e TR = 2 (Figura 2). Selecione EPI DICOM para NIFTI para converter as imagens funcionais do formato DICOM para NIFTI e remova os primeiros 10 volumes de cada imagem de função.
4. Marque as caixas para Tempo de corte e Realinhamento no software DPABI para corrigir os 230 volumes restantes de imagens dependentes do nível de oxigenação sanguínea funcional para efeitos de tempo de corte e movimento da cabeça corrigidos.
   NOTA: Para o movimento da cabeça, os dados dos participantes com movimento da cabeça >2 mm ou rotação >2° durante a varredura devem ser excluídos. Para a ordem das fatias, a sequência de números no vetor é a ordem de tempo de aquisição dessas camadas. O número da fatia selecionada é 40, a ordem da fatia é [1:2:39,2:2,40] e a fatia de referência é 39.
5. Selecione Normalizar por DARTEL com o software DPABI.
   NOTA: Ao selecionar esta opção, o software executará automaticamente a normalização espacial usando imagens estruturais individuais ponderadas em T1 registradas nos dados médios de fMRI. As imagens ponderadas em T1 alinhadas resultantes são segmentadas usando a caixa de ferramentas DARTEL para melhorar a precisão espacial durante a normalização dos dados de fMRI. Os dados normalizados (no espaço do Montreal Neurological Institute [MNI] 152) são recortados com uma resolução de 3 x 3 x 3 mm³.
6. Remova a tendência linear selecionando Detrend no software DPABI.
7. Marque a caixa Regressão de covariáveis incômodas e selecione os seguintes parâmetros: modelo de movimento da cabeça, sinal da substância branca, sinal médio global e sinal do líquido cefalorraquidiano.
8. Marque a caixa Scrubbing para remover os pontos de tempo incorretos devido ao movimento da cabeça no software DPABI.
9. Retenha os sinais entre 0.01–0.08 Hz marcando a caixa Filtro [0.01-0.08] no software DPABI para remover ruídos fisiológicos de alta frequência e desvios de baixa frequência.
   NOTA: Após a preparação dos dados, a análise ReHo e FC pode ser realizada.

4. Análise de ReHo e FC

1. Para o cálculo ReHo, abra o software DAPABI através do MATLAB e selecione 27 voxels no cluster. Clique com o botão esquerdo em ReHo e suavize [6*6*6] e selecione Executar.
   NOTA: O coeficiente de concordância de Kendall é atribuído a um determinado voxel calculando o coeficiente de concordância de Kendall de séries temporais de 27 voxels e seus vizinhos mais próximos. Para reduzir a influência das variações individuais nas comparações estatísticas entre os grupos, os mapas ReHo de cada voxel são transformados em z usando a transformação de r para z de Fisher. Os mapas z ReHo restantes são espacialmente suavizados usando um kernel gaussiano de 6 * 6 * 6 largura total na metade do máximo.
2. Para o cálculo FC, abra o software DAPABI através do MATLAB e defina as regiões cerebrais ReHo alteradas entre os dois grupos como regiões de interesse (ROIs). Clique em Conectividade funcional e defina o ROI (centralizando em x = 0, y = -69 e z = -3 com raio = 10 mm) e selecione Executar.
   NOTA: A análise de correlação do curso de tempo para cada participante é realizada entre a região esférica da semente e os voxels de todo o cérebro. Todos os mapas de FC são transformados em z pela transformação r-para-z de Fisher para reduzir a influência de variações individuais na comparação estatística entre os grupos. O raio das ROIs em torno das coordenadas deve ser de 10 mm (X = 0, Y = -69, Z = -3).

5. Análise estatística

1. Encontre as pastas chamadas ReHo e FC após processar os dados do arquivo relevante. Classifique os arquivos de zReHo.nii e zFC.nii, classificando-os em quatro subpastas: "RP-group-ReHo", "HC-group-ReHo", "RP-group-FC" e "HC-group-FC".
2. Abra o DPABI através do MATLAB para realizar um teste t de uma amostra.
   1. Clique com o botão esquerdo em Análise estatística e, em seguida, clique em teste t de uma amostra. Nomeie o resultado de saída como "one-sample-t-test-RP" e defina o diretório de saída.
   2. Clique com o botão esquerdo em Adicionar imagens de grupo e abra a subpasta "RP-group-ReHo".
   3. Na opção Arquivo de máscara , clique com o botão esquerdo para abrir o subarquivo "BrainMask-05-61*73*61" na pasta "máscara".
   4. Selecione Computação para executar o programa. Execute este mesmo procedimento para o grupo "teste t de uma amostra-HC".
      NOTA: O teste t de uma amostra é usado para analisar e exibir mapas ReHo médios de cada grupo no software DPABI.
3. Abra o DPABI através do MATLAB para realizar um teste t de duas amostras.
   1. Clique com o botão esquerdo em Análise estatística e selecione o teste t de duas amostras. Nomeie o resultado de saída como "two-sample-t-test-ReHo" e defina o diretório de saída.
   2. Clique com o botão esquerdo em Adicionar imagens de grupo e abra as subpastas "RP-group-ReHo" e "HC-group-ReHo".
   3. Na opção Arquivo de máscara , clique com o botão esquerdo para abrir o subarquivo "BrainMask-05-61*73*61" na pasta "máscara".
   4. Selecione Computação para executar o programa. Execute este mesmo procedimento para o "teste t de duas amostras FC". Clique em Análise estatística e correção de campo aleatório gaussiano (GRF) [bicaudal, nível de voxel (0,01) e nível de voxel (0,05)] e clique em Executar.
      NOTA: As diferenças entre os grupos de mapas zReHo e mapas zFC são comparadas por dois testes t de amostra. O GRF é usado para corrigir comparações múltiplas e covariáveis regredidas de idade e sexo com o software DPABI.
4. Use o software BrainNet Viewer (https://www.nitrc.org/projects/bnv/) para mostrar os resultados.
   1. Abra o BrainNet através do MATLAB e clique em Carregar arquivo. Para arquivos de superfície, clique em Procurar e selecione BrainMesh-ICBM152-smoothed.nv e, em seguida, clique em Ok; para arquivos de volume, selecione spm-T.nii (isso inclui resultados ReHo e FC) e clique em Ok.
5. Use software estatístico para processar os dados obtidos na etapa anterior.
   NOTA: O teste qui-quadrado é usado para comparações de sexo, enquanto os testes t de amostras independentes são usados para outras variáveis clínicas. As variáveis contínuas são representadas por médias e desvios-padrão.
6. Realize a análise do coeficiente de correlação de Pearson para identificar as relações entre os valores de zReHo e os valores de zFC de diferentes regiões do cérebro e dados de medições visuais usando software estatístico.
   1. Obtenha sinais de ROI dos valores zReHo e zFC em cada participante pelo software DPABI. Clique em Extrator de sinais de ROI e em Adicionar diretório com o arquivo ROI mask.nii.
      NOTA: Valores de p de <0,05 devem ser considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Em nosso estudo, 16 indivíduos RP e 14 controles saudáveis semelhantes em idade, sexo e educação foram submetidos a exames de ressonância magnética funcional em estado de repouso. Os métodos ReHo e FC foram usados para explorar a atividade neuronal intra e intersíncrona em indivíduos RP. Foram observadas diferenças significativas na AVC entre o olho direito (P < 0,001) e o olho esquerdo (P < 0,001), mas a diferença de sexo, idade ou peso entre os grupos não foi significativa....

Discussão

Este relatório descreve um protocolo para calcular os valores de ReHo e FC para os grupos RP e HC e mostrou valores de ReHo e FC significativamente diferentes entre os dois grupos. Notavelmente, uma etapa importante neste processo é a classificação e triagem de amostras antes do experimento. Quando aplicamos esse protocolo para nossa própria análise, todos os indivíduos com FR foram diagnosticados por dois oftalmologistas experientes. Excluímos pacientes com FR com outras doença...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BrainNet Viewer software	National Key Laboratory of Cognition Neuroscience and Learning, BNU	BrainNet Viwer 2013	BrainNet Viewer is a brain network visualization tool to visualize structural and functional connectivity patterns
DPABI software	Institute of Psychology, CAS, Beijing, China	DPABI 4.3	DPABI is a toolbox for data processing and analysis of brain imaging.
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	2013a	MATLAB is a high-level technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, data analysis, and numeric computation.
MRI scanner	GE Healthcare, Milwaukee	MRI 3.0
SPM software	Wellcome Centre for Human Neuroimaging, UCL	SPM8	SPM8 is a major update to the SPM software, containing substantial theoretical, algorithmic, structural and interface enhancements over previous versions.
SPSS	IBM, Chicago, IL, USA	SPSS version 20.0	SPSS software platform offers advanced statistical analysis, text analysis, open-source extensibility, integration with big data and seamless deployment into applications.